3. TÉCNICAS DE CORTE Flashcards
3.1 TÉCNICAS DE CORTE DE MICROSCOPÍA ÓPTICA
Antes de empezar a cortar hay que tener preparado todo el material que se vaya a emplear, y todos los aparatos necesarios deben estar conectado y en las condiciones adecuadas para su uso. Hay que preparar los portaobjetos, lápices de grafito, agujas histológicas, etc., conectar las placas de frío y enchufar el baño de flotación a una temperatura entre 45-50ºC.
La técnica de corte constará de:
1) Retallado y enfriamiento. Consiste en eliminar el exceso de parafina que existe en la periferia de la muestra, para de esta forma disminuir la superficie de contacto con la cuchilla y, por ende, la resistencia al corte. Este procedimiento se debe realizar con un cuchillo de resección. Antes de colocar el bloque sobre el micrótomo se debe enfriar la muestra a 5-10 ºC. De este modo, se obtiene la consistencia óptima de la parafina para el corte. El enfriamiento se llevará a cabo en cámara frigorífica o placa de frío, nunca en un congelador.
2) Orientación de la cuchilla. Existen cuatro ángulos de control de la incidencia del bloque sobre la cuchilla:
a. Ángulo de inclinación (I). Es el ángulo que forma la cara inferior de la cuchilla y el plano del bloque. Indica el ángulo con el que la cuchilla incide sobre el bloque. Debe estar comprendido entre 10 y 15º. Un ángulo mayor de 15º produce ondulaciones en la superficie del bloque y cortes de grosor irregular. Un ángulo menor de 10º, el filo no incide sobre la superficie, y obtenemos cortes discontinuos y de gran espesor.
b. Ángulo libre (L). Es el formado entre el plano de corte del bloque y el de la cara inferior del filo de la cuchilla. Debe ser entre 5 y 8º.
c. Ángulo de corte (C). Es el formado entre el plano de corte del bloque y el que pasa por la cara superior del filo de la cuchilla. Debe ser de 60º.
d. Ángulo de arrastre (A). Es complementario al ángulo de corte, esto es, el formado entre la perpendicular al plano de corte del bloque y el que pasa por la cara superior del filo de la cuchilla.
De todos estos, el más importante es el ángulo de inclinación, que es el que regulamos en el portacuchillas.
3) Fijación del bloque al portabloques. Colocar el bloque retallado sobre el portabloques y orientarlo de manera que quede paralelo al filo de la cuchilla. Quitar el freno y hacer descender el brazo del micrótomo hasta que la superficie del bloque entre en contacto con la cara interna de la cuchilla de debastado. Comprobar que ambos planos estén perfectamente paralelos.
4) Colocación de la cuchilla y debastado. El debastado consiste en eliminar las capas de parafina situadas sobre el tejido. Se coloca la cuchilla que va a emplearse para el debastado, y se seleccionan avances de 20-25 micras de espesor. Hacer cortes hasta que se obtenga una sección completa de la muestra.
5) Selección del espesor del corte. Se cambia la zona de corte de la cuchilla o se sustituye la de debastado por una nueva y seleccionamos el grosor de corte. Éste va a estar en función de la pieza a cortar. El grosor estándar está en torno a 5 micras. No se pueden hacer cortes de un grosor mayor a 20 micras, pues los cortes se arrollan irreversible. Si se requieren más gruesos incluir en celoidina.
6) Realización de los cortes. Se realizan mediante un movimiento rítmico de la manivela, o del motor. La velocidad de giro estará en función de la dureza de la muestra, de modo que cuanto más duro es el tejido mayor será la velocidad empleada.
7) Estirado de los cortes y confección de las preparaciones. Cuando se hayan obtenido los cortes que se considere conveniente, dejamos de mover el volante, colocamos el protector de la cuchilla y recogemos la cinta de cortes con un pincel fino o aguja de disección.
Pasamos los cortes al baño de flotación con agua a 45-50ºC con un chorro de alcohol. Luego, con ayuda de dos agujas de disección, separamos uno o más cortes de la cinta y pasamos a capturarlos con un portaobjetos, sumergiéndolo en el agua y sacando la muestra sobre el mismo. Se utilizan los soportes comerciales.Para favorecer la adhesión de los tejidos al portabloques se necesita impregnar éstos con sustancias adhesivas que eviten que se desprendan los cortes. Estas soluciones adherentes son la albúmina glicerinada de Mayer, la gelatina y las resinas.
8) Secado. Como paso previo al proceso de coloración, las preparaciones han de secarse para evitar desprendimiento. Lo llevamos a cabo en una estufa de Pasteur u horno Poupinelle mediante una desecación rápida, intermedia o lenta. Colocamos el portaobjetos en una placa calefactora, logrando que el agua se evapore, la parafina se reblandezca por efecto de la temperatura, y favoreciendo así la adhesión de la muestra al cristal.
3.1.2 Técnicas de corte de muestras incluidas en celoidina
La inclusión en celoidina no es una técnica rutinaria en el laboratorio de anatomía patológica. Su uso está restringido a trabajos con tejido nervioso o en muestras frágiles y duras o muy heterogéneas. Los bloques elaborados con este material, que son de gran dureza, permiten obtener cortes de espesor medio de 15 micras, nunca inferior a 10 micras.
El procedimiento de corte es análogo al expuesto en el apartado anterior, aunque debemos tener en cuenta algunas peculiaridades:
Los bloques con la muestra deben mantenerse sumergidos en alcohol etílico al 70% para que adquieran la dureza necesaria.
El bloque ha de pegarse a un portabloques de madera o vulcanita, ya que los comerciales utilizados en parafina no sirven. Para pegar el bloque se cubre el portabloques con celoidina al 8%, se mantiene haciendo presión durante unos minutos, se deja secar al aire y se sumerge en etanol 70º durante 30 minutos.
Realizar un tallado.
El corte del bloque se realizará en un micrótomo tipo Leitz. Dada la dureza del material, la cuchilla deberá orientarse oblicua, hasta unos 160º respecto al plano de corte del bloque.
Se procede al debastado y, tras este, se inicia el corte. Durante éste se pincelará tanto la cuchilla como la superficie del bloque.
¿Cómo serán los cortes obtenidos?
Los cortes obtenidos no serán seriados, sino que se obtendrán de uno a uno. Dichos cortes se estirarán sobre la cuchilla, donde quedan retenidos, con un pincel mojado en alcohol de 70º. A continuación se harán flotar en un baño de alcohol etílico al 70% y se reservan.
