04 How can a patient's DNA be studied?

Question 1

Genomin tietyn alueen tutkimuksessa menetelmät perustuvat kahteen eri lähestymistapaan: mihin?

Answer 1

1. Koettimiin hybridisoituminen
2. PCR-monistukseen

Question 2

Kaksi erilaista strategiaa kun testataan DNA:ta hybridisaatiomenetelmällä?

Answer 2

1. Halutaan koettimen ja sekvenssin välinen täydellinen match, jolloin yhdenkin emäsparin epäsopivuus johtaa siihen ettei hybridisaatiota tapahdu. TÄhän käytetään oligonukleotideja (15-30bp). Tällä menetelmällä voidaan erotella alleeleja jotka eroaa esim. vain yhdellä emäksellä.
2. Joskus tarvitaan universaaleja koettimia, jotka toimii kenen tahansa DNA:ssa. Nämä koettimet ovat pidempiä (~100 bp). Muutamien emäksien mismatch ei estä hybridisaatiota, joka on hyvä, kun ei olla kiinnostuttu varianteista, vaan siitä, onko esim. deleetio jolloin hybridisaatio ei tapahdu koska koko sekvenssiä ei ole olemassa.

Question 3

Southern blot on vaativa tekniikka, joka on suurimmaksi osaksi jäänyt jo unholaan parempien ja nopeampien tekniikoiden myötä. Mikä sovellus sillä kuitenkin on edelleen nykypäivänä?

Answer 3

CG-rikkaita alueita on hankalaa tai mahdotonta monistaa PCR:llä, koska CG-sidokset ovat vahvempia kuin AT, eivätkä siten denaturoidu yhtä hyvin. SB voi karakterisoida sekvensimuutoksia joita olisi hankala käsitellä PCR:llä. Esim iso CGG_n ekspansion koko voidaan tarkistaa SB:llä.

Question 4

Southern Blotin periaate

Answer 4

Restriktioentsyymeillä leikataan DNA fragmenteiksi, ja ajetaan geelielektroforeesi. Emäksellä denaturoidaan fragmentit, kun ne ovat geelillä. Fragmentit siirretään nitroselluloosapaperille geeliltä, ja paperiin tarttuu denaturoituneet fragmentit. Paperi upotetaan liuokseen jossa on koetin (ja merkkiaine). Paperiin tarttuneet koettimet visualisoidaan ja nähdään, onko hybridisaatiota tapahtunut ja missä fragmentissa.

Question 5

Mikä on mikroarray-tekniikoiden suurin rajoite?

Answer 5

Se ei voi havaita tasapainossa olevia kromosomimuutoksia (translokaatiot, inversiot), vaan ainoastaan kopiolukumuutoksia. Resoluutio on myös rajoittunut; tarkimmatkaan sirut eivät voi havaita variantteja jotka ovat alle muutaman kiloemäksen kokoisia.

Question 6

Mitä kahdenlaisia mikroarraytekniikoita (siruja) on?

Answer 6

1. Array-CGH-sirut (Comparative genomic hybridization) joka perustuu potilaan DNA:n ja kontrolli DNA:n kilpailuun siruilla (vihreä vs punainen värjäys). Skannaa ns. koko genomin, tai vain esim. tietyn kromosomin.
2. SNP-sirut, joissa koettimia hyvin monille tunnetuille SNP:lle. Näistäkin nähdään esim. duplikaatiot ja deleetiot, vaikkei perustukaan kilpailuun kontrolli-DNA:n kanssa. Deleetio näkyisi siinä että tietyn alueen hybridisaatiointensiteetti olisi vain puolet normaaliin verrattuna. Duplikaatio näkyisi lisääntyneenä intensiteettinä alueen viereisiin SNP:hin verrattuna.

Question 7

Mitä erikoista on 16p:ssä?

Answer 7

Paljon toistojaksoja joka altistaa deleetioille ja duplikaatioille non-allelic homologous recombination -mekanismilla. Alueella kuvattu paljon mikrodeleetioita ja duplikaatioita.