2 - Régulation expression et niveau de protéines Flashcards
Régulation transcriptionnelle : quoi et comment ?
1 - Expression de gène ou non en réponse à un signal inducteur.
Utilisation de promoteurs inductibles (par exemple par tétracycline, IPTG, lumière, acétaldéhyde gazeux).
Méthodes de régulation post-transcriptionnelle : quoi et comment ?
Contrôle le niveau de production de protéines en régulant la stabilité de l’ARNm ou l’initiation de la traduction en réponse à une molécule.
Utilisation d’ARN régulateur non codant tel que les TIGRs, riborégulateurs, ribozymes, ARN interférent.
Méthodes de régulation structurale : quoi et comment ?
Réguler la signalisation et le flux de la voie métabolique en contrôlant la localisation et la stœchiométrie des composants de la voie et des produits intermédiaires.
Utilisation de scaffold.
Étiquette de dégradation (diminue durée de vie)
Scaffold protéique : régulation structurale
1 - C’est un échafaudage protéique permettant la colocalisation d’enzymes recombinantes. Evite accumulation de produits intermédiaires, ce qui pourrait être toxique pour le châssis.
2 - Permet d’optimiser la stoechiométrie.
- On utilise un scaffold qui est un support synthétique contenant des domaines d’interactions.
- Pour relier les domaines, on utilise des linkers sérine-glycine (ne gênant pas le fonctionnement).
- On modifie les enzymes afin qu’elles soient en fusion avec un ligand reconnaissant les domaines du scaffold.
- Le scaffold est sur le même vecteur que les gènes des enzymes produites mais pas le même promoteur.
TIGRs : régulation post-transcriptionnelle
Tunable Intergenic Regions.
Permet de réguler simultanément différents gènes d’un même opéron en jouant au niveau de la post-transcription.
On insère des séquences dans les régions intergéniques de l’opéron.
Selon la nature des régions intergéniques insérées entre les régions codantes, la production des protéine sera différente :
- exploitation des structures secondaires des ARNm
- utiliser les sites sensibles aux RNases des ARNm
On peut provoquer l’arrêt de la transcription, changer la stabilité de l’ARNm et empêcher l’initiation à la traduction.
Spectrométrie de masse
(SRM) Selecting Reaction Monitoring ou Surveillance de réaction sélectionnée en spectrométrie de masse en tandem
Pour regarder les niveaux d’expression des enzymes afin de déterminer lesquelles sont produites à un faible niveau et ainsi équilibrer l’expression des gènes.
Lumière pour réguler la transcription : première méthode
Le phytochrome des cyanobactéries est constitué :
- d’un capteur (photorécepteur) lié à la membrane répondant à la lumière.
- d’un domaine tyrosine kinase fusionné avec le photorécepteur
- d’un régulateur de réponse intracellulaire (EnvZ-OmpR) qui une action sur expression des gènes.
Sans lumière : autophosphorylation du domaine tyrosine kinase et donc phosphorylation du régulateur qui va se fixer au promoteur pour induire la transcription du gène.
Avec lumière : inhibition de l’autophosphorylation et donc absence d’expression du gène.
Application :
- biolumière (expression de GFP sans lumière)
- photographie bactérienne (expression de LacZ sans lumière. Addition de S-Gal qui est dégradé par LacZ en composé coloré donc zones non éclairées coloré en noir).
Lumière pour réguler la transcription : deuxième méthode
- Petites molécules mettent en cage des molécules qui induisent transcription
- Irradiation au UV, libération des molécules et transcription.
Quorum Sensing naturel pour réguler la transcription
Permet de synchroniser l’expression des gènes dans toute une population
- production de HSL par LuxI synthase
- HSL sort de la bactérie
- si population bactérienne augmente, il y’a augmentation de HSL à l’extérieur et à un moment diffusion à l’intérieur des bactéries
- HSL se fixe alors à LuxR
- le complexe LuxR/HSL permet la transcription de LuxR, de LuxI et d’autres gènes afin de synchroniser les comportements des bactéries proches (d’une même colonie)
- cela ne permet pas de synchroniser des bactéries à une grande distance
Quorum Sensing synthétique pour réguler la transcription
- expression constante d’une protéine (ArsR) qui inhibe le promoteur de LuxR
- l’addition d’une molécule spécifique (arsénique par exemple) inhibe ArsR et donc stimule la production de LuxR
- LuxI est exprimé constamment aussi donc présence de HSL
- HSL se complexe avec LuxR pour se fixer sur un opérateur qui permet la transcription de LuxI, de ndh, de aiiA et de sfGFP.
- ndh : permet la formation de H2O2 (gaz) qui diffuse jusqu’au bactérie à distance et permet une synchronisation entre colonies en induisant la transcription de LuxI, de ndh, de aiiA et de sfGFP.
- aiiA : inactive HSL générant ainsi des oscillations
- sfGFP : rapporteur lumineux. Plus il y’a d’arsénique, plus la période d’oscillation est grande.
Répressilateur : régulation transcriptionnel et structurale
Horloge synthétique.
- On a 3 gènes qui codent pour des represseurs transcriptionnels. Chaque répresseur inhibe l’expression du gène suivant. Le troisième régule le premier gène par une boucle de rétrocontrôle négatif. Cela permet l’expression périodique de ces gènes.
- Il y’a deux opérons :
- un avec les 3 gènes : Tetr –I lambda Cl –I LacI
- un avec un rapporteur : TetR –I GFP
- C’est le rétrocontrôle négatif qui induit les oscillations dans le temps de l’expression de chacun des constituants.
- Le système peut converger vers un état d’équilibre stable ou vers un état d’équilibre qui peut devenir instable, conduisant à des oscillations.
Afin d’avoir des oscillations régulières de GFP, il faut que la demi-vie des protéines soit équivalente à la demi vie des ARNm. On joue sur :
- stabilité des répresseurs en ajoutant étiquette de dégradation tag ssrA pour dégradation par système Clp (protéasome)
- diminution durée de vie GFP
- pas de fuite donc promoteurs forts et répression transcriptionnelle forte.
Synchronisation de toutes les bactéries avec IPTG qui inhibe répresseur LacI, l’empêchant de se lier au promoteur pLac.
Répressilateur transmissible mais perte de synchronisation au cours du temps (perte de phase et d’amplitude).
Riborégulateur : régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle
Quoi ?
Intérêt ?
Différents blocages ?
Constitués de domaines non codants de l’ARN et se lient spécifiquement à des métabolites permettant d’arrêter la transcription ou la traduction par induction d’un réarrangement de l’ARN en structure secondaire.
Répondre par exemple à de petits composés organiques dont on veut détecter la présence
Blocage transcription : Quand il y’a la molécule signal, on a formation d’une tige poly U qui va empêcher la polymérase d’achever la transcription
Blocage traduction : piéger la partie correspondante au RBS
Cinétique riborégulateur
Fonctionnement ?
Différents riborégulateurs ?
La cinétique est liée à :
- la concentration des métabolites dans l’environnement du riborégulateurs
- l’architecture du riborégulateur
Les riborégulateurs simples : un aptamère et un métabolite (variation de 81 fois de la concentration pour passer à une régulation de 10% à 90% pour moduler l’expression du gène)
Les riborégulateurs complexes : riborégulateurs avec deux sites de fixation (variation de 9 fois )
Les riborégulateurs en tandem : avec au moins 2 aptamères qui fonctionnent de manière coopérative, on peut combiner bloquage transcription et traduction.
On peut moduler ainsi la réponse au signal selon le type de riborégulateur et leur structure.
