הנדסה גנטית

Question 1

מהי טכנולוגיית סדנא רקומביננטי

Answer 1

עוסקת בשינויים בחומר התורשתי ובהבנת הפעילות של גן מסוים ע”י בידוד גן אחד מתוך אלפי גנים.
􏰀 בבני אדם ישנם עשרות אלפי גנים.

Question 2

מהם 3 הדברים שצריך ליצירת דנא רקומביננטי

Answer 2

לצורך יצירת דנ”א רקומביננטי יש צורך ב:
1. חיידקים
2. פלסמידים
3. מקטע דנ”א שמכיל את הגן אותו רוצים לבטא
ביטוי הגן הרצוי נעשה באמצעות וקטור של דנ”א שנקרא פלסמיד המשמש כנשא של אותו מקטע דנ”א.

Question 3

תארי את אופן הפקת הד-נ-א הרקומביננטי בכותרות

Answer 3

חותכים את הפלסמיד )מולקולת דנ”א מעגלי( ומכניסים לתוכו את מקטע הדנ”א המבוקש. מתקבלת
מולקולת דנ”א רקומביננטי.
􏰀 את הפלסמיד מחדירים לחיידק –
o בנוסףלפלסמיד לחיידק ישכרומוזום גנומי–כרומוזוםבודדמעגליהמכילאתהדנ”אשל
החיידק.
o לפלסמידהרקומביננטיישיכולתהתרבותעצמית–יודעלייצרמספרהעתקיםשלאותו
מקטע דנ”א. )התרבות הפלסמיד לא תלויה בחיידק(. o החיידקמתחלקכל20דקותומייצרהרבהחיידקיםופלסמידיםעםהגןהמבוקש.
􏰀 בנוסף ליכולת ההתרבות העצמית שלהם, הפלסמידים מכילים גן עמיד לאנטיביוטיקה. o לוקחיםאתכלהחיידקיםשמכיליםאתהדנ”אהרקומביננטי,וזורעיםאותםעלמצעאגר
שמכיל אנטיביוטיקה שיוצרת סלקציה בין חיידקים שמכילים את הפלסמידים הרקומביננטיים לבין אלה שלא. כלומר כל מושבה שנקבל על המצע מכילה את הפלסמידים.

Question 4

מהו הפלסמיד מה יתרונותיו ומה הוא מכיל?

Answer 4

מולקולת דנ”א מעגלי בעל כושר התרבות באופן עצמאי. מצויה בתא החיידק בכמות גדולה, ואינה מהווה חלק מהדנ”א הכרומוזומלי של החיידק.
􏰀 משקל מולקולרי נמוך - מולקולת דנ”א קטנה וטבעתית, גודלה עד 10Kbp.
􏰀 יציבות – דנ”א קטן, אינו שביר במבחנה, צורתו הטבעתית נשמרת.
􏰀 קל לניקוי והפרדה – עמיד בפני שבירה ונשמר בתהליך ההפקה. כרומוזום החיידק נשבר למקטעים
קוויים. קל להפריד בין מולקולות דנ”א בעלות צורות שונות.
􏰀 כמות – מייצר העתקים רבים בתא החיידק. הפקה בכמות גדולה מנוצלת לריבוי מקטעי דנ”א
רקומביננטי.
􏰀 יכולת שכפול עצמאי – לכל פלסמיד יש אזור מוצא ההכפלה – )Origin of replication (ORI, שמאפשר
התרבות עצמית בחיידק.

הפלסמיד מכיל:
􏰀 מרקרים שיוצרים סלקציה - מכילים גנים לעמידות לאנטיביוטיקה.
􏰀 פולילינקר – אזור בפלסמיד שמכיל אנזימי רסטריקציה.
􏰀 אזור מוצא ההכפלה
􏰀 פרומוטר – קטע דנ”א הקובע את האיבר או הרקמה שבהם ייווצר תוצר הגן, ואת כמות התוצר
שתיווצר בתאים. זהו למעשה רצף דנ”א שעוזר בביטוי הגנים. יש מספר סוגים של פרומטורים, למשל: 40-CMV,SV )נחשב לפרומטור חזק, מבטא טוב מאוד את הגן שאנחנו רוצים(.

Question 5

מהו pcDNA3.1

Answer 5

פלסמיד מאוד נפוץ, מפיקים אותו בדר”כ מ-E.coli.
􏰀 יש לו מספר פרומטורים – SV40 ,CMV
􏰀 פולילינקר – מכיל הרבה מאוד אתרים שבהם אנזימי רסטריקציה, אנזימים שיודעים לחתוך את
הדנ”א באזורים מסוימים.
􏰀 עמידות לאנטיביוטיקה – מכיל גנים לעמידות בפני אמפיצילין
ונאומיצין.

Question 6

כיצד מייצרים מפת אנזימי רסטריקציה?

Answer 6

ניתן להפעיל על אותו מקטע של דנ”א מספר אנזימי חיתוך שונים.
􏰀 מריצים את הדגימות השונות באלקטרופורזה.
􏰀 זיהוי מקטעי ההרצה יעשה ע”פ UV וע”י אוטורדיוגרפיה.
􏰀 בעקבות ניתוח של סדרת המקטעים ניתן לשרטט את מפת
ההגבלה של הקטע לאותם אנזימים.

Question 7

מהם סוגי הקצוות שיכולים להתקבל מחיתוך באנזימי רסטריקציה

Answer 7

קצוות דביקים – מהחיתוך באמצעות אנזימי הגבלה מתקבלים קצוות חד
גדילים המסוגלים להצמיד אליהם דנ”א חד גדילי משלים.
o לוקטורפחותיכולתלהיסגרעלעצמו. o יששליטהעלכיווןהכניסהשלמקטעהדנ”א.
o נצטרךליצורהתאמהביןהגןשנרצהלהכניסלביןהפלסמיד.
נצטרך לחתוך את הדנ”א והפלסמיד באמצעות אותו אנזים רסטריקציה.
􏰀

קצוות ישרים – חיתוך חלק בציר הסימטריה של אתר ההגבלה יוצר קצוות חלקים )לא דביקים(.
o נוכללהכניסכלמקטעדנ”אשנרצה,העיקרשיהיהחתוךבקו ישר.

Question 8

מה ההגדרה לדנא רקומביננטי

Answer 8

הגדרה
דנ”א רקומביננטי הוא דנ”א ייחודי שנוצר ע”י חיבור של שני מקטעים שאינם מצורפים יחדיו באופן טבעי.
יצירת דנ”א רקומבינטטי
1. חיתוך שני מקטעים ע”י אותו אנזים חיתוך.
2. חיבור של המקטעים )תהליך זה מתבצע בטמפ’ נמוכות(.
3. איחוי של שני הגדילים בעזרת אנזים ליגאז.

Question 9

מהי טרנספורמציה

Answer 9

תהליך קליטה של דנ”א זר ע”י תא חי וביטויו. תא שעבר טרנספורמציה הוא טרנספורמנט.

Question 10

מהו אי קולי ומדוע משמש בטכנולוגיית דנא רקומביננטי

Answer 10

חיידק הצואה. משמש לתהליכי שיבוט –
􏰀 התרבות מהירה – כל 20 דקות. אם לחיידק גן עמיד לאנטיביוטיקה, נקבל מקטעי דנ”א רבים שבהם הגן שאנחנו רוצים.
􏰀 תהליך קליטת הדנ”א מאפשר חדירה של מולקולה יחידה בכל תא חיידק.
􏰀 מסוגל לקלוט דנ”א מכל מקור שהוא.
􏰀 מגדלים אותו במעבדות במדיום מוצק )אגר( או נוזל.
􏰀 גודלו 1 מיקרון.

Question 11

תארי את תהליך הטרנספורמציה

Answer 11

תהליך הטרנספורמציה
􏰀 תהליך הטרנספורמציה מתבצע בדרך הבאה:
o בידוד הפלסמיד הרצוי מתוך תערובת החיידקים.
o יצירתכמותגדולהשלאותופלסמיד.
􏰀 קיימות שתי שיטות לביצוע הטרנספורמציה: Electroporation o-הלםחשמלי.בעליעילותגבוהה. o הלםחום–יעילותנמוכה.שמיםבמבחנהדנ”אוחיידקים,למבחנהמוסיפים:
􏰂 מלח קר – קשירה של דנ”א לממברנת החיידק
􏰂 חום קצר – התרחבות החורים בדופן החיידקים לכניסת הדנ”א
􏰂 קרח- התכווצות הממברנה וסגירת החורים

הבדלה בין חיידקים שעברו טרנספורמציה לאלו שלא מתבצעת בשלבים הבאים:
􏰀 הדגרה
􏰀 זריעה – את החיידקים שצמחו זורעים בצלחת פטרי שמכילה אנטיביוטיקה.
􏰀 סלקציה – רק החיידקים שמכילים את הפלסמיד עם הגן העמיד לאנטיביוטיקה ישרדו.

Question 12

כיצד מפיקים פלזמיד

Answer 12

גידול חיידקים טרנספורמטים ושיקועם באמצעות צנטריפוגה.
􏰀 ליזיס של תאי החיידקים – פירוק החיידקים בתהליך שהורס את הממברנה שלהם. בתהליך זה
משחררים את הפלסמידים )הפלסמיד לא נפגע מכיוון שזו מולקולת דנ”א מעגלי קטנה ביחס לכרומוזום המעגלי של החיידק(.
􏰀 רנטורציה של הפלסמיד –איחוי שני הגדילים זה לזה.
􏰀 הפרדה של הפלסמיד מהדנ”א הכרומוזומלי – נעשה בתהליך אילוציה
o עושיםשימושבקולונה–מבחנהקטנהשיודעתלעשותהפרדהביןהפלסמידלבין הכרומוזום של החיידק.
o מוסיפים את הליזט הצלול על הקולונה )מה שהתקבל כתוצאה מהליזיס של תאי החיידקים(. o שוטפיםאתהקולונהעםתמיסתבופרוכתוצאהמכךמשחרריםאתהדנ”אהרצוילתוך
מבחנה.
􏰀 שיקוע דנ”א.
􏰀 ייבוש הדנ”א.

Question 13

כיצד נבדוק את תקינות הפלסמיד?

Answer 13

נרצה לדעת האם קיבלנו בפלסמידים את מקטע הדנ”א הרצוי.
􏰀 ראקציית חיתוך עם אנזימי רסטריקציה – מבצעים בפלסמידים חיתוך עם אותו אנזים רסטריקציה שהשתמשנו בו בהתחלה כדי להכניס את הגן הרצוי.
􏰀 בדיקת התוצרים באלקטרופורזה בג’ל – o נריץאתהדנ”אבג’לעםמרקרדנ”א–מקטעידנ”אבעלימשקלמולקולריידוע. o נשווה את תוצאות ההרצה למרקרים - אנחנו יודעים מה המשקל המולקולרי של הפלסמיד
ושל מקטע הדנ”א שהכנסנו לו, לכן נצפה לקבל בג’ל שני מקטעי דנ”א, קטן – הגן שהכנסנו וגדול – הפלסמיד.

Question 14

מהם סוגי הנשאים לדנא רקומביננטי

Answer 14

Plasmid
Phase lambda
Cosmid
yeast artificial chromosome

Question 15

מהו וקטור BAC

Answer 15

וקטור מבוסס על פלסמיד אי קולי
נשא של דנא גדול
יש אחד או שניים בבקטריה
קל לעיבוד

Question 16

מהו גנום

Answer 16

כל המידע התורשתי של אורגניזם כלשהו המקודד בדנ”א שמרכיב את הכרומוזומים )כלומר רצף זוגות הבסיסים במולקולת הדנ”א שלו(, ומצוי בגרעין התא של כל תא בגופו.

Question 17

כיצד מייצרים ספרייה גנומית

Answer 17

מפיקים דנ”א מתוך תא וחותכים אותו באמצעות אנזימי רסטריקציה.
o חיתוךחלקישלהדנ”א–משתמשיםבאנזימירסטריקציהבריכוזנמוךכדילאלקבליותר
מדי מקטעים.
􏰀 עושים חיבור בין הפלסמיד למקטעי הדנ”א שנוצרו באמצעות אנזים ליגאז - נקבל פלסמידים
רקומביננטיים שבהם מקטעי דנ”א בגדלים שונים.
􏰀 נכניס את הפלסמידים לחיידקים – כל חיידק קולט פלסמיד אחד בלבד.
􏰀 החיידקים מתחלקים ולכן נוצרים שכפולים רבים של הפלסמידים.
􏰀 זורעים את החיידקים על מצע אגר ונקבל הרבה מושבות של חיידקים, כאשר כל מושבה מכילה
פלסמיד רקומביננטי אחד בלבד. כל המושבות מהוות ספריה גנומית.

Question 18

מהו cdna ואיך מייצרים אותו

Answer 18

דנ”א מכיל את כל הגנים, וכולל את כל האינטרונים )שלא מכילים מידע לביטוי גן( והאקסונים. לכן נוכל ליצור ספריה מצומצמת באמצעות mRNA.

יצירת cDNA מmRNA

אנזים רוורס טרנסקריפטאז יודע להפוך רנ”א לדנ”א.
􏰂 מקור האנזים ברטרו וירוסים – וירוסים שמכילים בגנום שלהם רנ”א ומכילים את האנזים הזה. לאחר השעתוק ההפוך, הדנ”א הוויראלי עובר אינטגרציה עם הדנ”א של התא המאכסן.
􏰀 יצירת cDNA – באמצעות רוורס טרנסקריפטאז נבנה גדיל חדש של דנ”א מ-5’ ל-3’ על בסיס רנ”א שליח שעבר שחבור.
􏰀 מנתקים את רנ”א שליח מהדנ”א החדש שנוצר.
􏰀 על גדיל דנ”א מ-3’ ל-5’ דנ”א פולימראז מסנתז גדיל חדש של דנ”א מ-5’ ל-3’. )קצה 3’ של cDNA
משמש כפריימר(. 􏰀 מתקבל דנ”א דו גדילי מצומצם )ללא אינטרונים( שנוצר על בסיס
mRNA. 􏰀 את הדנ”א שהתקבל חותכים, מחברים לפלסמידים ומחדירים לחיידקים.

Question 19

מהו גלאי probe

Answer 19

כלי שבאמצעותו אפשר לזהות דנא רקומביננטי

לוקחים מקטע דנ”א חד גדילי קטן, עם רצף נוקלאוטידים
ידוע, שמסומן בחומר רדיואקטיבי.
􏰀 מערבבים את המקטע הרדיואקטיבי עם דנ”א חד גדילי ונעשה חיבור בין בסיסים משלימים. מתקבל מקטע דנ”א דו גדילי מסומן.
􏰀 בהליך אוטורדיוגרפיה ניתן לזהות היכן נמצא אותו גן ספציפי שחיפשנו.

Question 20

תארי את תהליך זיהוי מושבה בעזרת גלאי פרוב

Answer 20

זיהוי המושבה בעזרת גלאי probe לזיהוי גן המבוקש
􏰀 כאשר יש לנו צלחת עם מושבת חיידקים המכילים דנ”א רקומביננטי, מניחים על גבי המושבות נייר מיוחד הנקרא ניטרוצלולוז.
􏰀 המושבות יוצרות הדפס על גבי הנייר.
􏰀 מבצעים ליזיס של החיידקים ודנטורציה של הדנ”א שנמצאים על הנייר.
􏰀 לנייר מוסיפים גלאי – probe מסומן )מקטע דנ”א קצר מסומן בחומר רדיואקטיבי(. הגלאי נקשר
למושבות ספציפיות המכילות את הגן שנמצא ב-probe.
􏰀 כדי לזהות את המושבות בהן יש את ה-probe חושפים את הנייר לנייר פילם בתהליך אוטורדיוגרפיה.
המושבות שיופיעו על גבי הפילם הן המושבות המכילות את הגן הרצוי.

Question 21

תארי את תהליך זיהוי הגן באמצעות תוצר חלבוני

Answer 21

גם לאחר שמוצאים את החיידקים שקיבלו את הפלסמיד הרקומבננטי, יש עוד מקום לבדוק האם הגן מתבטא בחיידק. תהליך זה יכול להיעשות ע”י זיהוי התוצרים.
תיאור השיטה
􏰀 יוצרים הדפס של המושבות על גבי ניר ניטרוצלולוז. החלבונים נספחים לנייר.
􏰀 מדגירים את הנייר עם נוגדן כנגד החלבון )מזהה את החלבון שהגן הדרוש מבטא(. נוגדן תמיד מזהה חלבון )ולא דנ”א(.
􏰀 מבצעים שטיפה.
􏰀 מדגירים עם נוגדן שניוני מסומן רדיואקטיבית / פלורוסנטי
)שמזהה את הנוגדן הראשון ומסמן את המושבות הרצויות(.
􏰀 מבצעים בדיקה באוטורדיוגרפיה.

Question 22

מהי הכלאה דרומית

Answer 22

שיטה נוספת לזיהוי גנים.
􏰀 חותכים דנ”א בעשרת אנזימי רסטריקציה ומריצים את מקטעי הדנ”א באלקטרופורזה בג’ל.
􏰀 מעבירים את מקטעי הדנ”א לניטרוצלולוז )ג’ל הוא חומר רך שקשה לעבוד איתו, נשבר בקלות( ע”י
ספיגה –
o שמיםאתהג’לעלגביספוגדקשנמצאבתוךמיכל
המכיל תמיסה בסיסית.
o עלהג’לשמיםאתהניירניטרוצלולוז.
o עלהניירשמיםניירותסופגיםשמבצעעלייהנימיתשל
התמיסה וכך מעביר את כל המידע שיש בג’ל לניטרוצלולוז.
o כל פסיהדנ”אהחדגדילישהיובג’לעברולניירוהתקבעו עליו.
o מכניסיםאתהניירלשקיתמיוחדתושמיםבהגלאי probe מסומן בחומר רדיואקטיבי, שמתקשר לקטעי דנ”א משלימים.
o חושפיםאתהניטרוצלולוזלניירצילוםבתהליךאוטורדיוגרפיה.עלניירהצילוםמתקבלים פסים שחורים מסומנים שמראים היכן נמצא רצף הדנ”א שחיפשנו.

Question 23

מה ההבדל בין הכלאה דרומית וצפונית

Answer 23

דרומית זה לדנא צפונית זה לרנא

Question 24

מהי הכלאה מערבית

Answer 24

􏰀 מפיקים חלבון, מחממים אותו עד לדנטורציה כדי לקבל מקטעי חלבון. מוסיפים לתמיסה חומר בשם SDS שמונע מהחלבון להתקפל.
􏰀 מריצים את מקטעי החלבון באלקטרופורזה בג’ל במצב מאונך )ולא מאוזן כמו בכל המקרים האחרים(. ההרצה בג’ל גורמת להפרדה של החלבונים.
􏰀 בדומה לשיטות הקודמות, מעבירים את המידע בספיגה לנייר ניטרוצלולוז.
􏰀 מוסיפים נוגדנים ראשוניים שמזהים את החלבון הספציפי אותו רוצים ונקשרים אליו.
􏰀 מוסיפים נוגדנים שניוניים שמכילים אנזים שמבצע ראקציית אור או צבע.
􏰀 חושפים את הג’ל לנייר פילם ומשווים את הפסים שקיבלנו למרקרים ידועים על מנת לזהות חלבון
מסוים.
􏰁תהליך זה נקרא גם Immunoblotting – מלשון אימונולוגיה, משתמשים בנוגדנים לזיהוי.
הכלאה מערבית – Western Blotting
רק לחלבוניםמ

Question 25

מהי שיטת סנגר?

Answer 25

שיטה לקביעת רצף הנוקלאוטידים בדנ”א. זכה ב-1980 בפרס נובל.
עפ”י השיטה מבצעים שכפול של דנ”א תוך שימוש בסמנים ש”תוקעים” את דנ”א פולימראז )כלומר עוצרים אותו במקום מסוים( ובכך יוצרים מקטעים בכל האורכים האפשריים. ממקטעים אלה ניתן לאפיין את מקטע הדנ”א המקורי באמצעות אלקטרופורזה.

Answer 26

􏰀 דנ”א – הרצף שאותו רוצים לגלות
􏰀 דנ”א פולימראז – סנתוז דנ”א ע”י הוספת נוקלאוטידים.
􏰀 פריימר – גורם לאתחול תהליך הסינתזה של הדנ”א.
􏰀 dNTP – נוקלאוטידים
􏰀 ddNTP – נוקלאוטידים שחסרה להם קבוצת OH בפחמן 3’ ולכן מייצרים עיכוב
בסנתזה של הדנ”א. כלומר הם בודדים

Question 27

תארי את התהליך בשיטת סנגר

Answer 27

מבודדים גדיל דנ”א אחד שאותו רוצים לרצף. הגדיל יהיה מ-3’ ל-5’.
􏰀 מכינים 4 מבחנות המכילות:
o גדילהדנ”אהנבדק.
o פריימרשמסומןרדיואקטיביתבקצה5’-הפריימרהואלמעשהמקטעדנ”אקצרהמשלים
לגדיל הנבדק. הפריימר הוא בכיוון 5’ ל-3’, הכיוון שבו דנ”א פולימראז עובד.
dNTP o – כל סוגי הנוקלאוטידים o דנ”א פולימראז (G או C ,T ,A) בכל מבחנה נשים אנלוג מסוג אחד –
ddNTP o
􏰀 בכל מבחנה ייצור הדנ”א הדו גדילי ייעצר באופן אקראי בנוקלאוטיד אחד )הנוקלאוטיד שממנו שמנו אנלוג באותה מבחנה(.
o ישנהתחרותביןנוקלאוטידיםלאנלוגעלההשתלבותבגדילהנבנה.כמותקטנהשלאנלוג תשתלב רק במקום אחד בגדיל המשלים.
􏰀 מריצים כל מבחנה בנפרד באלקטרופורזה בג’ל. המקטעים השונים מופרדים עפ”י גודלם.
􏰀 זיהוי הפסים יעשה ע”י אוטורדיוגרפיה )כי השתמשנו בפריימר מסומן רדיואקטיבית(. סדר הפסים
שהתקבל בג’ל מצביע על רצף הנוקלאוטידים.
o אנחנו יודעים באיזה נוקלאוטיד נעצרה הסינתזה בכל מבחנה, בהתאם לאנלוג שהכנסנו
אליה. לכן נוכל לקבוע את רצף הדנ”א בהתאם לגודל כל מקטע דנ”א. המקטע הקל ביותר הוא הנוקלאוטיד הראשון אחרי הפריימר וכך הלאה.

Question 28

מהם סוגי הטרנסקריפציה

Answer 28

Unstable transfection / Transient transfection – ביטוי הגן ארעי.
􏰀 Stable transfection – ביטוי הגן קבוע.

Question 29

מהן השיטות לביצוע טרנספקציה לעכבר פלורוסנטי

Answer 29

Calcium Phosphate Transfection .1

Elctroporation .2

Question 30

מהו Calcium Phosphate Transfection

Answer 30

תאי MSCs עברו טרנספקציה בנוכחות הפלסמיד h-TERT) pcDNA3( והפלסמיד pEGFP )גן פלואורסנטי – גן מדווח(.
תיאור הניסוי:
􏰀 טכניקת הטרנספקציה מתבצעת ע”י ערכה מסחרית בשם 6 Fugene של חברת Roche.
􏰀 ריאגנט הטרנספקציה הוא ריאגנט ליפידי שעובר קומפלקס עם הדנ”א ומעביר אותו לתוך התאים -
o ניקח ריאגנט ליפידיהנקראהartificial liposomes,בעלמבנההדומה לפוספוליפיד וטעון במטען חיובי.
o לדנ”אמטעןשליליולכןנקשרלריאגנטהליפידי.
o הריאגנטהליפידיממסךאתהדנ”אומחדיראותולתא.זאתמכיווןשהליפידשומניויכול
לעבור דרך הממברנה.
􏰀 כ-48 שעות לאחר ביצוע הטרנספקציה, נבדקת התבטאות החלבון GFP בתאי MSCs ע”י מיקרוסקופ
פלואורסנטי לצורך הערכת הצלחת הטרנספקציה.
􏰀 מוסיפים את האנטיביוטיקה ג’נטיצין )Geneticin – G418( כדי לבצע סלקציה בתאים – רק תא שמכיל
את הפלסמיד בעל הגן נאומיצין )Neomycin( יהיה עמיד בפני האנטיביוטיקה וישרוד.

Question 31

תני 3 דוגמאות לגן מבוטא בחלבון שמשו כפל באמצעות פלסמידים ולהיכן הם עושים טרנסקריםציה

Answer 31

גן לאינטרפרון –
o נשבט את הגן באמצעות E.coli לייצור פלסמידים רקומביננטיים.
o נפיקאתהפלסמידיםמהחיידקים.
o נבצע טרנספקציהבתאיעכברכדילקבלאתביטויהגןלאינטפרוןברמתהחלבון.
2. תרכיב חיסון HBV - כנגד וירוס HBV( o נשבט את הגן באמצעות E.coli לייצור פלסמידים רקומביננטיים.
o נפיקאתהפלסמידיםמהחיידקים.
o נבצעטרנספקציהבתאישמריםכדילקבלאתביטויהגןברמתהחלבון..
3. Haemophilia Factor VIII – גן שעוזר לקרישת דם, נרצה להחדיר אותי לחולי המופיליה שסובלים מדימומים
o נשבט את הגן באמצעות E.coli לייצור פלסמידים רקומביננטיים.
o נפיקאתהפלסמידיםמהחיידקים.
o נבצעטרנספקציהבתאיאוגרכדילקבלאתביטויהגןברמתהחלבון.

Question 32

מהי רמת הביטוי, כושר העיבוד, ועלות הגידול של גן זר בחיידק,שמר,תא יונק

Answer 32

חיידק- גבוהה אין נמוכה
שמר - גבוהה חלקי נמוכה
תא יונק - נמוכה מלא גבוהה

Question 33

מהו אינטרפרון

Answer 33

הדבקה בנגיף אחד יכולה לסייע לגוף להתגונן מפני נגיף אחר. האינטרפרון הוא חומר שהגוף מייצר באופן טבעי, ומפריע לתרגום המידע הגנטי של נגיפים, שהוא שלב חיוני בתהליך הייצור של חלבונים נגיפיים.
קבוצת מחקר ישראלית פעלה לייצור אינטרפרון מבני אדם למטרות רפואיות. כדי להשיג כמות מספק של אינטרפרון ביתא, החליט הצוות להשתמש ברקמה אנושית צעירה וזמינה – עורלות.
התהליך שעשתה קבוצת המחקר:
􏰀 בידוד הגן שמקודד לאינטפרון ביתא באדם מתוך העורלות. 􏰀 החדירו את הגן לחיידקים ולשמרים – לא היה מוצלח מכיוון שלא הייתה הפרשה של אינטרפרון. 􏰀 אחרי ניסויים רבים הצליחו לייצר אינטרפרון ביתא בתרביות של תאי שחלה מאוגרים סיניים.
באמצעות שיטות של הנדסה גנטית – טרנספקציה, פיתחו תאים שהכילו עד 100 עותקים של הגן אינטרפרון ביתא, ובדרך זו הפכו את התאים ל”בתי חרושת” יעילים לייצור אינטרפרון בעל מבנה כימי זהה לזה של בני אדם.

Question 34

PCR

Answer 34

Polymerase Chain Reaction - “תגובת שרשרת של פולימראז”.
שיטה מדעית בביולוגיה מולקולרית להגברת מקטעי דנ”א למיליון עותקים פי מיליארד במספר שעות ועם כמויות זעירות של גן.
כלומר, העלאת מספר העותקים של כל גן )קטע דנ”א מוגדר( במהירות ללא צורך בשיבוט. הדרישה היחידה היא ידע מוקדם של רצף הבסיסים בשני קצוות הרצף המבוקש.

Question 35

מה השימושים ב pcr

Answer 35

אבחון מחלות גנטיות )קוסטף, CF(.

אבחון טרם לידתי של מחלות תורשתיות )למשל בדיקת סיסי שלייה בשבוע ה-8 להריון(
􏰀 ביצוע ניתוח השוואתי של דנ”א מאוכלוסיות שונות, כולל דנ”א ממינים נכחדים
. 􏰀 בדיקת חיידקים.
􏰀 בדיקת אבהות. 􏰀
פענוח פשעים – זיהוי פלילי )גנטיקה משפטית(.

Question 36

כיצד מתבצעת בדיקת אבהות

Answer 36

הצופן הגנטי של כל אדם בא בחציו מהאם ובחציו מהאב.
􏰀 השוואת רצפי הדנ”א של הצאצא ושל ההורה המשוער נעשית באמצעות שיטה נפוצה ביותר הנקראת
)Restriction Fragment Length Polymorphism (RELP. השיטה מבוססת על בדיקת האורך של מקטעי דנ”א שנחתכו באותה צורה אצל שני הנבדקים.
o מפיקיםדנ”אמדןאומתאיםאחריםשלהאם,הילדוהאבהנבדק.
o חותכיםאתהדנ”אלמקטעיםקטניםע”יאנזיםרסטריקציה,שיודעלזהותולחתוךמקטעי
דנ”א מסוימים.
o לאחרהחיתוךאפשרלהשוותאתאורךמקטעיהחומרהגנטישהתקבלומהילדלאלהשל
שני ההורים.
o חצימהמקטעיםשלהצאצאיהיוזהיםלמקטעיםשלהאבהביולוגיוהחציהשנייהיהלזהה
לאם.
􏰀 לטכנולוגיה הזו 99% אחוזי הצלחה.

Question 37

מה יכולים להוות מקור לדנא

Answer 37

דם )כדוריות לבנות(
􏰀 זיעה )תאי עור(  
􏰀 נוזל זרע )תאי זרע( 
􏰀 שיער 
􏰀 שיניים
 􏰀 עצמות 
􏰀 רקמות שונות 
􏰀 מאובנים

למה לא תאי דם אדומים? כי אין להם גרעין

Question 38

מה דרוש במבחנה בביצוע pcr

Answer 38

דגימת דנ”א
􏰀 שני תחלים התוחמים את הקטע שאותו רוצים להגביר 􏰀
נוקלאוטידים )G ,C ,T ,A(
􏰀 דנ”א פולימראז

Question 39

מהם השלבים במחזור אחד ב pcr

Answer 39

דנטורציה – הפרדת גדילי הדנ”א באמצעות חימום לטמפ’ של
C ̊94 למשך 5 דקות.
2. איחוי – הוספת הפריימרים באמצעות חימום לטמפ’ של
C ̊50 במשך חצי דקה )משך זמן החימום
תלוי באורך הפריימרים, רצף הפריימרים ידוע מראש(. 3
. התארכות )סינתזה( – יצירת שני גדילי דנ”א באמצעות נוקלאוטידים ואנזים Taq דנ”א פולימראז
)אנזים דנ”א פולימראז עמיד לחום( באמצעות חימום לטמפ’ של C ̊72 למשך 5 דקות.
Taq דנ”א פולימראז – אנזים שמופק מחיידק
Bacterium Thermus Aquaticus שהטמפ’ האופטימלית עבורו
היא C ̊72.

Question 40

RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)

Answer 40

שימוש ב mRNA וברוורס טרנסקריפטאז במקום בד-נ-א שמכיל אינטרונים

Question 41

Real time pcr

Answer 41

Quantitative PCR – שיטה לכימות של ביטוי הגנים.
􏰀 ראקציית ה-PCR מבוצעת במבחנות חדירות לאור ובנוכחות פלואורופור - חומר פלורסנטי דוגמת SYBR-GREEN המסתפח לדנ”א דו גדילי.
􏰀 פליטה פלואורסצנטית מזוהה על ידי גלאי, ומועברת למחשב לניתוח הקובע מהו מספר מחזורי PCR הנדרשים כדי להגיע, לדוגמה, לרמת פלואורסנציה משמעותית מעבר לרמת הרקע.
כימות הדנ”א יכול לשמש להשוואה עם תהליכי PCR אחרים כדי לדעת כמה תוצר מתקבל.

Question 42

מהו הצ’יפ הגנטי - )Chromosomal Microarray Analysis (CMA

Answer 42

בצי’פ גנטי מבצעים אנליזה מפורטת של כרומוזומים. הבדיקה מאפשרת לבדוק בבת אחת אזורים
רבים )מאות אלפי אתרים( בכרומוזומים של הנדבק.
􏰀 הצ’יפ הגנטי בוחן אם יש בחומר הגנטי )כרומוזומים( של הנבדק עודף או חוסר של מקטע העלול לגרום לו לפיגור שכלי, אוטיזם או תסמונת גנטית קשה אחרת.
􏰀 לנשים בהריון מעל גיל 35 מדינת ישראל מאפשרת לבצע בדיקת צ’יפ גנטי כדי לאתר מחלות תורשתיות או גנטיות, הנובעות מעודף או חוסר של מקטע באחד הכרומוזומים.
􏰀 בבדיקת הצ’יפ הגנטי לוקחים חומר מבדיקת מי שפיר וממצים ממנו את הדנ”א. באמצעות טכנולוגיה מיוחדת אפשר לקבל תוך זמן קצר את כל הפרופיל הגנטי של העובר.