3.2 TÉCNICAS DE CORTE DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA Flashcards
¿Qué requiere?
Para observar las preparaciones a microscopía electrónica es necesario un espesor de corte ultrafino, debido a la escasa capacidad de penetración del haz de electrones. Obtener estos cortes es complejo y requiere de la técnica siguiente:
Procedimiento
1) Emplazamiento del ultramicrotomo. Debe estar situado donde no existan vibraciones, temperatura constante y no se formen movimientos de aire. Por ello, debe colocarse en una mesa antivibratoria y protegido por una mampara.
2) Preparación del bloque. El tejido permanecerá incluido en un cilindro de plástico. La muestra debe ser pequeña, por lo que es imprescindible tallar el cilindro en forma de pirámide truncada. La superficie tallada no puede tener más de 1 mm2 de metracrilato y 0’5 mm2 en epoxirresina, de lo contrario el corte saldrá vibrado.
3) Preparación de la cuchilla. Antes de fijar la cuchilla al soporte debe colocarse sobre ella un pequeño baño de flotación para recoger los cortes. Se trata de una pequeña balsa que se coloca sobre el filo de la cuchilla, junto a su cara interna. El líquido que contiene es agua acetonada al 5-10% para inclusión en epoxirresina o cloruro de bario 0’5 M para bloque de metacrilato.
4) Orientación de la cuchilla. Con resina epoen la cuchilla debe estar casi perpendicular al plano de corte. Con metacrilato requiere mayor inclinación.
5) Obtención de cortes semifinos. Se trata de cortes control de entre 0’5 y 1 micras que sirven para seleccionar la zona que se pretende observar en el corte ultrafino, tras su tinción o bien microscopía de contraste de fase. Se obtienen de forma análoga a los cortes ultrafinos.
6) Realización del corte ultrafino. Deben tener un espesor entre 30 y 90 nm (nanómetro). Una vez movilizada la cuchilla para situarla en la zona de filo virgen y regulado el espesor de corte, se procede a conectar el movimiento del brazo. Se obtiene así una cinta de cortes que flotará en el pocillo.
7) Selección de los cortes ultrafinos. Se realiza mediante un sistema basado en el fenómeno de interferencia de ondas lumínicas reflejadas por el corte y la superficie del líquido de flotación. Al ser el corte más delgado que la longitud de onda de la luz que lo atraviesa, puede generar fenómenos de interferencia entre los rayos reflejados por la superficie del líquido de flotación. Así, al iluminar un corte con luz blanca, se producen interferencias entre los rayos que refleja el tejido y el reflejado por la superficie del líquido de flotación. Por esto, aparece una gama de colores relacionados con el grosor del corte. Los cortes buenos son los grises y de color plata.
8) Extensión de los cortes. Depende del medio de inclusión utilizado. Si es en metacrilato se acerca al pocillo un papel de filtro humedecido en benceno o cloroformo. Si es en epoxirresina, se realiza utilizando microinstrumentos; el éxito de la operación depende de la habilidad del técnico.
9) Montaje de los cortes. Se realiza sobre una rejilla con un baño electroquímico metálico de unas dimensiones de 3 x 2’3 mm. Es un entretejido de hilos de cobre a 50 micras de diámetro entre los que quedan espacios de 150 micras.
La técnica de montaje es semejante a la de microscopía óptica, el corte se adhiere a la rejilla por fuerzas de tensión superficial y se deja secar para su posterior coloración.
