Картиране на генома Flashcards
Какво представлява shotgun подходът за секвениране и картиране на генома?
Накъсване на ДНК на по-къси сегменти, определяне на секвенцията на всеки сегмент и търсене на застъпващи се участъци с компютърни програми за възстановяване на цялата секвенция. Широко използван за малки геноми.
По каква формула се изчисляват възможния брой застъпвания за n фрагменти?
2n^2-2n
Кои са проблематичните фактори при подреждането на застъпващи се фрагменти в цялостен геном?
Повтарящите се секвенции в генома;
Възможност за погрешно възстановяване на цялата секвенция с липсващи участъци или такива, които не са на мястото си.
Какво представлява генетичната карта?
Информация за местата на гените или на отделни дискретни участъци от генома.
Кои са подходите за секвениране на генома при наличие на генетична карта?
- Shotgun
- Clone contig
Определение за “контиг”
Набор от припокриващи се ДНК фрагменти, които заедно представляват консесусна област на ДНК.
Същност на clone sequencing
Метод за секвениране на генома, при който първо се картиране на всяка хромозома, след което ДНК се накъсва на фрагменти от по 150 килобази, които се клонират в бактериален плазмиден вектор. Бактериите се делят, намножавайки и ДНК фрагментите. Клонираната ДНК след това се накъсва на застъпващи се фрагменти от по 500 бази. Следва секвениране чрез вкарването на тези фрагменти във вектор с позната последователност и секвенирането започва от тази позната последователност към непознатата.
Определение за “геномно картиране”
Процес на определяне разположението на гени върху хромозомите.
Каква е основната разлика между clone sequencing and shotgun sequencing?
Clone sequencing налага картиране на генова преди секвенирането, съответно е по-времеемък, но по-точен метод.
Кои са 2те основни техники за картиране на генома?
- Генетично картиране - генетични техники;
- Физично картиране - молекуларно-биологични техники, акцентиране върху физичните параметри на гените;
Определение за “пълно геномно картиране” (WGM)
Високоефективна технология за щамово типизиране, сравнителна геномика и сглобяване на последователностите от пълното геномно секвениране. Лесно разграничаване между свързани и несвързани (родствени и неродствени) щамове.
Определение за секвениране на ДНК
Определяне на последователността на 4те основни никлеотидни бази в първичната структура на ДНК. В един експеримент могат да се секвенират само по няколкостотин нуклеотида.
Защо е необходимо комбиниране на техниките за секвениране с техники за картиране на генома?
За да се установи разположението на секвенирания ген в рамките на целия геном.
Какво представлява методът на Сенджър (метод на прекъснатия синтез)?
Метод за секвениране на ДНК, с използване на модифицирани ддНТФ, чието свързване към нарастващата ПНВ прекъсва нейния синтез на случайно място. Синтезира се поредица от вериги с нарастваща дължина. Провежда се в 4 отделни епруветки - една за всеки тип ддНТФ.
Какво трябва да е съотношението между нормалните дНТФ и модифицираните ддНТФ?
100 пъти по-малко ддНТФ
На какъв принцип се осъществява методът на Сенджър за секвениране (метод на прекъснатия синтез)?
PCR - евДНК, праймери, дНТФ (ддНТФ)
Как става разделянето на фрагментите ДНК, получени чрез методът на Сенджър (метод на прекъснатия синтез)?
Чрез полиакриламидна гелелектрофореза (PAGE) - 4 ивици, всяка от които отговаря на един от нуклеотидите.
Какви са начините за получаване на евДНК за анализ на секвенцията?
- Клониране на ДНК в плазмиден вектор (най-широко използвано).
- Клониране на ДНК във вектор М13 (фаг).
- Клониране на ДНК във фагмиди.
- Получаване на евДНК чрез PCR.
Как протича клонирането на ДНК в плазмиден вектор за анализ на секвенцията?
Срязване на плазмида с ендонуклеази - съшиване на ДНК фрагмента към плазмида - превръщане в едноверижна форма чрез алкално третиране или чрез нагряване.
Как протича клонирането на ДНК във вектор М13 за анализ на секвенцията?
Фаг М13 има евДНК като геном.
E. coli се инфектира с фага, където става превръщането на ДНК в дв репликативна форма. Тя се копира до получаване на 100 такива рекомбинантни молекули и около 1000 фагови частици се освобождават от бактерията. (само 3кб)
Определение за “фагмид”
Клониращ плазмиден вектор, който съдържа участъци от плазмид и участъци от фаг М13 или друг фаг с едноверижен геном. (над 10кб)
Как се модифицират праймерите при PCR за получаване на пречистена евДНК?
Един от праймерите се свързва с фини метални частици. Пречистването става с магнитно поле.
Какво е приложението на thermal cycle sequencing?
Използване на двДНК за секвениране - премахване на необходимостта от клониране и получаване на евДНК. Стандартна PCR реакция, при която се използва един праймер - копира се само едната верига, т.е. има линейно нарастване. Във всяка реакционна смес се поставя само един ддНТФ. Получените фрагменти се анализират с PAGE.
Кои са методите за разчитане на ДНК секвенцията?
- Авторадиография
- Автоматично секвениране
Кои са етапите на автоматичното секвениране?
- Верижно терминиране с флуоресцентно белязани ддНТФ
- Капилярна ЕФ
- Лазерна детекция на сигнала
Какъв е принципът на авторадиографията за разчитане на ДНК секвенцията?
Използване на изотопи:
фосфора 33 и сяра 35 - добро разделяне, но слабо излъчване;
фосфор 32 - висока енергия, но слаба разделителна способност;
Всяка ивица трябва да се чете по отделно.
Какъв е принципът на разчитането на ДНК секвенцията чрез използване на флуоресциращи спредшественици?
Всеки тип ддНТФ се свързва с различен флуоресцентен маркер - различаване от флуоресцентния детектор. 4те реакции могат да се провеждат в една епруветка и 4те семейства фрагменти да се разделят в един слот на PAGE!
Прочитането на секвенцията става автоматично с преминаването през детектора с компютърна програма.
Принцип на капилярната ЕФ
Инжектиране на полутечен полимер в капилярна тръбичка. Пропускане на пробата с ДНК фрагменти през тръбичката, с лазер и детектор, отчитащ флуоресцентно белязаните ддНТФ. Генерира се последователност от светни блокове, всеки от които отговаря на определе нуклеотид.
Принцип на метода за секвениране на ДНК на Maxam & Gilbert
Химично разграждане на ДНК с различни химични агенти, разкъсващи фосфодиестерни връзки между определени нуклеотиди. Получават се ДНК фрагменти с различни размери и завършващи с определен нуклеотид.
Етапи на метода за секвениране на ДНК на Maxam & Gilbert
- Белязане (Р32 откъм 5’ края) и дисоциация на веригите (при 90оС и с добавяне на DMSO - диметилсулфоксид);
- Разделяне на 2те вериги на ДНК чрез гел ЕФ (различно съдържание на пурини и пиримидини в 2те вериги)
- Химично разрушаване на веригата - 4 проби, всяка третирана с различен химичен агент - получените фрагменти се разделят с PAGE и се визуализират чрез авторадиография.
Какви химични агенти се използват за фрагментиране на евДНК вериги в метода за секвениране на Maxam & Gilbert?
- диметил сулфат - селективно атакува А и Г;
- хидразин - атакува Т - Ц;
Какво представлява SLST?
Single locus sequence typing (SLST) е молекулярен метод за охарактеризиране на бактериални щамове на база последователности на единични локуси или гени. Използва се, когато е известен специфичен ген или локус, който е високовариабилен и информативен за разграничаването на MO до ниво щам.
Кой е най-широко използваният метод от групата на SLST?
Типизиране на гена за синтез на протеин А в генома на Staphylococcus aureus.
Етапи в SLST
- PCR амплификация на таргетния локус и секвениране по метода на Сенджър или др.
- Сравняване и анализ за идентифициране на генетични вариации
Значение на SLST
Чрез сравняването на секвенциите на целевия локус в различни изолати, може да се определи генетичната родственост на бактериални щамове и да се проследи разпространението на патогени сред населението (от голяма важност за разбиране на предаването на заболявания и вземането на ефективни контролни мерки).
Определение за “housekeeping” гени
Гени, кодиращи синтеза на ензими, участващи в първичния метаболизъм на организмите, и присъстват във всички представители на даден вид.
Същност на MLST
Multilocus sequence typing е метод, базиращ се на PCR амплификация и последващ секвенционен анализ на вътрешни последователности на 6-8 “housekeeping” гена. Секвенциите на всеки от тези локуси се сравнява с всички познати алели на съответния локус и всеки алел получава “алелен номер”. Идентичните последователности имат един и същ алелен номер, като не се разглеждат нуклеотидните различия между алелите.
Алелен профил
Комбинация от алелите на изследваните в дадения вид локуси. За всеки патоген се създава алелен профил и секвенционен тип (ST).
Кои са предимствата на MLST?
- висока възпроизводимост и продуктивност;
- висока дискриминираща способност;
- свободен софтуер за стандартизиране и интерпретиране на резултатите;
- напълно автоматизиран процес;
Кои са недостатъците на MLST?
трудоемък, скъп и продължителен метод
Принцип на пиросеквенирането
Определяне на реда на присъединяване на дНТФ в процеса на синтез на веригата. Нуклеотидите се добавят поотделно. Ако нуклеотидът се свърже се отделя молекула пирофосфат, която се превръща в еквимоларно количество АТФ под действие на ензима сулфурилаза. АТФ е субстрат на ензима луцифераза, катализиращ превръщането на АТФ в светлина в присъствие на луциферин и кислород. Отделената светлина се отчита с детектор. Ако дНТФ не се свърже, той бива разграден от ензима апираза.
Ензими, участващи в процеса пиросеквениране
Сулфурилаза
Луфифераза
Апираза
Какво е ограничението в размера на секвенирания фрагмент в един експеримент при метод на Сенджър?
около 400 нд
Нови методи за секвениране - примери
Пиросеквениране
ДНК чипове за секвениране
Пълно геномно секвениране - “next generation sequencing”, “second generation sequencing”, “high-throughput sequencing”
Какво представляват ДНК чиповете за секвениране?
Чипове, съдържащи серия от различни олигонуклеотидни секвенции за секвениране. Чипът носи всички възможни варианти на 8-мерен олигонуклеотид. Секвенираната ДНК се бележи с флуоресцентен маркер. Чипът се третира с ДНК молекулите, които ще се секвенират и се проследяват местата, където става хибридизация, чрез конфокална микроскопия. Всяка хибридизация показва 8-нуклеотидна секвенция. Цялата ДНК секвенция се определя чрез застъпване на секвенциите на хибридизиралите участъци.
Недостатък на ДНК чиповете за секвениране
Малка големина на секвенираните секвенции - до 1 кб
Разлика в приложението на агарозните и полиакриламидните гелове
Агарозните се използват за разделяне на по-големи ДНК и РНК фрагменти, докато ПАА за по-малки фрагменти с висока резолюция (по-малки пори на гела).
