2. Aspects moléculaires Flashcards
Gestion du rsique suelon le stade deév.
3 objectifs
les investissements sont cumulatifs en ressources et temps
- identifier / éliminer les risques ( maximiser la sensibilité => minimiser faux négatifs de tox )
- évaluer les risques : maximiser spécificité (minimiser les faux positifs de tox)
- Gérer /encadrer les risques : maximiser le pouvoir prédictif
Mécanismes de toxicité - 3 survols
- Reactive products “métabolites” :
métabolites de phase 1 qui vont donner des produits réactifs (électrophiles => liens covalents ak prots ) => effets + ou -
- DNA adducts : produits qui attaquent l’ADN : cyclophsphamide
- oxidative : produtis qui génèrent du stress oxydatif => réagissent ak prots qui ont des grpments qui sont faciles à entrer ds un cycle oxydant (sulfhydrile)
mécanisme 1 : via cible primaire (6)
- extension de l’effet txique désiré
- effet dépendant de la dose
- prévisible
- responsable des 2/3 des e.i en clinique
- indices :
1. e.i obtenu ak des mol. structurellement différentes, mais de la mm classe thérapeutique
2. Corrélation entre ordre de puissance pr effet. txique et ordre de puisse pr e.i
3. e.i absent chez animal k-o dépourvu de la cible - solutions possibles : optimisation chimique ou formulation
Mécanisme 2 : via cible sec. (6)
exemple :
terfénadine et long QT (canal KIR + hERG)
- n-reliée au méc. action prim.
- prévisible si on connait mécanisme
- effet. dépendant de la dose
- manque de sélectivité de la molécule/métabolite
- indices :
1. e.i obtenu aussi ak analogue strucutrel inactif sur cible. prim.
2. pas de corrélation entre ordre de puissance pr effet txique et e.i
3. e.i présent chez animal dépourvu de la cible
SOLUTION:
OPTIMISATION DE LA SÉLECTIVITÉ : ANALOGUE STRUCTUREL
ou optimisation ADME: analogue structurel ou formulation
mécanisme 3 : via toxicophores
4
- méca: action indépendant d’une cible particulière : a) formation liens covalents (adduits) ak prots/lipides, ADN
b) + souvent :attaque grp. nucléophile ak molé. électrophile
c) Stress oxydant : peroxydation des lipides - effets variables
- prop. à l’exposition (dose + temps) : génotox, altération act. protéique, fluidité, hémolyse.etc.
- n-prop. à l’expo.:
une seule mutation peuet suffire pr certains effets génotoxiques = cancer + rx hypersensibilité
Phospholipidose
(mécanisme qui affecte les mbrs des ¢)
- causée par ?
- entrainent quoi?
- mécanisme?
AMIODARONE
- par cations amphipatiques s’accumulant ds les endosomes par un phénomène de «ion trapping»
- ils entrainent à leur tour une accumulation de PPL, la formation de corps lamellaires causant une dysfct ¢laire, apoptose, fibrose, inflammation
- pas chargé : peut diffuser et se retrouver ds les mrs => vacuoles des endosomes =(très acide) => devient chargé et ne rediffuse plus.
Types de génotox.
reliés à:
.
- ADN :
a) génotoxiques = lésions primaires de l’ADN
b) mutagènes = mutations géniques - chromosomes:
a) clastogènes : mutations chromosomiques qualitatives
b) aneugènes : mutations chromosomiques qtitatives
Génotoxicité :
- objectif
- panel de 3 études stds
-Évaluer le pot. de causer des dommages à l’ADN
- Test bactérien de mutation inverse
- Test de mutation de ¢ de mammifères in vitro
- Test de ¢ hématopoïétiques chez le rongeur in vivo
Test ames
principe
-détection des effets mutagènes en général et mutations ponctuelles en particulier :
=> substitution, addition ou délétion de paires de base.
Test Ames
mécanisme
- Les procaryotes sont haploïdes (1 copie /gène)
- 4 lignées de salmonella et 1 lignée E.coli utilisées en //
-Chacune de ces lignées est :
a) incapable de synthétiser l’histidine à cause d’une mutation ponctuelle de l’opéron histidine ( A/T ou C/G)
b) déficiente en syst. de réparation par excision de nucléotides pr ^ la sensibilité du syst.
c) déficiente en certaines gènes de synthèse de lipolysaccharide pr ^ la perméabilité mbr.
Test ames : mutation inverse chez les porkaryotes
+ (3) et limites (2)
+ :
- bon test de 1ere ligne qui détecte les agents mutagènes potentiellement cancérigènes
- simplicité d’exécution coût modique, rapide (48h)
- haute sensibilité (peu de faux nég)
limites :
- ¢ procaryotes
- faible spécificité (bcp faux +)
3 tests recommandés pr évaluer la génotox ds ¢ mammifères
test de mutation du gène TK chez le lymphome L5178Y de souris
concepts
TK et TFT
- ¢ de lymphome de souris L5178Y possèdent une seule copie du gène de la TK
- Tk => représente une des voies de synthèse de thymidine monophosphate (précurseur ds réplication ADN)
- analogue TFT est reconnu par TK => TFT emoêche appariement des brins d’ADN => stop réplication = mort ¢laire
si mutation inactivante du gène TK => cela permet aux L5178Y de croître en présence de TFT (+/- devient -/-)
test de mutation du gène TK chez le lymphome L5178Y de souris :
principe
ON MESURE LE NBR DE ¢
- Incubation avec le composé à l’étude + extrait de foie (activation métabolique)
- Taux de croissance détermine le type de mutation :
a) mutation ponctuelle : perte de fct TK-/- et ^ croissance ¢laire (protection contre TFT)
b) Bris cxique et/ou perte de fct pr un grand nbr de gènes => réduction du taux de croissance (réponse de croissance intermédiaire)
Synthèse d’ADN n-programmée
principe
-reconnaissance de mutations déclenche l’activation de mécanismes d’excision - réparation de l’ADN (implique une synthèse d’ADN)
- traitement de l’Animal in vivo ou d’hépatocytes in vitro x 24-48h
- incubation/culture x 24-48h en présence de 3H-thymidine
- Détection de l’incorporation de 3H-thymidine (marqueur de synthèse d’ADN)
- Il faut distinguer les noyaux en synthèse n-réplicative des noyaux en phase S
2e test recommandé pour évaluer la génotox ds des ¢ mammifères
effet clastogène : abberation cxique
on voit des cx tronqués, altérés
ON MESURE LE % DE ¢ AVEC BRIS DE CX.
-test in vitro d’abérration cxique en metaphase:
- incubation avec le composé à l’étude + extrait de foie
- ¢ arrêtés en métaphase après 17hrs d’incubation
- ¢ lysées et les cx sont étalés pr examens
3e test recommandé pour évaluer la génotox ds des ¢ mammifères (3.1):
test des micronoyaux in vitro
ON MESURE LE % DE ¢ AVEC MICRONOYAUX
- micronoyaux sont des morceaux de cx qui n’ont pas été inclus ds le matériel génomique des ¢ filles lors de la division ¢laire
- incubation avec le composé à létude + extrait de foie
-présence de micronoyaux est indicative de génotox (bris cxique)
micronoyaux vs apoptose
noyau en état de fragmentation prononcée suggère apoptose, plutôt que la présence de micronoyaux
3e test recommandé pour évaluer la génotox ds des ¢ mammifères (3.2):
test micronoyaux peut se faire in vivo
ON MESURE LE % DE LEUCOCYTES OU ÉRYTHROCYTES POSITIFS
- rats sont traités avec une ou + d’administrations
- prélèvement sanguin 30 hrs + tard
- présence de micronucléi est indicative de génotox (bris cxique)
diapo 24 : tests de génotox diagramme
à lire criss
2 mécanismes cancérigènes
génotox directs : mutagènes, clastogènes, stress oxydant chronique.etc.
génotox indirect : inflammation chronique, troubles endocriniens, immunosuppression.etc.
Stress oxydant (s.o) : sous produit naturel du métabolisme ¢laire:
fct ?
sources?
fct multiples :
- bénéfiques (signalisation ¢laire)
- néfastes (excès d’espèces réactives d’o2 ou baisse de défenses antioxydantes)
-sources multiples : endogènes (mitochondries, enzymes cyto/mbr) , exogènes
3 principaux agents oxydants
peroxide (O2 ^ -2) superoxide anion ( ¤O2- ) hydroxyl radical (¤OH)
O2- inactive NO => formation ONOO-
détoxification par SOD afin de former de l’eau
réactions radicalaires :
mécanisme ?
- initiation (clivage d’un lien covalent)
- propagation
- terminaison :
- capture /inactivation par scavenger (bait )
- rencontre de deux radicaux (rare)
Défenses antioxydantes
Captures par scavengers :
- rx hydrophiles :thiols (glutathion) + vitamine C
- rx hydrophobes : bilirubine + vit.e
Synthèse du glutathione :
glutathione synthétisé en 2 étapes à partir du glutamate, cystéine et glycine
Défenses antioxydantes (4)
- SOD : conversion O^2- en H2O2
- Catalase : conversion du H2O2 en H2O
- Regénérescence des espèces oxydées (par eg : glutathion) consomme du NADPH
- O^2- +NO = ONOO- (peroxynitrite)
Réponse au s.o selon l’exposition
pas de LPO (peroxidation des lipides) => survie
low LPO => antioxidant = survival
moderate LPO => death program induction => apoptic death
High LPO => membrane lysis => Necrotic death
S.o : good or bad ?
étude clinique
stress oxydant transitoire = bénéfique et contribuerait à l’adaptation des tissus aux demandes métaboliques subséquentes , phénomène analogue au préconditionnement cardiaque
modulation de la synthèse, fct et stabilité des prots par équilibre redox
-grps thiols jouent un rôle important comme senseurs de l’équilibre redox
synthèse : transcription et translation
Fonction : modification directe + protéine d’intéractions + enzymes modifiantes
Stabilité : Dégradation proteasomale
KEAP1 / NRF2 :
Induction de gènes sensibles au statut redox de la ¢
NRF2 : facteur de transcription responsable des effets protecteurs du s.o généré lors de l’entrainement par intervalle à haute intensité
2 possibilités
- état réduit : prot KEAP1 maintient facteur de transcription NRF2 ds cytoplasme => petite demi-vie = dégradation par ubiquitination
- oxydation de KEAP1 par une molécule électrophile libèreNRF2 => migre noyau => interagit avec MAF => se lie à la séquence antioxidant responsse: ^ expression des enzymes de phase 2 et autres gènes d’adaptation au s.o
Toxicité des anthracyclines : équilibre quinone-semiquinone : s.o => apoptose
chaque cycle : électron va se lier à O2 => anion superoxyde => devient radical hydroxyl
+
déplétion de NADPH (pcq impliqué ds la réduction des intermédiaires oxydants)
dans la mitochondrie :
=>S.O => active Cyp C => Caspase 3 => mort ¢laire
Toxicité des anthracyclines:
fct de la dexrazoxane :
Agent chélateur du fer qui réduit la production du radical hydroxyl, mais tjs formation d’anion superoxyde
Évaluation du risque redox :
test réglementaire std pr évaluer spécifiquement le potentiel pro- oxydant d’une molécule ?
quels signes le s.o se manifeste-t-il
non
signes fctnnels ou histologiques dans les modèles in vitro ou in vivo:
=>inflammation, fibrose, apoptose et défaillance organique
Bioactivation des toxicophores
3
- oxydation, réduction ou conjugaison de grpment susceptibles
- conversion en forme hautement réactive, généralement un électrophile
- attaque des grpments nucléophiles des :
1. glutathione : inactivation et élimination de l’électrophile (GOOD STUFF)
2. acides nucléiques : génotoxicité
3. Acides aminés et prots :
3a) altération de la fct => mort ¢laire : apoptose/nécrose : effet dose dépendant. Prévalent ds pop.
3b) : formation d’un conjugué métabolite-prot déclenchant une rx immunitaire : effet indépendant de la dose => rare ds la pop et pas prédit par études animales n-cliniques
Électrophile
(-SH, -s-, -NH2, groupes aminés, oxygène des purines/pyrimidines)
vs
nucléophile:
liens carbonyl n-saturés, époxydes, aryl carbonium.etc.
é: déficient en électron => affinité pr paires d’électrons et susceptible de former un lien ak une base ou un nucléophile
n: mol. possédant une paire d’é. susceptible d’être donné en formant un lien covalent avec un électrophile
Epoxide : exemple de carbamazepine
-utilisation d’un bait afin de diriger le métabolisme (pas passer par l’intermédiaire )
Quinone imines :
exemple d’acetaminophène
-voie mineure d’oxydation de la mol. et formation d’un intermédiaire (NAPQI) => hautement réactif
=>p-e détoxifié par le glutathion pr donner l’acide mercapturique OU
attaque nucléophile des macromolécules. envrionnantes -> mort de l’hépatocyte
=>surdose d’Acetaminophene = (voie sulfatation et glucuronidation saturés) => métabolisme 2e1 et 3a4 qui prend encharge l’Excès de tylenol => glutathion saturé aussi=>attaque nucléophile => défaillance hépatique
Alcool + acétaminophene
alcool induit cyp2e1 : ^ voie métabolique si on prend tylenol => ^ expression du 2e1 avec substrat préférentiel à l’éthanol
Différents profils de toxicité
- antipsychotiques : effet tx et effet tox : // et espacé
- Antibio, benadryl : Effet txique normal, effet toxique vrm pas raide => + facile à gérer
3. Antineoplasiques: // , mais index tx nulle pcq toxicité fait parti du traitement
- Acétaminophène
Effet toxique n’apparait pas à faible dose, mais ^ exposition => seuil où l’effet toxque peut dépasser l’effet txique
Profil de tox acétaminophène
Qd les défenses antioxidantes (glutathion) sont plus basses que le seuil de tolérance => apparition de toxicité
Atteintes hépatiques post-acetaminophene
pas juste napqi, mais aussi formation ONOO
quinone imines : production et toxicité dépendant du métabolisme
vulnérabilité des neutrophiles qui va causer une perte des granulocytes
Métabolisme de phase 1 : biosynthèse d’une quinone imine (AINS)
voie n-dominante , mais possibilité d’intéractions mx qui occupent tous les cyp2c9 => utilise 3a4
3a4 : voie d’hépatotoxicité
2c9 :
Biosynthèse d’une quinone imine par les neutrophiles
ains + méyloperoxidase ( neutrophiles antibactéricide) => … => quinone imine => agranulocytose
toxicité avec précurseur de l’aténolol ?
oui, practolol => urticaire, lésions cutanées et oculaires
Ions nitrenium toxicophores
structure tricyclique avec bcp d’électrons délocalisées
Toxicophores et réaction idiosyncrasiques
“toxicologie personnalisée”, rare et imprévisible
réaction : inhabituelle
=>souvent imprévisible , rare mais p-e sévère, polymorphisme génétique
Rx immunitaires aux mx :
type 1
immédiate
liaison IgE sur mastocytes
médiateur : histamine, 5ht
Rx immunitaires aux mx :
type 2
Cytotoxicité ¢ lié aux AC
igG et antigène adduit à la ¢, liaison du complément
médiateur : neutrophiles, macrophages ,NK
Rx immunitaires aux mx :
type 3
Complexe AC-complément immunitaire
IgG et antigène soluble susceptible de lier le complément
neutrophiles, macrophages, nk, espèces réactives d’oxygène
Rx immunitaires aux mx :
type 4
hypersensibilité retardée, de type ¢laire
antigène en association aux CMH à la surface des ¢pa
lymphocytes, cytotoxiques, macrophages, cytokines
Immunotoxicité et hépatoxicité
prots + mx => rencontre CPA => génère une rx immunitaire contre hépatocytes
SOD 1, ,2 ,3
superoxyde dismutase 1
intra¢laire
SOD 2 : mitochondriale
SOD3 :extra¢laire
test de génotox
lésions prim
mutagène
clastogènes
aneugènes
comètes
ames
aberrations cxmiques
micronoyaux
