Β τεύχος 4ο κεφάλαιο Flashcards
Ποτέ και ποιοι ξεκίνησαν την Γενετική μηχανική; Με ποια εργαλεία; Και πως επεμβαίνουν στους άλλους οργανισμούς;
Από το 1953, που οι Watson και Crick πρότειναν το μοντέλο
της τρισδιάστατης δοµής του DNA, µέχρι σήµερα, η πρόοδος
της επιστήμης της Βιολογίας ήταν αλματώδης. Η απομόνωση
και χρήση πολυάριθμων ενζύμων έδωσαν στους ερευνητές τη
δυνατότητα «αναπαραγωγής» των διαδικασιών της αντιγραφής,
αντίστροφης µεταγραφής, µεταγραφής και µετάφρασης in vitro.
Ειδικότερα η αποµόνωση των περιοριστικών ενδονουκλεασών,
ενζύμων που κόβουν το DNA σε κομμάτια με συγκεκριμένη
αλληλουχία βάσεων, καθώς και ειδικών φορέων που µεταφέ-
ρουν DNA από κύτταρο σε κύτταρο, επέτρεψε την ανάπτυξη της
τεχνολογίας του ανασυνδυασµένου DNA και έδωσε στον άν-
θρωπο την ικανότητα όχι µόνο να ερευνά, αλλά να επεµβαίνει
και να τροποποιεί το γενετικό υλικό των οργανισμών. Η τεχνο-
λογία αυτή βρίσκει εφαρμογή στην παραγωγή σειράς προϊ-
όντων και τη δημιουργία φυτών και ζώων με «βελτιωμένες»
ιδιότητες, όπως θα παρουσιαστεί σε επόµενα κεφάλαια. Με την
ανάπτυξη της υψηλής αυτής τεχνολογίας, το γενετικό υλικό, το
DNA, που ήταν τόσο δύσκολο να µελετηθεί, έγινε «παιχνίδι»
στα ανθρώπινα χέρια.
Τι είναι το ανασυνδυασμένο DNA;
Σήμερα μπορούμε να κατασκευάζουμε στο δοκιμαστικό σω-
λήνα ένα «ανασυνδυασµένο» µόριο DNA, δηλαδή ένα τεχνητό
µόριο DNA, που περιέχει γονίδια από δύο ή και περισσότερους
οργανισµούς. To DNA αυτό µπορεί να µπει σε ένα βακτήριο
ή σε ένα ευκαρυωτικό κύτταρο. Τα γενετικά τροποποιηµένα
βακτήρια ή ευκαρυωτικά κύτταρα είναι ικανά να ζουν και να
αναπαράγονται µεταφέροντας στους απογόνους τους τις και-
νούργιες ιδιότητες.
Σε τι βοήθησε η γενετική μηχανική;
Οι τεχνικές µε τις οποίες ο άνθρωπος επεµβαίνει στο γενετικό
υλικό αποτελούν τη Γενετική Μηχανική. Η Γενετική Μηχανική
άνοιξε το δρόµο για νέες, εξαιρετικά ενδιαφέρουσες ερευνη-
τικές και παραγωγικές δυνατότητες, αλλά και για την επίτευξη
δύο θεμελιωδών στόχων του ανθρώπου:
α. την κατανόηση των μυστηρίων της ζωής και της εξέλιξης
πάνω στη Γη και,
β. τη βελτίωση της υγείας και του τρόπου διαβίωσής του.
Η βελτίωση αυτή επιτυγχάνεται με τις εφαρμογές της Γενε-
τικής Μηχανικής τόσο στην Ιατρική όσο και στη γεωργία
και την κτηνοτροφία.
Πώς ανασυνδυαζουμε ένα μόριο dna; Τι είναι ο φορέας κλωνοποίησης;
Η κατασκευή του ανασυνδυασμένου DNA. Για το σκο-
πό αυτό το ολικό DNA από έναν οργανισµό δότη απο-
μονώνεται, κόβεται ενζυματικά με ειδικά ένζυμα, τις πε-
ριοριστικές ενδονουκλεάσες, και ενώνεται µε ένα φορέα
κλωνοποίησης. Ο φορέας κλωνοποίησης είναι ένα µόριο
DNA, π.χ. πλασµίδιο ή DNA φάγων, το οποίο µπορεί να
αυτοδιπλασιάζεται ανεξάρτητα μέσα σε ένα κύτταρο-ξενι-
στή όπως ένα βακτήριο. To DNA που δηµιουργείται είναι
ανασυνδυασµένο.
Πώς γίνεται η μεταφορά του ανασυνδυασμένου dna στο βακτήριο; Τι είναι ο μετασχηματισμός;
Η µεταφορά του ανασυνδυασµένου µορίου DNA σε ένα
κύτταρο-ξενιστή. Η εισαγωγή του DNA σε βακτηριακό
κύτταρο-ξενιστή ονομάζεται µετασχηµατισµός.
Τι είναι ο κλώνος;
Ο όρος κλώνος αναφέρεται σε µια οµάδα πανοµοιό-
τυπων µορίων, κυττάρων ή οργανισµών. Ο όρος κλω-
νοποίηση αναφέρεται στην κατασκευή, κατά προτίµηση
µεγάλου αριθµού, πανοµοιότυπων µορίων, κυττάρων ή
οργανισµών.
Τι είναι οι περιοριστικές ενδονουκλεασες; ποιος είναι ο φυσικός τους ρόλος και ποια γνωρίζουμε εμείς;
θεµέλιο για τη δηµιουργία των γονιδιωµατικών βιβλιοθηκών.
Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες παράγονται από βακτήρια
και ο φυσιολογικός τους ρόλος είναι να τα προστατεύουν από
την εισβολή «ξένου» DNA. Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες
αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες 4-8 νουκλεοτιδίων στο δί-
κλωνο DNA. Μία από τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες που
χρησιµοποιείται ευρέως είναι η EcoRI που αποµονώθηκε από
το βακτήριο Escherichia coli (Εικόνα 4.2). Το ένζυμο αυτό όποτε
συναντά την αλληλουχία: 5’-G Α Α Τ Τ C-3’
3’-C Τ Τ A A G-5’ στο γονιδίωμα,
κόβει κάθε αλυσίδα µεταξύ του G και του Α (µε κατεύθυνση
5’ĺ3’) αφήνοντας μονόκλωνα άκρα από αζευγάρωτες βά-
σεις στα κοµµένα άκρα. Τα άκρα αυτά µπορούν να σχηµατί-
σουν δεσµούς υδρογόνου µε τις συµπληρωµατικές βάσεις
άλλων κομματιών DNA που έχουν κοπεί με το ίδιο ένζυμο.
Τι είναι ο φορέας κλωνοποίησης;
Οι πιο χαρακτηρι-
στικοί τύποι φορέων είναι τα πλασµίδια και το DNA φάγων.
Τα πλασµίδια που χρησιµοποιούνται ως φορείς κλωνοποίησης
έχουν τη συγκεκριµένη αλληλουχία µία µόνο φορά. Έτσι τα
πλασμίδια κόβονται από την EcoRI σε αυτή τη θέση και δημι-
ουργείται ένα γραµµικό µόριο DNA µε µονόκλωνα άκρα. Τα
δύο είδη DNA, του πλασµιδίου και του οργανισµού, αναµιγνύ-
ονται και, επειδή έχουν συµπληρωµατικά άκρα, ενώνονται µε-
ταξύ τους με τη μεσολάβηση ενός ενζύμου, της DNA δεσμάσης.
Πώς μετασχηματίζεται ένας ξενιστής; Τι είναι η κλωνοποίηση και η γονιδιωματικη βιβλιοθήκη;
Για να µπει ένα πλασµίδιο µέσα στο βακτήριο, τα τοιχώµατα του
βακτηρίου γίνονται παροδικά διαπερατά σε µακροµόρια, µετά
από κατάλληλη κατεργασία (µετασχηµατισµός).
Η επιλογή των βακτηρίων που δέχτηκαν ανασυνδυασμένο
πλασμίδιο στηρίζεται στην ικανότητα ανάπτυξής τους παρουσία
αντιβιοτικού, επειδή το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο περιέχει
ένα γονίδιο που τους προσδίδει ανθεκτικότητα στο συγκεκρι-
µένο αντιβιοτικό. Κάθε βακτήριο που προσέλαβε ένα ανασυν-
δυασμένο πλασμίδιο πολλαπλασιάζεται και δίνει έναν κλώνο.
Η διαδικασία δημιουργίας κλώνων βακτηρίων ονομάζεται
κλωνοποίηση. Το σύνολο των βακτηριακών κλώνων περιέχει
το συνολικό DNA του οργανισµού δότη και αποτελεί µία γονι-
διωµατική βιβλιοθήκη
Που χρησιμεύουν οι ανιχνευτές; Γιατί το πλασμίδιο είναι κατάλληλος φορέας κλωνοποίησης και γιατί χρησιμοποιείται άλλες φορές ο βακτηριοφαγος λ;
Για να γίνει επιλογή ενός
κλώνου που έχει ένα επιθυµητό γονίδιο χρησιµοποιούνται ειδι-
κοί ανιχνευτές, µε µια διαδικασία που θα αναλυθεί παρακάτω.
Η κλωνοποίηση σε πλασμίδια είναι σχετικά απλή και γι’ αυτό
τα πλασµίδια αποτελούν το συνηθέστερο φορέα κλωνοποίη-
σης για οργανισµούς µε µικρό γονιδίωµα. Ένας άλλος φορέας
που χρησιµοποιείται ευρύτατα γιατί µπορεί να ενσωµατώσει μεγαλύτερα κομμάτια ξένου DNA, είναι ο βακτηριοφάγος λ. Η
στρατηγική της κλωνοποίησης είναι η ίδια µε αυτήν που χρησι-
µοποιείται και στα πλασµίδια
Τι είναι η cDNA βιβλιοθήκες; Από τι αποτελούνται και πως φτιάχνονται
Αν θέλουµε να κλωνοποιήσουµε µόνο τα γονίδια που
εκφράζονται σε συγκεκριμένα κύτταρα, τότε κατασκευάζουμε
τις cDNA βιβλιοθήκες. Οι cDNA βιβλιοθήκες περιέχουν αντί-
γραφα των mRNA όλων των γονιδίων που εκφράζονται στα
κύτταρα αυτά και έχουν το πλεονέκτηµα αποµόνωσης µόνο των
αλληλουχιών των γονιδίων που μεταφράζονται σε αμινοξέα,
δηλαδή των εξωνίων.
Για να κατασκευαστεί µία cDNA βιβλιοθήκη, αποµονώνεται
το ολικό «ώριμο» mRNA από κύτταρα που εκφράζουν το συ-
γκεκριμένο γονίδιο. To mRNA χρησιμοποιείται σαν καλούπι
για τη σύνθεση μιας συμπληρωματικής αλυσίδας DNA (cDNA:
complementary DNA). Η σύνθεση του cDNA γίνεται από το
ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση. Παράγονται έτσι υβριδικά
μόρια cDNA-mRNA. To mRNA διασπάται με κατάλληλες χημι-
κές ουσίες ή αποδιατάσσεται µε θέρµανση και τα cDNA χρη-
σιµεύουν σαν καλούπι για τη σύνθεση µιας συµπληρωµατικής
αλυσίδας DNA. Το αποτέλεσµα είναι η δηµιουργία δίκλωνων
µορίων DNA. Τα δίκλωνα µόρια DNA εισάγονται σε πλασµίδια
ή βακτηριοφάγους και κλωνοποιούνται µε τη διαδικασία που
αναφέρθηκε προηγουµένως. Με αυτό τον τρόπο δίνουν τη δυ-
νατότητα σύνθεσης της πρωτεΐνης ενός συγκεκριµένου γονιδίου
στο κύτταρο-ξενιστή.
Τι είναι η αποδιαταξη;
Αν επιδράσουµε στο DNA που
αποµονώθηκε µε κατάλληλες χηµικές ουσίες ή αυξήσουµε τη
θερμοκρασία τότε σπάζουν οι δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των
δύο συµπληρωµατικών αλυσίδων και οι δύο αλυσίδες αποχω-
ρίζονται η μία από την άλλη. Η διαδικασία αυτή λέγεται απο-
διάταξη.Οι δύο µονόκλωνες συµπληρωµατικές αλυσίδες σε
κατάλληλες συνθήκες µπορούν να επανασυνδεθούν.
Τι είναι η υβριδοποίηση; Που εξυπηρετεί στις DNA cDNA βιβλιοθήκες;
Η υβριδοποίηση των νουκλεϊκών οξέων
χρησιµοποιείται για την ανίχνευση κλώνων
γονιδιωµατικής ή cDNA βιβλιοθήκης. Οι δύο µονόκλωνες συµπληρωµατικές αλυσίδες,μετά από αποδιαταξη, σε
κατάλληλες συνθήκες µπορούν να επανασυνδεθούν. Στην ιδιό-
τητα αυτή στηρίζεται η διαδικασία της υβριδοποίησης που είναι
η σύνδεση µονόκλωνων συµπληρωµατικών αλυσίδων DNA ή
συμπληρωματικών DNA-RNA. Η υβριδοποίηση είναι µια πολύ
σηµαντική ιδιότητα του DNA που µας δίνει τη δυνατότητα αν
έχουµε ένα γνωστό µόριο DNA, να το χρησιµοποιήσουµε ως
ανιχνευτή για τον εντοπισµό του συµπληρωµατικού του όταν το
τελευταίο βρίσκεται μαζί με χιλιάδες άλλα κομμάτια.
Μια γονιδιωµατική βιβλιοθήκη περιέχει έναν τεράστιο αριθµό
από κλωνοποιηµένα κοµµάτια χρωµοσωµικού DNA, τα οποία
έχουν παραχθεί µε δράση κάποιας περιοριστικής ενδονουκλε-
άσης. Ορισµένα από τα κοµµάτια αυτά περιέχουν ολόκληρα
γονίδια, άλλα περιέχουν κοµµάτια γονιδίων και άλλα τµήµα-
τα DNA που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Έτσι πρέπει µέσα από όλα αυτά τα κοµµάτια να εντοπίσουµε αυτό που θέλουµε
να μελετήσουμε. Η τεχνική που χρησιμοποιείται συνήθως πε-
ριλαµβάνει τη χρήση ιχνηθετηµένων ανιχνευτών µορίων DNA
ή RNA που περιέχουν αλληλουχίες συμπληρωματικές προς το
κλωνοποιηµένο DNA. Οι ανιχνευτές αναµειγνύονται µε το DNA
της βιβλιοθήκης (το οποίο έχει αποδιαταχθεί) και υβριδοποι-
ούν µόνο το συµπληρωµατικό τους DNA.
Τι είναι η PCR σε τί χρησιμεύει για την έρευνα; Που εφαρμόζεται;
Η κατασκευή βιβλιοθηκών μας δίνει τη δυνατότητα να απομο-
νώσουµε το βακτηριακό κλώνο που περιέχει το επιθυµητό γονίδιο. Στη συνέχεια πολλαπλασιάζονται τα βακτήρια του κλώνου
και δηµιουργούνται πολλά αντίγραφα του γονιδίου που περιέ-
χει. Η δημιουργία πολλών αντιγράφων είναι απαραίτητη προ-
ϋπόθεση τόσο για τη μελέτη του συγκεκριμένου γονιδίου όσο
και για την παραγωγή της πρωτεΐνης που αυτό κωδικοποιεί.
Η μέθοδος αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR:
Polymerase Chain Reaction) μας επιτρέπει να αντιγράψουμε
επιλεκτικά, εκατοµµύρια φορές, ειδικές αλληλουχίες DNA από
ένα σύνθετο μείγμα μορίων DNA, χωρίς τη μεσολάβηση ζωντα-
νού κυττάρου (Εικόνα 4.6). Η τεχνική αυτή που άρχισε να εφαρ-
μόζεται ευρέως από το 1985 έχει αυξήσει την ευαισθησία των
γενετικών αναλύσεων και έχει πολλές πρακτικές εφαρµογές.
Για παράδειγµα χρησιµοποιείται στην Ιατρική για τη διάγνωση
ασθενειών όπως του AIDS, στην εγκληµατολογία για τη διαλεύ-
κανση υποθέσεων και στη µελέτη DNA από απολιθώµατα.
