1) Técnicas (Ross) Flashcards
Estudio científico de las estructuras microscópicas de los tejidos y órganos del cuerpo
Histología o anatomía microscópica
Técnicas auxiliares
- Varios métodos de tinción
- histoquímica y citoqúmica
- técnicas de inmunocitoquímica y de hibridación
- autorradiografía
- cultivo de tejido y órganos
- separación células y organulos por centrifugación diferencial
- preparación titular especializada
- técnicas microscópicas especializadas
- sistemas ópticos especializados
Tinción utilizada con mayor frecuencia
H&e
Primer paso en la preparación de muestra de un tejido
Fijación, conserva de forma permanente la estructura del tejido
La fijación sirve para
- Detener metabolismo celular
- no degradación enzimática de células y tejidos por autólisis
- destruir microorganismos patógenos (bacterias, hongos o virus)
- endurecer tejido como resultado de la formación de enlaces cruzados o desnaturalización de proteínas
Fijador más habitual y composición
Formalina, formaldehído al 37%
Cosas que conserva el formaldehído
Estructura general de la célula y componentes extracelulares por reacción con grupo amino
Mal fijador de membranas celulares porque no reacciona con lípidos
Formaldehído
Segundo paso para preparar la muestra
Muestra es preparada para inclusión en parafina
- se corta en 5-15 micrón
- Se lava y deshidrata con alcohol al 100%
- se aclara con solventes orgánicos (xileno o tolueno)
El micromoto es
Maquina cortadora especial
Medio de montaje es
Una solución que se endurece en un montaje permanente y mantiene la muestra unida al vidrio
Medios de montaje más usados
-Resinas sintéticas basadas en tolueno (permout)
- bálsamo de Canadá (trementina hecha de resina del abeto balsámico)
- otros
Tercer paso para preparar la muestra
Se tiñe
- antes disolvemos y extraemos parafina con xileno o tolueno
- rehidratamos con alcohol(concentración decreciente)
- teñimos con hematoxilina en agua
- volvemos a deshidratar con alcohol para agregar eosina
Son diluidos por alcoholes y solventes orgánicos que se utilizan usualmente en preparados
Lípidos neutros
Otros fijadores
- Lípidos neutros (adiposo):cortes por congelación de tejido fijado con formalina y colorantes que disuelvan grasa
- estructura de membrana: fijadores especiales + metales pesados ( permanganato y osmio) que se unen a fosolípidos
Uso rutinario de este fijador es la razón principal de excelente estado de conservación de las membranas
Tetroxido de osmio
Facts: biopsia por congelación
Se solicita cuando no hay diagnostico preparatorio o para identificar hallazgos inesperados
- saber si se extirpo toda masa patológica
Pasos biopsia por congelación
1) congelación tejido; por CO2 o isopentano
2) corte de tejido: criostato (micromoto refrigeración) 5 nm- 10 nm
3) tinción cortes: h&e, azul de metileno y PAS
Características de componentes que perduran después de la fijación y como forman macromoléculas
No se disuelven con facilidad
Reaccionar con otras moléculas semejantes, así conservándose en el corte
- nucleoproteinas (ac Nucleicos + proteínas)
- proteínas intracelulares de citoesqueleto (en complejo con proteínas asociadas)
- proteínas extracelulares (grandes aglomeraciones, + moléculas similares por enlaces cruzados con vecinas)
- complejo de fosfolípidos y proteínas en membrana
Moléculas que se pierden durante la fijación de rutina con fijadores acuosos
- Glucógeno
- proteoglucanos y glucosaminoglucanos
Moléculas pequeñas que se pierden durante la preparación de muestras de parafina
- Metabólicos intermedios
- glucosa
- sodio
- cloro
Su conservación aporta información impórtente del metabolismo celular, transporte activo y otros procesos vitales
Componentes estructurales que no se ven bien con tinción por h&e y tinción que utilizan
- Elastina (orceína y fuscina-resorcina)
- fibras reticulares (impregnación argénica)
- membranas basales (impregnación argénica)
- lípidos
Colorantes basicos
- verde de metileno (verde)
- azul de metileno (azul)
- pironina G (rojo)
- azul de toluidina (azul)
Colorantes acidos
- fucsia ácida (rojo)
- anilina azul (azul)
- eosina (rojo)
- naranja G (naranja)
No es un colorante basico pero tine propiedades may semejantes
Hematoxilina
Estos colorantes reaccionan con los componentes anionicos de células y tejidos
Básicos
Componentes anionicos
- Grupos fosfato de ac. Nucleicos
- grupos sulfato de glucosaminoglucanos
- grupos carboxilo de proteínas
Reacción basofílica dependiendo de ph
- Alto (10): 3 gpos ionizados y disponibles para reacción (unión electrostática)
- medio (5 - 7): gpos fosfato y sulfatos ionizados (unión electrostática)
- bajo (<4): gpo sulfato ionizado
Tinción mallory
3 colorantes ácidos
- anilina azul (colágeno)
- fucsina-ácida (citoplasma y núcleos )
- naranja G (eritrocitos)
Sustancias dentro de células y en la matriz extracelular que presentan basofilia
- Heterocromatina y nucleolos (gpos fostatos)
- componentes citoplasmáticos (gpos fosfatos en ARNr)
- material extracelular, hidratos de carbono de matriz de cartílago (gpos sulfato ionizados)
Sustancias dentro de la célula y en matriz extracelular acidofilicas
- Mayoría de filamentos citoplasmáticos (músculo)
- mayoría de componentes membranosos
- mayoría de fibras extracelulares (gpo amino ionizado)
Ciertos colorantes básicos reaccionas con componentes tisulares que cambian su color normal de azul a rojo o purpura, debido a la presencia de polianiones
Metacromasia
Tiñe hidratos de carbono y macromoléculas con abundancia de estos. Se usa para mostrar glucógeno de células, moco en diversas células y membrana basal subyacente en epitelios y fibras reticulares en tejido conjuntivo
Acido periódico de schiff (pas)
El PAS se utiliza en esta reacción, basada en hidrolisis débil con ácido clorhídrico para teñir ADN
Reacción de Feulgen
Alternativa de impregnación argénica
Reacción PAS
- tinción de membrana basal y fibras reticulares por asociación de proteoglucanos
Técnica creada para estudiar los aumentos de ADN en las células en desarrollo y para analizarla ploidia
Microespectrofotometría de Feulgen
Glucoproteínas producidas por células específicas del sistema inmunitario como respuesta a una proteína extraña o antígeno
Anticuerpos o inmunoglobulinas
Colorante más utilizado, absorbe la luz ultravioleta y emite luz verde
Fluoresceína
Tipo de anticuerpo producido por animales inmunizados
Policlonales
Tipo de anticuerpo sintetizado por líneas celulares inmortalizadas que se duplican continuamente
Monoclonales
Técnica más antigua utilizada para identificar distribución de un antígeno dentro de células y tejidos; emplea un anticuerpo primario (fluorocromo) que reacciona con el antígeno, involucra solo un anticuerpo marcado
Inmunofluorescencia directa
Técnica que en vez de conjugar un fluorocromo con un anticuerpo específico, se conjuga con un anticuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo primario
Inmunofluorescencia indirecta
Describe la capacidad de las moléculas monocatenarias de ARN o ADN para interactuar con secuencias complementarias
Hibridación
La unión de la sonda de nucleótidos a la secuencia de ADN o ARN se realiza dentro de células o tejido; permite identificar secuencias de nucleotidos de 10 o 20 copias de ARNm o ADN por célula
Hibridación in situ
Utilizada como una emulsión fotográfica que se coloca sobre un corte histológico para localizar material radioactivo en los tejidos
Autorradiografía
Método para mejorar la resolución de la microscopia óptica mediante la implementación de una preparación específica que expande físicamente la muestra
Microscopio de expansión
Tipo de polímeros expansibles
Hidrogeles
Materiales muy absorbentes que se encuentran en pañales de bebés
Pasos para preparar la muestra Méx
1) fijación
2) anclaje: marcar con sonda de interés e incubación con reactivo de anclaje expresando sitios de unión
3) gelificación: conversión de son en gel
4)homogeneización mecánica: romper células
5) expansión: agregar solvente, expansión 3D
Expansión lineal de 4.5 veces, aumento de rango de resolución 60 - 70 nm
Microscopio de expansión iterativa (mexi)
