Методи за типизиране Flashcards
Определение за “типизиране”
Вътревидово идентифициране на организмите.
Видове типизиране
Фенотипиране - експресия на външни характеристики;
Генотипиране - идентификация на организми чрез анализ на генетичен материал (ДНК или РНК);
Обикновено се използват комбинации от 2те;
Примери за фенотипиране
Антибиотична резистентност
Серотипиране
Фаготипиране
MLEE
Биотипиране
Протеинов профил - SDS PAGE
Ауксотипиране
Бактериоцинтипиране
Какво представлява серотипирането?
Експресия на антигенни компоненти на клетъчната повърхност. Анализът се прави чрез аглутинация върху предметно стъкло или епруветка. Широко използван при Salmonella spp., Shigella spp., E. coli, L. monocytogenes, V. cholerae.
Какво представлява фаготипирането?
Изполване на бактериофаги за разграничаване на база резистентност или чувствителност на щамовете.
Какво представлява фенотипирането на база АБ резистентност?
Разграничаване на щамовете на база чувствителност към антимикробни субстанции. Намира широка употреба в клиничната диагностика.
Принцип на MLEE
Multilocus enzyme electrophoresis се използва за установяване на мутации в гените, кодиращи бактериални метаболитни ензими, чрез разликата в тяхната миграция при електрофоретично разделяне. MLEE открива полиморфизъм само в кодиращия регион на гена.
Няколко ензими се тестват едновременно за установяване на вариации в тяхната електрофоретична мобилност, отразяващи генетични вариации под формата на алелни различия или мутации. Така се откриват генетични връзки, популационни структури и връзки между индивидите или популациите.
Предимства на MLEE
Висока дискриминативна способност
MLEE профилите са отлични епидемиологични маркери
Недостатъци на MLEE
Трудна интерпретация на резултатите;
MLEE профилите не са подходящи за бързо и отчетливо типиране;
Какво представлява Ауксотипирането?
Разграничаване на база изискванията към хранителните вещества.
Недостатъци на фенотипирането
По-слаба дискриминативна способност;
Промяна във фенотипните характеристики в зависимост от условията;
Кои са 2та основни подхода за генотипиране?
- Анализ на генетични локуси, продуциращи серологично реактивни компоненти;
- Анализ на вариации в генома, свързани косвено с различни сероварианти;
Предимства на генотипирането пред фенотипирането
По-бързи
Икономически ефективни
По-голяма дискриминативна и типизираща способност
По-добра възпроизводимост
Приложение на методите на генотипиране
Идентификация на генетични маркери от голямо значение за общественото здраве - гени за вирулентност, АБ резистентност;
Информация за филогенетичните взаимоотношения между организмите;
Съответствие с международната номенклатура по стандартизация за широк спектър от бактериални видове;
Методи за генотипиране без предварителна амплификация
- REA (restriction enzyme analysis)
- Southern blot
- PFGE (pulse field gel electrophoresis)
Принцип на REA (restriction enzyme analysis)
- ДНК се накъсва на фрагменти с помощта на рестрикционни ендонуклеази, които разпознават конкретни ДНК последователности;
- Разделяне на фрагментите чрез ГЕ;
- Визуализиране (флуоресценция или радиоавтография);
- Анализ - получените от различни проби модели от ДНК фрагменти се сравняват. Разликите в моделите индикират генетични вариации между пробите.
Принцип на Souther blot анализа
Първо протича стандартна ЕФ, след което разделените фрагменти ДНК се прехвърлят върху нитроцелулозна мембрана с концентриран солеви разтвор (с който е напоена абсорбираща хартия под гела), който се придвижва нагоре по капилярен път през гела към мембраната и абсорбиращата хартия върху нея. Позицията на ДНК върху НЦМ се запазва същата като в гела. Накрая НЦМ се хибридизира с белязани ДНК “проби”, комплементарни на целевите ДНК последователности.
Каква е разликата в приложението на стандартната ГЕ и Southern Blotting?
СЕГ се използва за анализ на неспецифични ДНК фрагменти - определяне на размера им, анализ на RCR продукти или на продукти от нарязване на ДНК с рестрикционни ензими.
При Southern Blotting се детектират специфични ДНК последователности (наличие на конкретни гени, подредба на гени, мутации или делеции).
Същност на PFGE
Миграция на фрагменти в агарозен гел при постоянно променяща се посока на електричното поле през определени интервали от време. Най-широко използван ДНК базиран метод за типизиране на патогенни бактерии в храните (L. monocytogenes, Salmonella, E.coli O157:H7, Shigella, C. jejuni).
ДНК фрагменти с каква големина се разделят при PFGE и в стандартните агарозни гелове?
до 10 000 кб спрямо само 75 кб
Какво е предимството на използването на променливо електрично поле в PFGE?
Предотвратява прекалено бързото придвижване на фрагментите в гела и подпомага ефективното придвижване на по-големите фрагменти.
Принцип на PFGE
Към бактериална суспензия се добавя разтопена агароза. Получената смес се отлива под формата на цилиндър. Агарозата се втвърдява и се добавя лизис буфер (разрушаване на клетките и освобождаване на ДНК). Промива се за отстраняване на клетъчните остатъци. Добавя се смес от рестрикционни ендонуклеази към отрязано малко парче от цилиндъра. Получените фрагменти (10-20) се разделят с пулсова ГЕ. Анализ на данните - сравняване на получения профил на даден изолат с тези от други изолати и определяне на произхода му.
Предимства на PFGE
Приложение за различни видове
Обмен на база данни
Лесна възпроизводимост
Добра разделителна способност
Достъпност
Недостатъци на PFGE
Трудоемка и продължителна процедура;
Висококвалифициран персонал за анализ на резултатите;
Една мутация - разлика в няколко фрагмента;
Принцип на МГМ за генотипиране СЪС предварителна амплификация
- Екстракция на ДНК;
- Амплификация на специфична ДНК секвенция с PCR;
- Разделяне на получените ампликони чрез ГЕ;
- Визуализиране и документиране на резултатите;
Видове МГМ за генотипиране
RAPD (random amplification of polymorphic DNA);
RFLP (restriction fragment lenght polymorphism);
rep-PCR (repetitive element PCR);
MLVA (multi-locus variable tandem repeat analysis)
CGH (comparative genomic hybridisation);
Принцип на RAPD
Анализ на генетичното разнообразие на индивидите на принципа на случайно праймиране - свързване на къси праймери (8-12 нд, с ниска Т на хибридизация) към дадено място от ДНК секвенцията на случаен принцип.
Приложение на RAPD
Помощно средство за изготвяне на генетични карти. Предпочита се при разграничаване на геном на голям брой видове, популации и т.н.
Предимства на RAPD
Бърз и лесен за изпълнение;
Не е необходима предварителна информация относно генома на целевия организъм;
Необходими са малки количества ДНК за анализ;
Недостатъци на RAPD
Слаба възпроизводимост;
Значително влияние на средата върху получения ДНК профил;
Отсъствие на PCR продукт при несъответствие между праймерите и ДНК матрицата;
Определение за “алел”
Една от алтернативните форми на гена (последователност от нуклеотиди), които могат да съществуват на определен локус върху хромозомата и могат да варират между индивидите в популацията.
Принцип на RFLP (полиморфизъм по дължината на рестрикционните фрагменти)
- Накъсване на ДНК с рестрикционни ендонуклеази;
- ГЕ;
- Southern blotting (прехвърляне върху мембрана и хибридизация);
- Детекция;
- Анализ - установяване на генетични вариации (алелни вариации или мутации в рестрикционните сайтове) между индивиди или популации;
Какво представляват SNPs?
Single nucleotide polymorphism е често срещана генетична вариация, която се наблюдава когато един нуклеотид от ДНК последоватеността, се замени с друг на определено място в генома.
Най-често срещаните генетични вариации в човешкия геном.
Приложение на RFLP
геномно картиране, локализация на гени при генетични заболявания, определяне на риска от дадено заболяване, тест за бащинство, родствени връзки, криминология, определяне на генетично разнообразие, анализ на моделите на размножаване в животинските популации;
Предимства на RFLP
ниска себестойност;
лесен дизайн;
не е необходима предварителна информация за анализираната ДНК;
добра възпроизводимост;
Недостатъци на RFLP
работи само с SNPs;
при някои видове има много ниска степен на полиморфизъм;
продължителна процедура;
необходими са специфични ендонуклеази;
невъзможност за автоматизация;
Същност на rep-PCR
Хибридизация на праймери към некодиращи междугенни повтарящи се последователности, разпръснати по целия геном. Образуват се множество ампликони, в зависимост от разпределението на повтарящите се елементи в генома.
Кои са 3те специфични праймера, които се използват в rep-PCR-а?
BOX - широко разпространени в бактериалния геном;
ERIC - ентеробактериални междугенни консенсуси;
REP - междугенни палиндромни последователност;
Принцип на rep-PCR
- Образуване на множество ампликони
- ЕФ разделяне
- Сравняване на ДНК профилите на анализираните бактериални изолати - различаване на видове, щамове и серотипове. Използва се за контрол на инфекциозни болести в много болнични заведения по цял свят.
Предимства на rep-PCR
Възможност за анализ на множество повтарящи се последователности;
Бърз и евтин;
Висока дискриминираща способност за голям брой бактерии;
Недостатък на rep-PCR
Ниска възпроизводимост
Същност на MLVA (multi-locus variable tandem repeat analysis)
Метод, определящ броя на тандемните повтори с вариращ брой (VNTR) в различни локуси в бактериалния геном.
Принцип на MLVA
- Изолиране на ДНК
- Амплифициране на тандемните повтори с мултиплексен PCR
- Анализ на получените ампликони с агарозна ГЕФ или ДНК секвенатор+капилярна ЕФ
генерира се уникален “профил” за всеки изолат на база броя повтори във всеки локус
Приложение на MLVA
Броят повтори във всеки локус се използва за изчисляване на генетичната отдалеченост и създаване на филогенетични дървета.
В молекулярната епидемиология за проучване на епидемии, проследяване на преноса на патогени във и между популациите, проследяване на еволюцията на микробните патогени във времето.
Предимства на MLVA
Висока дискриминираща способност
Евтин, бърз и лесен
Допълнение на PFGE
Недостатъци на MLVA
Слаба резолюция на агарозните гелове
Висококвалифициран персонал
Различни МО - различни протоколи
