1B - Assemblage

Question 1

Assemblage

Answer 1

Processus que l’on va mettre en oeuvre pour associer 2 ou plusieurs biobriques ensembles

Question 2

Assemblage fonctionnel

Answer 2

• 2 parties biologiques permettant un couplage fonctionnel et une activité prédictible.
• faut développer des méthodes ne nécessitant pas la coupure par des enzymes de restriction pour éliminer les séquences néfastes (cicatrices) pour l’activité fonctionnelle.

Question 3

TAR

Answer 3

Recombinaison associé à la transformation.

Utilisé pour construire des chromosomes artificiels grâce à des voies présentes dans différents organismes.

• Fragments d’ADN génomique mélangés avec excès de vecteur de clonage TAR
• Vecteur contient deux séquences spécifiques du gène d’intérêt
• Vecteur contient un locus centromérique et marqueur de sélection
• Intégration de l’ADN génomique et vecteurs dans sphéroplaste de levure
• Quand on a des levures où il y’a le gène d’intérêt et le vecteur, il y’a la recombinaison. Formation d’un ADN circulaire capable de se propager dans la cellule.

Question 4

Méthode enzymatique d’assemblage in-vitro

Answer 4

Assemblage isotherme d’ADN

Partir de deux fragments pour avoir un seul fragment de grande taille dans une réaction isotherme en une étape.

• A 50°C, exonucléase T5 retire nucléotides en 5’ de l’ADN double brin. Etant thermolabile, l’exonucléase T5 est inactivé à un moment donné.
• Les deux fragments d’ADN, ayant des séquences terminales complémentaires en 3’, s’apparient.
• L’ADN polymériase Fusion remplit les vides.
• La ligase d’ADN Taq scelle les entailles covalemment par ligation.
• Obtention d’un seul fragment d’ADN.

Question 5

PGASO

Answer 5

Promoter-based Gene Assembly and Simultaneous Overexpression

Méthode qui utilise des oligonucléotides chevauchants pour recombiner les cassettes de gènes avec des promoteurs individuels.

• On a plusieurs cassettes constituées chacune de :
  
  • un promoteur indépendant
  • une région codante
  • un terminateur
  • un fragment de séquence homologue au promoteur
    suivant
• On met les cassettes dans un châssis et elles s’assemblent ensemble dans un ordre déterminé grâce aux séquences homologues.
• L’intégration se fait dans le génome de l’hôte à un endroit spécifique par recombinaison via une séquence homologue au début de la première cassette et une à la fin de la dernière cassette.

Question 6

Avantages PGASO

Answer 6

• on peut mettre plusieurs gènes dans le châssis qui nous intéresse en une seule étape
• on peut mettre les promoteurs dans un ordre prédéterminé sans séquences linkers
• chaque cassette a son propre promoteur, ce qui permet d’ajuster son niveau d’expression
• PGASO peut être appliqué à un hôte qui ne peut pas faire de la recombinaison homologue.