2-Observations microscopiques des microorganismes Flashcards
Quels sont les 2 grands types de microscopes?
Photoniques et électroniques
Quel est l’autre nom pour les microscopes photoniques?
Microscopes optiques
Quelle est la différence majeure entre un microscope électronique et un microscope photonique?
Électronique : utilise les électrons
Photonique : utilise les photons
Quel est le grossissement maximal d’un microscope photonique?
x3000
Permet d’observer des microorganismes relativement grands
Quelles sont les 3 composantes d’un microscope photonique?
- Condensateur : modifie les faisceaux lumineux (entre la source lumineuse et l’échantillon)
- Objectif : agrandit l’image
- Oculaire : agrandit l’image une deuxième fois
Quels sont les 2 facteurs limitants d’observation au microscope photonique?
- Limite de résolution
- Contraste : capacité de distinguer une structure de son environnement
Quelle est la formule pour calculer la limite de résolution?
LR=λ/(2η sinθ )
λ : longueur d’onde
η : indice de réfraction du milieu
θ : ½ angle du cône de lumière entrant dans l’objectif
η sinθ (Ouverture numérique NA) indiqué sur l’objectif
Quels sont les facteurs sur lesquels on peut intervenir pour diminuer la limite de résolution? (3)
- Longueur d’onde λ
Verre opaque aux UV, mais possibilité d’installer du quartz (Coûteux) et UV dangereux pour les yeux - Indice de réfraction du milieu η
Huile à immersion (η = 1,56) diminue la déviation de la lumière et évite changement de milieu verre-air-verre (Utilisée pour les objectifs à fort grossissement : 60-100x) - ½ angle du cône de lumière entrant dans l’objectif θ
Nommez 5 types de microscopes photoniques
- Microscope à fond clair
- Microscope à fond noir
- Microscope à contraste de phase
- Microscope à contraste d’interférence différentielle
- Microscope à (épi)fluorescence
Que signifie une préparation à l’état frais et que permet-elle d’observer sous un microscope?
Cellules vivantes non transformées (pas de colorations, etc.)
Permet d’observer :
- Morphologie
- Motilité (déplacement) chez les protozoaires (pas chez les bactéries)
- Axe de division cellulaire (protozoaires)
- Corps d’inclusion cytoplasmiques chez les microorganismes de grande taille
Quel est l’inconvénient d’utiliser une préparation à l’état frais?
Diminution du contraste
Vrai ou faux
Les colorants tuent systématiquement la cellule
Faux
Peu de colorants sont vitaux, mais certains le sont
Comment agissent les colorants lors d’une coloration? (2 possibilités)
Agissent selon la charge +/- (majorité des microorganismes sont -) ou hydrophobicité
Qu’est ce qu’une coloration simple? Nommez un exemple.
Utilisation d’un seul colorant
Ex : Bleu de méthylène (+) se lie aux microorganismes (-)
Nommez 2 exemples de coloration différentielle.
Coloration de Gram et Alcoolo-acido-résistance (AAR)
Quelles sont les 4 étapes d’une coloration de Gram et quel va être le résultat à chaque étape?
- Ajout de violet de cristal (tout est violet)
- Ajout d’iode (mordant : fixe le violet de cristal s’il y a eu interaction)
- Ajout d’alcool (Décolorant : perte du violet chez les Gram-)
- Ajout de safranine (Contre-colorant : Gram + violet, Gram- rouge)
Qu’est ce que l’AAR?
Alcoolo-acido-résistance
Identifie les mycobactéries en retenant le carbol-fuchsine sur l’acide mycolique
Quelles structures peut-on observer avec une coloration différentielle?
- Endospores : organes de résistance
- Capsule : protège contre les infections
- Flagelle : motilité (taille inférieure à la limite de résolution classique)
- Corps d’inclusion : structure à l’intérieur du cytoplasme, réserve de C, N, P ou S
Comment apparaît l’image avec un microscope à fond noir?
Structures claires sur fond noir
Quelle est la différence matérielle entre un microscope à fond clair et un microscope à fond noir?
condensateur
- Cône de Abbe + miroirs crée un éclairage oblique
- Visualisation des rayons déviés (s’il n’y a rien : image noire)
Citez 2 avantages à observer avec un microscope à fond noir plutôt qu’avec un microscope à fond clair.
- Permet de visualiser les structures sans coloration ni fixation (cellules vivantes)
- Permet de voir les noyaux
Qui a inventé le microscope à contraste de phase?
Zernike
Comment fonctionne un microscope à contraste de phase?
Anneaux de phase (mise en phase de la lumière incidente)
Réfraction lumière par structure cellulaire = changement phase lumière = Changement intensité
Microscope traduit changements de phase par des changements d’intensité lumineuse
Comment apparaît l’image avec un microscope à contraste de phase?
Images sombres sur fond clair et formation d’un halo autour des cellules
Qui a inventé le microscope à contraste d’interférence différentielle?
Normaski
Comment fonctionne un microscope à contraste d’interférence différentielle?
Modification de la polarisation selon la réfraction
Système de lentilles polarisantes contrôlées par informatique
Qu’est ce que la polarisation?
Orientation des oscillations lumineuses
Comment apparaît l’image avec un microscope à contraste d’interférence différentielle?
Même visuel que le contraste de phase, mais sans halo et en pseudo 3D
Quel est le problème avec l’utilisation d’un microscope à contraste d’interférence différentielle?
Préparations doivent être transparentes
Quels types de microscopes regroupe un microscope moyen de gamme? Comment le faire passer d’un type de microscopie à l’autre?
Regroupe fond clair, fond noir et contraste de phase dans le même instrument
Condensateur mobile pour passer d’un type de microscope à l’autre
Comment fonctionne un microscope à (épi)fluorescence?
- Colorants fluorescents (fluorochromes) ajoutés à la préparation
- Lampe UV vient exciter les électrons périphériques du colorant (lorsqu’ils reviennent à l’état stable : émission d’un photon visible)
- Miroir dichroïque en verre va réfléchir les UV sur l’échantillon
- La lumière visible va traverser le verre (UV ne passe pas)
Quelle est la différence entre un microscope à épifluorescence et un microscope à fluorescence?
Fluorescence : source de lumière sous l’échantillon (+ dangereux)
Épifluorescence : source de lumière au dessus de l’échantillon
Quel est le principal avantage de la microscopie à fluorescence?
Fluorochromes sont vitaux
Permet de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes :
- Cellules vivantes : exclusion par la membrane cytoplasmique
- Cellules mortes : membrane cytoplasmique perméable
Limite : cellule peut parfois être de 2 couleurs (ex : est en train de mourir)
Expliquez l’immunofluorescence en utilisant la microscopie à fluorescence.
Utilisation d’anticorps couplé à un fluorochrome
Anticorps va se lier à la protéine/organisme d’intérêt
Expliquez en quoi consiste le FISH
Utilisation de sondes d’ADN spécifique préalablement couplée à un fluorochrome
Sonde d’ADN va s’appareiller si brin d’ADN complémentaire présent
En quelle année le microscope électronique a-t-il été découvert?
1931
Quelle est la capacité de grossissement maximale d’un microscope électronique?
Grossissement de 100 000 à 1 000 000x
Pourquoi le microscope électronique permet-il d’observer des structures plus petites?
Longueur d’onde des électrons est plus courte que celle des photons
Expliquez le fonctionnement général d’un microscope électronique
- Utilisation d’électro-aimants (pas de verre : bloque les électrons)
- Bombardement d’électrons sur l’échantillon
- Électro-aimants focalisent les électrons et les envoient sur une plaque électrosensible
- Image de la plaque est convertie en image visible par un ordinateur
Nommez 4 techniques de préparation (coloration) pour l’utilisation sous microscope électronique et expliquez-les brièvement.
- Technique d’ombrage (shadow casting)
Vaporisation de métaux selon un angle précis pour recouvrir l’échantillon
Relief de l’échantillon révèle une ombre
Métal se dépose sur les bosses, les creux seront donc plus clairs - Coloration négative
Utilisation d’acide phosphotungstique
S’accumule dans les creux (sombres) et les protubérances vont être claires - Cryodécapage (freeze etching/fracture)
Congélation de l’échantillon à une température inférieure à -180ºC et coupe transversale de l’échantillon
Fractures aux zones de faiblesse
Réalisation d’une technique d’ombrage par la suite - Immunolocalisation cellulaire
Utilisation d’anticorps spécifiques à une protéine/structure
Anticorps couplés à des billes de fer ou d’argent
Nommez 2 types de microscopes électroniques et expliquez brièvement leur fonctionnement.
- Microscope électronique à transmission
Électrons traversent l’échantillon
Détecteur sous l’échantillon recueille les électrons
Image par transparence (nécessite structures très fines) - Microscope électronique à balayage
Balayage de la surface de l’échantillon
Électrons sont réfléchis et un détecteur latéral permet de les détecter
Donne un effet 3D
Images un peu moins agrandies qu’un microscope électronique à transmission
Comment réaliser une cryoélectromicroscopie/cryotomographie électronique?
Congélation rapide à -135ºC avec éthane et N2 liquide
Vitrification de l’eau permet de conserver l’intégrité des structures sous vide
Permet la modélisation des structures protéiques
Tomographie : image de strates de l’échantillon sans production de coupes
Reconstruction informatique 3D
Vrai ou faux
Le microscope confocal à balayage laser est un microscope électronique.
Faux (microscope photonique)
Expliquez le principe du microscope confocal à balayage laser.
Illumination par laser UV (utilisation de fluorochromes)
Détection de la fluorescence exclusivement du plan du foyer
Balayage du laser : horizontal, vertical et temporel
Numérisation de l’image et reconstitution informatique en 3D (4D en temporel)
Nommez 2 types de microscopes à balayage de sonde
Microscope à effet tunnel et microscope à force atomique
Expliquez le fonctionnement du microscope à effet tunnel.
Sonde balaie la surface et mesure le déplacement vertical/horizontal et le courant entre les nuages électroniques
Expliquez le fonctionnement du microscope à force atomique
Déplace la sonde en maintenant constante la distance entre la pointe de la sonde et la surface (légère force exercée sur la pointe pour maintenir la distance sans endommager l’échantillon)
Mesure de la déflexion par un laser en suivant le mouvement vertical de la pointe (relief)
Quel est l’avantage d’utiliser un microscope à force atomique par rapport à un microscope à effet tunnel?
Peut étudier les surfaces qui ne conduisent pas bien l’électricité
