Введение в Молекулярную Биологию (книга Э. Рис) Flashcards
Органеллы
— это находящиеся в клетке субструктуры, которые выполняют те или иные специфические функции. Размеры органелл варьируют от 20 нм до 10 мкм.
Гены
Гены заключают в себе информацию, однозначно определяющую структуру и функцию клетки.
Все гены состоят из ДНК (дезоксирибонуклеиновой кисло- ты), и каждая отдельная клетка может содержать многие тысячи таких генов.
Гены, однако, присутствуют там не в виде отдельных фрагментов молекулы ДНК, а входят в состав более крупных структурных единиц, называемых хромосомами.
Вирусы
Вирусы можно считать просто некой совокупностью (ансамблем) макромолекул.
Диаметр вирусной частицы составляет от 20 до 300 нм. Таким образом, вирусы значительно меньше самых мелких клеток и не способны к самовоспроизведению без содействия синтезирующего аппарата клетки-хозяина.
Вирусы можно также условно отнести к одному из двух типов на основе принадлежности клетки-хозяина к прокариотам или эукариотам.
Макромолекулы
Макромолекулы — белки, нуклеиновые кислоты и полисахариды — представляют собой гигантские молекулы, размеры которых варьируют от 3 до 300 нм.
Одна из самых больших ма- кромолекул — белок коллаген, компонент соединительной ткани: ее длина около 300 нм, длина же большинства макромолекул лежит в диапазоне 4—20 нм.
Малые молекулы
Малые молекулы как правило, имеют диаметр от 0,5 до 1 нм. Особенно важную роль в биологии играют три класса малых молекул — аминокислоты, нуклеотиды и моносахариды.
Они служат «кирпичиками», из которых строятся полимерные биологические макромолекулы (белки, нуклеиновые кислоты и полисахариды соответственно).
Прокариотическая клетка
— простейший тип живой клетки.
К прокариотам относятся такие одноклеточные организмы, как бактерии и синезеленые водоросли. Определяющей особенностью прокариотической клетки является наличие прямого контакта между ее хромосомой и цитоплазмой. Хромосомы эукариотической клетки, напротив, заключены в мембранную структуру — ядро. От эукариотических клеток прокариоты отличаются, кроме того, отсутствием митохондий и хлоропластов, меньшими размерами рибосом (их коэффициент седиментации 70S), а также весьма ограниченной — из-за наличия клеточной стенки - способностью выделять и поглощать крупные молекулы.
Хромосома в прокариотической клетке
Хромосома в прокариотической клетке всего одна. Она представляет собой непрерывный кольцевой тяж двухцепочечной ДНК. Молекула ДНК может достигать длины около 1 мм (например, у бактерии Е. coif); в клетке она обычно туго скручена в компактную спиральную структуру). Существуют также внехромосомные ДНК-содержащие элементы — плазмиды. Это маленькие кольцевые структуры, несущие лишь по нескольку генов; некоторые из них могут кодировать такие ферменты, благодаря которым клетка становится устойчивой к различным антибиотикам.
Плазматическая мембрана клетки
Плазматическая мембрана клетки состоит из липидов и белков. Она служит полупроницаемым барьером, контролирующим перенос малых молекул и ионов в клетку и из клетки.
Мезосома
Мезосома представляет собой впячивание плазма- тической мембраны в цитоплазму. Она содержит многослойную мембранную систему, которая своей цитоплазматической стороной часто связана с ДНК. Считается, что мезосомы участвуют в клетке в двух разных процессах: они могут служить местом прикрепления ДНК (особенно во время репликации) и играть определенную роль в секреции.
Клеточная стенка
Клеточная стенка расположена снаружи от плазматической мембраны и покрывает всю клетку. Она сообщает клетке жесткость, придает ей определенную форму, а также защищает ее от повреждения при осмотических и механических воздействиях. У бактерий клеточная стенка представляет собой жесткую сеть из липидов, полисахаридов и белков. В структурном отношении бактериальная клеточная стенка бывает в основном двух типов; в соответствии с этим бактерии разделяют на грамположительные и грамотрицательные.
У синезеленых водорослей клеточная стенка построена из простых полисахаридов, таких как целлюлоза.
Желатиновый слой
Желатиновый слой (гликокаликс) — самый на- ружный слой прокариотической клетки; чаще всего он встречается у синезеленых водорослей.
Жгутик
— белковая органелла, отходящая от поверхности клетки в виде вытянутого отростка длиной от 1 до 20 мкм. С помощью жгутиков клетка перемещается в жидкой среде.
Рибосома
— сложная органелла, в которой осуществляется синтез белка.
В связи с тем что бактерии размножаются с высокой скоростью, рибосомы могут составлять до 40% массы клетки. Рибосома — это комплекс молекул белков и РНК (рРНК), образующих почти сферическую частицу диаметром 20 нм. В рибосоме можно выделить две части — большую и малую субчастицы. Большая субчастица состоит из 34 разных белков, связанных с большой (23S) и малой (5S) молекулами рРНК. Малая субчастица содержит 21 белок и молекулу рРНК среднего размера (16S).
Энергия в прокариотической клетке
Энергия для процессов биосинтеза в прокариотической клетке поступает из двух основных источников. Первый — это нуклеозидтрифосфат, АТР, который образуется в результате катализируемого группой ферментов гликолиза за счет энергии, содержащейся в молекулах такого рода питательных веществ, как гексозы (например, глюкозы. Энергия, запасенная в АТР, может затем использоваться множеством разных ферментов в анаболических (биосинтетических) процессах.
Второй, самый важный источник энергии — это АТР, синтезируемый с помощью группы белков, расположенных рядом друг с другом в плазматической мембране и образующих так называемую цепь переноса электронов. Эта цепь, в конце которой происходит восстановление кислорода до воды, получает электроны от атомов водорода, продуцируемых в цикле Кребса при окислении кислотных субстратов. Образующиеся ионы Н+ «откачиваются» через бактериальную мембрану транспортными белками, в результате чего между вне- и внутриклеточным пространством возникает разность рН и электрического потенциала. Запасенная в таком электрохимическом градиенте свободная энергия используется для синтеза молекул АТР в расположенных в мембране так называемых F1-частицах.
Энергия в фотосинтезирующих клетках
Фотосинтезирующие клетки, такие как синезеленые водоросли и фотосинтезирующие бактерии, производят энергию для метаболических процессов, поглощая энергию видимого света. У синезеленых водорослей фотосинтетические мембраны — ламеллы - содержат специальные пигменты, функция которых состоит в поглощении световой энергии и превращении ее в химическую для синтеза АТР. Поскольку прокариотические водоросли способны использовать диоксид углерода в качестве единственного источника углерода, т.е. могут «фиксировать» углерод, включая его в сложные молекулы, их называют автотрофами.
Фотосинтезирующие бактерии
содержат специальные белки, например бактериородопсин, располагающиеся в плазматической мембране и реагирующие на свет созданием протонного градиента путем перекачивания ионов Н+ через мембрану в одном направлении. Энергия возникающего таким образом электрохимического градиента используется затем для обеспечения синтеза АТР. Эти бактерии отличаются, однако, от синезеленых водорослей тем, что они неспособны фиксировать СО2. Для осуществления биосинтеза они вынуждены извлекать углерод из уже существующих органических молекул, и по этой причине их называют гетеротрофами.
Эндоцитоз
или поглощение белков и других макромолекул, находящихся в контакте с клеточной поверхностью, у прокариот происходит редко, однако у них возможен экзоцитоз.
Размножение прокариот
происходит неполовым путем. Каждая прокариотическая клетка делится на две в результате процесса, называемого митозом; с дочерними клетками происходит то же самое, и т. д.
Эукариотическая клетка
обладает целым рядом структурных особенностей, которые отсутствуют в более простой, прокариотической клетке. Из эукариотических клеток состоят многие самые разнообразные организмы: высшие растения, многоклеточные животные, грибы и одноклеточные амебы. Отдельные клетки из различных частей какого-либо высшего организма могут существенно отличаться друг от друг по морфологии и функции. По этой причине на представленной схеме отражены лишь главные черты большинства эукариотических клеток.
Ядро
Ядро содержат нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК), белки, а также небольшие молекулы и ионы, окруженные ядерной мембраной, состоящей из липидов и белков. Эукариотическая ДНК упакована в отдельные хромосомы, число которых варьирует в зависимости от вида (так, у человека в каждой диплоидной клетке 46 хромосом, а у огурца — 14).
Диплоидная клетка
— это клетка, содержащая по две копии каждой хромосомы. Таким образом, в каждой клетке человека находится 23 пары хромосом, и диплоидное число их равно 46.
Гаплоидная клетка
содержит только по одной копии каждой хромосомы, и, следовательно, гаплоидное число хромосом у человека равно 23.
Эукариотические хромосомы
ДНК в ядре обычно находится в комплексе с белками. Такие ДНК-белковые комплексы называются хроматином (гл. 26). Непрерывные нити хроматина, уложенные определенным образом, составляют хромосому. Приблизительно в центре каждой хромосомы имеется плотный, суженный участок, известный под названием центромеры. В этом месте хромосома прикрепляется к митотическому веретену во время деления (гл. 29).
Ядрышко
представляет собой область внутри ядра, где локализованы гены, кодирующие три (28S, 16S и 5,8S) из четырех молекул рибосомных РНК. Плотная, волокнистая центральная зона ядрышка содержит ДНК-белковые комплексы; здесь происходит транскрипция генов рибосомных РНК.
Центриоли
Центриоли (обычно их две) лежат вблизи ядра. Каждая центриоль построена из цилиндрических элементов (микротрубочек), образованных в результате полимеризации белка тубулина. Девять триплетов микротрубочек расположены по окружности, как показано на рисунке. Центриоли принимают участие в формировании цитоплазматических микротрубочек (гл. 39) во время деления клетки и в регуляции образования ми- тотического веретена. В клетках растений центриолей нет, и митотическое веретено образуется там иным способом.
Ядерная мембрана
состоит из двух слоев, разделенных перинуклеарным пространством. По всей поверхности ядерной мембраны равномерно распределены ядерные поры. Так называемый поровый комплекс ядра имеет гранулярную структуру — белковые гранулы располагаются по границе округлого центрального отверстия таким образом, что каждая гранула находится в вершине правильного восьмиугольника. Перенос веществ осуществляется главным образом через центральные области пор и происходит, по-видимому, как из ядра в цитоплазму, так и в обратном направлении.
Плазматическая мембрана эукариот,
как и у прокариот, состоит из белков, углеводов и липидов. Она ограничивает полость, внутри которой помещаются клеточные компоненты. Некоторые органеллы, такие как комплекс Голъджи, напрямую связаны с поверхностью мембраны; другие же, как, например, эндоплазматинеский ретикулум (шероховатый и гладкий), непосредственно с плазматической мембраной не контактируют.
Клеточная стенка
имеющаяся только у растений, лежит снаружи от плазматической мембраны. Она состоит из большего число слоев; каждый слой образован длинными цепями целлюлозных волокон. Такая структура придает клетке жесткость
Цитоплазма
В цитоплазме эукариотических клеток можно выделить восемь структурных компонентов, объединенных под общим термином органеллы.
Эукариотическая рибосома, имеющая коэффициент седиментации 80S, крупнее своего прокариотического аналога, равно как и обе ее субчастицы: большая (60S) малая (40S) (гл. 24).
Гладкий эндоплазматический ретикулум (ГЭР) представляет собой систему гладких внутриклеточных мембран. В этой органелле локализованы многие ферменты (в частности, оксидазы), катализирующие ре- акции обезвреживания ядовитых веществ. Помимо этого, на мембранах ГЭР протекают синтез липидов, а также гидролитическое расщепление гликогена (гликогенолиз).
Шероховатый эндоплазматический ретикулум
(ШЭР) — это тоже система внутриклеточных мембран, которые выглядят шероховатыми из-за прикрепленных к ним многочисленных рибосомных частиц. Часть ШЭР находится в прямом контакте с ядерной мембра- ной. На мембранах ШЭР синтезируются белки, пред- назначенные либо для секреции во внеклеточную среду, либо для включения в плазматическую мембрану.
Комплекс Голъджи представлен собранными в стопки дисковидными мембранами и связанными с ними многочисленными пузырьками. Эта органелла располагается обычно между ШЭР и плазматической мембраной. Здесь происходит модификация белков (например, гликозилирование), предназначенных для секреции во внеклеточную среду или для включения в плазматическую мембрану. На рисунке стрелками по- казан путь белков из ШЭР к комплексу Гольджи и в конечном итоге к плазматической мембране.
Диктиосома, обнаруженная у растений, выполняет ту же самую функцию, что и комплекс Гольджи у жи- вотных. По-видимому, она принимает участие также в синтезе и секреции компонентов клеточной стенки.
Митохондрия — это палочкообразная органелла диаметром около 1 мкм и длиной до 7 мкм. Она имеет двойную мембрану, разделяющую ее на два компарт- мента. Область, ограниченная складчатой внутренней мембраной (складки называются кристами) и известная под названием митохондриального матрикса, содержит рибосомы и митохондриальную ДНК — коль- цевую двухцепочечную молекулу, кодирующую не- которые митохондриальные белки. Во внутренней мембране локализован фермент, ответственный за синтез АТР, — так называемый F1-комплекс. В ком- партменте, заключенном между наружной и внут- ренней мембранами, находятся субстраты, ферменты и некоторые метаболиты. Число митохондрий в од- ной-единственной клетке может достигать несколь- ких тысяч.
Хлоропласт — это органелла, по размерам (5—10 мкм в диаметре) примерно такая же, как эритроцит, а по форме напоминающая двояковыпуклую линзу. Он представляет собой комплекс мембран: двойной на- ружной и складчатых внутренних, организованных в виде стопок дисков. Эти диски, называемые тилакои- дами, содержат компоненты фотосинтезирующего ап- парата.
Цитоскелет — обязательный компонент всех эука- риотических клеток (гл. 39) — представляет собой сложную сеть филаментов, пересекающих клетку в различных направлениях (на рисунке не изображен).
Секреции белков
Секреции белков предшествует последовательность событий, начинающихся с переноса белковой цепи, синтезированной на рибосомах, во внутреннюю полость ШЭР, которая называется цистерной. После этого белок в составе специфических везикул транс- портируется в комплекс Гольджи, откуда выделяется во внеклеточную жидкость. Мембранные белки, предназначенные для включения в плазматическую мембрану, лишь частично входят в цистерну ШЭР. Основная часть белковой цепи остается каким-то образом связанной с мембраной ШЭР. Фрагмент белка, обращенный в сторону цистерны ШЭР, может быть частично гликозилирован, т. е. с помощью специальных ферментов к нему могут быть присоединены молекулы Сахаров. Как и в случае секретируемых полипептидов, белок переносится затем в комплекс Гольджи, где
завершается гликозилирование и происходят другие модификации. Процесс заканчивается транспортом белка к плазматической мембране.
Энергия в эукариотических клетках
вырабатывается в цитоплазме и митохондриях (у животных и растений) или в хлоропластах (только у растений) и запасается в молекулах нуклеозидтрифосфата, АТР. Эта молекула является наиболее универсальным источником энергии, хотя в некоторых реакциях могут использоваться и другие нуклеозидтрифосфаты, например GTP. АТР образуется в цитоплазме в результате разнообразных катаболических процессов, таких как гликолиз, а энергия, запасенная в трифосфатной группе, расходуется в ходе биосинтетических (анаболических) реакций. Основное место синтеза АТР у животных — это митохондрия, а у растений — хлоропласт.
Межклеточные контакты
Соединения между эука-риотическими клетками образуются за счет специальных участков плазматической мембраны или клеточной стенки, называемых межклеточными контактами. В качестве примеров межклеточных контактов можно назвать десмосому, плотный контакт и плазмодесмы.
половое размножение
Термин половое размножение применительно к высшим растениям и животным означает, что новый организм развивается из одной-единственной клетки (зиготы), образовавшейся при слиянии двух гамет, каждая из которых представляет собой гаплоидную клетку. Так, у человека зигота — это продукт слияния мужской половой клетки, сперматозоида, и женской половой клетки, яйцеклетки.
Митоз
Митозом называется такой процесс деления диплоидной клетки (гл. 29), когда в результате появляются две идентичные и тоже диплоидные клетки. Это нормальный способ воспроизведения эукариотических клеток.
Мейоз
Мейоз — это особый тип деления, приводящий к образованию двух гаплоидных клеток из одной дипло- идной и сопровождающийся, следовательно, уменьшением числа хромосом. Этому делению подвергаются те клетки, из которых формируется следующая генерация гамет, или половых клеток.
ВИРУСЫ
— частицы, содержащие нуклеиновые кислоты, белки, а иногда и липиды и способные раз- множаться лишь в клетке-хозяине. Вне клетки вирусы не могут реплицироваться, поскольку у боль- шинства из них нет ферментов, необходимых для полного воспроизведения зрелой вирусной частицы. Диаметр вирусных частиц (их называют также вирионами) равен 20—300 нм. Таким образом, они намного меньше, чем даже мельчайшие из прокариотических клеток. Так как размеры белков и не- которых нуклеиновых кислот находятся в диапазоне 2—50 нм, вирусную частицу можно было бы считать просто комплексом макромолекул. Вследствие их малых размеров и неспособности к самовоспроизведению вирусы часто относят к разряду «нежи- вого».
ДНК-СОДЕРЖАЩИЕ ВИРУСЫ
несут в качестве генетического материала либо одно-, либо двухцепочечную ДНК, которая может быть как линейной, так и кольцевой. В ДНК закодирована информация обо всех белках вируса. Вирусы классифицируют в зависимости от того, одно- или двухцепочечная у них ДНК и про- или эукариотической является клетка-хозяин. Вирусы, заражающие бактерии, называются бактериофагами.
Структура вируса
Структура вируса в принципе такова: это молекула ДНК в белковой «обертке», называемой капсидом. Существует, однако, множество разных вариантов строения вирусов — от просто покрытой белком ДНК (например, бактериофаг РП) до сложных макромоле- кулярных комплексов, окруженных мембранными структурами (например, вирус оспы). Если у вируса есть мембрана, говорят, что он в оболочке, а если мембраны нет, вирус называют «раздетым». Различают четыре основных класса капсидов ДНК-содержащих вирусов: спиральные, икосаэдрические, сложные без оболочки, сложные с оболочкой.
Спиральные капсиды
Спиральные капсиды обычно встречаются у нитевидных вирусов. Они образуются путем самосборки асимметричных белковых субъединиц (капсомеров), объединяющихся в трубчатую структуру со спиральной симметрией (например, у РП). Субъединицы в большинстве случаев гомогенны, так что поверхность вириона состоит из множества копий одного и того же белка, хотя под наружным капсидом могут находиться и другие белки. ДНК в таких вирусах либо вытянута, либо может быть туго скручена в комплексе со специальными связывающими белками
Икосаэдрические капсиды
Икосаэдрические капсиды свойственны большинству сферических ДНК-содержащих вирусов. Икосаэдр — это многогранник с двадцатью треугольными гранями, имеющий кубическую симметрию и приблизительно сферическую форму. Вершины треугольников, соединяясь, образуют соответственно двенадцать вершин икосаэдра; в местах соединения располагаются обычно пентамерные белковые структуры — пентоны; там же могут находиться участки, на которых фор- мируются белковые нити, нередко ассоциированные с вершинами (например, у ф Х174 — см. рис. 4.1). Грани икосаэдра заполнены другими белковыми субъединицами, сгруппированными обычно в гексамерные структуры — гексоны (например, у аденовируса). Количество субъединиц, необходимое для заполнения граней, определяется размерами вириона в целом, и разные икосаэдрические вирусы содержат
поэтому разное число гексонов — обычно при неизменном числе пентонов. ДНК обычно плотно свернута внутри капсида; иногда она связана с белками или полипептидами, способными стабилизировать ее структуру.
Сложные капсиды без оболочки
Сложные капсиды без оболочки типичны для бактериофагов: они состоят из частей с разными типами симметрии. У бактериофага Т2, например, ДНК находится в икосаэдрической головке, а для «узнавания» бактерии и введения в нее ДНК служат трубчатые и фибриллярные структуры (в узнавании участвует также лизоцим, расположенный на дистальном конце хвостового отростка).
Сложные капсиды с оболочкой
Сложные капсиды с оболочкой есть только у вирусов эукариотических клеток. Они свойственны многим вирусам с нуклеоидом, состоящим из ДНК-белковых комплексов. Эти комплексы окружены одним или несколькими белковыми слоями, имеющими либо икосаэдрическую, либо нерегулярную симметрию, и наружной мембраной, почти все белковые компоненты которой являются по своему происхождению вирусными, а липидные структуры — клеточными.
Инфицирование
— процесс, посредством которого вирус внедряется в клетку-хозяина и «настраивает» ее метаболический аппарат на воспроизведение ви- рионов. Зараженные вирусом клетки либо остаются живыми (в этом случае говорят, что вирус невиру- лентен), либо подвергаются лизису, приводящему к высвобождению вирусных частиц. Неизменным итогом заражения клеток ДНК-содержащими бактериофагами является лизис. ДНК-содержащие вирусы животных вызывают лизис редко; клетки, однако, могут погибнуть из-за возникших при заражении хромосомных повреждений, вследствие иммуноло- гической реакции организма или просто в результате нарушения вирусом нормальных клеточных функ- ций.
Размножение вируса
— четко очерченный цикл,
приводящий в конечном счете, после синтеза новых молекул вирусных белков и большого числа копий вирусной ДНК, к формированию зрелых вирусных частиц. Хотя детали этого процесса могут различаться у разных ДНК-содержащих вирусов, по существу он универсален. У вирусов бактерий весь цикл может завершаться менее чем за час, тогда как у многих вирусов животных он занимает не один день.
Адсорбция вируса
Адсорбция вируса на клетке-хозяине — первый этап инфицирования. Она происходит на специфических рецепторных участках (белковых или липидных) клеточной поверхности, которые узнаются особыми выступающими частями вириона и к которым он прочно прикрепляется. У вирусов без оболочки такими частями могут быть белковые отростки (например, у аденовируса и бактериофага Т2), а у вирусов с обо- лочкой это, как правило, белки, погруженные в вирусную мембрану. В процессе адсорбции осуществляются, в частности, такие белок-белковые взаимодействия, результатом которых является инициация стадии проникновения Д Н К в клетку.
Проникновение вирусной ДНК в клетку-хозяина
Проникновение вирусной ДНК в клетку-хозяина происходит у разных вирусов по-разному. ДНК многих бактериофагов (например, бактериофага Т2) попадает в клетку, как предполагается, следующим образом: белковый стержень сплющивается, подобно телескопической конструкции, и ДНК «вспрыскивается» в бактерию. Из вирусов животных ДНК обычно переходит в клетку в результате как бы слияния наружного слоя вириона с клеточной мембраной. Это легко себе представить для вирусов с оболочкой: должно произойти про- сто слияние мембран; в случае же вирусов без оболочки все не столь ясно. В отличие от ДНК большинство бактериофагов ДНК вирусов животных всегда входят в клетку вместе с непосредственно прилегающими к ней белками; последующее освобождение ДНК от этих белков осуществляется с помощью ферментов.
Транскрипция и репликация
Транскрипция и репликация генетического материала вируса осуществляются обычно с участием ферментов клетки-хозяина. Сначала вирусная ДНК копируется РНК-полимеразами клетки-хозяина, в результате чего образуется мРНК, которая затем транслируется (гл. 25). На некоторых молекулах вирусной ДНК синтезируются также ее ДНК-копии — с помощью либо клеточной, либо кодируемой вирусом ДНК-полимеразы. Эти ДНК-копии используются впоследствии при сборке вирусных частиц. В некоторых случаях, например у бактериофага Т4, первые же новосинтезированные молекулы вирусной мРНК транслируются с образованием специальных белков, модифицирующих полимеразы клетки-хозяина таким образом, что те прекращают транскрипцию клеточных генов, не теряя при этом способности транскрибировать вирусные. В какой части клетки протекают процессы транскрипции и репликации вирусной ДНК: в ядре или в цитоплазме? Для бактериофагов такой дилеммы не существует; что же касается ДНК-содержащих вирусов животных, то, по-видимому, ни та, ни другая локализация не является для этой группы виру- сов единственно возможной: у одних транскрипция и репликация происходят в ядре клетки-хозяина (на- пример, у вируса герпеса), а у других — в цитоплазме (например, у поксвирусов).
Трансляция
Трансляция вирусной мРНК на рибосомах клетки-хозяина приводит к образованию вирусных белков. Некоторые из этих белков используются затем для построения капсидов, другие связываются с вирусной ДНК, вероятно, стабилизируя ее (у многих вирусов животных), а третьи, хотя и не войдут никогда в состав зрелых вирионов, участвуют в процессе их сборки в качестве ферментов (например, у бактериофага Т2).
Сборка вируса
Сборка вируса из его компонентов в клетке-хозяине может происходить спонтанно (и тогда она называется самосборкой), но может и зависеть от участия вспомогательных белков. Вирусная ДНК обычно покрывается слоем белка — капсидом. Капсид в свою очередь может заключаться в мембранную структуру, получаемую вирионом обычно от клетки-хозяина: покидая клетку путем отпочковывания от нее, вирусная частица оказывается окруженной плазматической мембраной.
РНК-СОДЕРЖАЩИЕ ВИРУСЫ
РНК-СОДЕРЖАЩИЕ ВИРУСЫ не имеют ДНК; генетическая информация этих вирусов закодирована в РНК. РНК может быть одно- или двухцепочечной, а клетка-хозяин — про- или эукариотической. Только вирусы с одноцепочечной РНК заражают бактерии, тогда как вирусы растений и животных могут быть как одно-, так и двухцепочечными.
Вирусы с двухцепочечной РНК
Вирусы с двухцепочечной РНК заражают как растения, так и животных. Например, вирус колорадской клещевой лихорадки и вирус карликовости риса зара- жают соответственно насекомых и растения. Эти вирусы содержат РНК в сегментированной форме: в виде некоторого числа двухцепочечных фрагментов.
Вирусы с одноцепочечной РНК
Вирусы с одноцепочечной РНК можно разделить на два типа: с «плюс»-цепью и «минус»-цепью. У вирусов первого типа цепь РНК может функционировать в клетке-хозяине непосредственно как мРНК, тогда как у вирусов второго типа на «минус»-цепи должна сначала с помощью клеточных РНК-полимераз образоваться «плюс»-цепь. Вирусы животных бывают как первого, так и второго типов, а большинство вирусов растений относятся к «плюс»-типу. Особый класс «плюс»-одноцепочечных вирусов образуют ретровирусы, которые способны заражать только клетки животных. Они отличаются от других РНК-содержащих вирусов тем, что имеют диплоидный геном, состоящий из двух идентичных «плюс»-цепей РНК. В качестве примеров одноцепочечных РНК-содержащих вирусов ниже будут рассмотрены вирус гриппа, вирус табачной мозаики и ретровирусы.
Реовирусы
РЕОВИРУСЫ — это икосаэдрические вирусы без оболочки, белковый капсид которых состоит из двух сло- ев — наружного и внутреннего. Внутри капсида находятся 10 или 11 сегментов двухцепочечной РНК.
Инфекционный процесс
Инфекционный процесс начинается с проникновения в клетку РНК и затем протекает в соответствии со схемой 1 (см. рис. 5.2). После частичного разрушения наружного капсида ферментами лизосом РНК в образовавшейся таким образом субвирусной частице транскрибируется, ее копии покидают частицу и соединяются с рибосомами. Затем в клетке-хозяине продуцируются белки, необходимые для формирования новых вирусных частиц.
Репликация РНК вирусов
Репликация РНК вирусов происходит по консерва- тивному механизму - в отличие от репликации у ДНК- содержащих организмов, которая полуконсервативна (гл. 20). Одна из цепей каждого сегмента РНК служит матрицей для синтеза большого числа новых «плюс»- цепей. На этих «плюс»-цепях образуются затем как на матрице «минус»-цепи; «плюс»- и «минус»-цепи при этом не расходятся, а остаются вместе в виде двухцепочечных молекул. Сборка новых вирусных частиц из новообразованных «плюс»- и «минус»-сег- ментов и капсидных белков связана каким-то образом с митотическим веретеном клетки-хозяина, однако точно механизм сборки не известен.
ВИРУС ГРИППА
ВИРУС ГРИППА является примером вируса с «минус»-одноцепочечной РНК. У него есть оболочка и спиральная сердцевина. Последняя состоит из восьми сегментов «минус»-РНК, которые в комплексе с белками образуют спиралевидные структуры. Каждый сегмент кодирует один из белков вируса. В наибольшем количестве вирус содержит белок матрикса, располагающийся на внутренней стороне оболочки и придающий ей стабильность. Все белки оболочки кодируются вирусной РНК, тогда как липиды явля- ются по своему происхождению клеточными (см. «ДНК-содержащие вирусы», раздел «Сборка»). Основные белки оболочки — гемагглютинин и нейра- минидаза.
Инфекционный процесс вируса гриппа
Инфекционный процесс, протекающий по схеме 1 (см. рис. 5.2), начинается с прикрепления вируса к поверхности клетки-хозяина через гемагглютинин. Затем происходит слияние оболочки с клеточной мембраной, нуклеопротеиновая сердцевина (нуклеокап-сид) входит в клетку, и кодируемая вирусом РНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует «плюс»-цепи мРНК на вирусных «минус»-цепях, после чего на рибосомах клетки- хозяина продуцируются вирусные белки. Некоторые из этих белков играют важную роль в репликации вирусного генома.
Репликация вируса гриппа
Репликация происходит в ядре, где с помощью той же, но, вероятно, модифицированной РНК- полиме-разы образуются «минус»-цепи РНК. После того как в ядро поступают нуклеокапсидные белки, происходит сборка нуклеокапсида. Затем нуклеокапсид проходит через цитоплазму, присоединяя по пути белки оболочки, и покидает клетку, отпочковываясь от ее плазматической мембраны. Считается, что в процессе отпочковывания принимает участие нейрамини-даза.
ВИРУС ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ
ВИРУС ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ - пример «плюс»- одноцепочечного вируса растений. Этот не имеющий оболочки спиральный вирус содержит 2130 идентичных молекул белка капсида и одну цепь РНК. РНК располагается в спиральном желобке, образованном белковыми субъединицами, и удерживается многочисленными слабыми связями.
Инфекционный процесс табачной мозаики
Инфекционный процесс, протекающий по схеме 1 (см. рис. 5.2), состоит в проникновении вируса в растительную клетку с последующей быстрой утратой им капсида. Затем в результате трансляции непосредственно «плюс»-цепочечной вирусной РНК рибосомами клетки-хозяина образуются несколько белков, часть которых необходима для репликации вирусного генома.
Репликация вируса табачной мозаики
Репликация осуществляется РНК-репликазой, продуцирующей копии РНК для новых вирионов. Синтез белка капсида происходит только после того, как инфицировавшая клетку РНК подвергается некоторой модификации, делающей возможным присоединение рибосом клетки к тому участку РНК, которым кодируется этот белок. Сборка вириона начинается с образования дисков из белка капсида. Два таких белковых диска, располагаясь концентрически, образуют похожую на бисквит структуру, которая после связывания с ней РНК приобретает форму спирали. Последующее присоединение молекул белка продолжается до тех пор, пока РНК не будет покрыта полностью. В своей окончательной форме вирион представляет собой цилиндр длиной 300 нм.
Ретровирус
РЕТРОВИРУСЫ относятся к «плюс»-одноцепочеч- ным РНК-содержащим вирусам животных; почти все они являются онкогенными. У ретровирусов есть обо- лочка и икосаэдрическая сердцевина, содержащая две идентичные молекулы «плюс»-цепочечной РНК.
Инфекционным процесс ретровируса
Инфекционным процесс начинается с проникно- вения вируса в клетку, происходящего в соответствии со схемой 1 (см. рис. 5.2), но в дальнейшем протекает по схеме 2. После высвобождения РНК в цитоплазме клетки-хозяина РНК-зависимая ДНК-полимераза, кодируемая вирусным геномом, синтезирует на «плюс»-цепях РНК «минус»-цепи ДНК. Затем рибо- нуклеиновая цепь в РНК/ДНК-гибриде разрушается, и на «минус»-цепи ДНК как на матрице образуется «плюс»-цепь ДНК. Получившаяся в результате двухцепочечная ДНК перемещается в ядро клетки-хозяина и встраивается там в клеточную ДНК.
Репликация ретровирусов
Репликация ретровирусов происходит в процессе обычной, осуществляемой клеткой транскрипции клеточной ДНК, в которую теперь встроен вирусный геном. Параллельно идет синтез вирусных белков, ко- торые вместе с копиями РНК, синтезированными транскрибирующими ферментами клетки-хозяина, формируют новые вирионы, отпочковывающиеся затем через плазматическую мембрану. Нередко в результате заражения ретровирусом изменяется характер роста клеток, и по своему поведению они начина- ют походить больше на опухолевые, чем на нормальные клетки: их рост становится быстрым и намного менее зависимым от поступающих извне стимуляторов, таких как гормоны или факторы роста. В настоя- щее время уже известно, что определенные гены рет- ровирусов кодируют белки, способные поддерживать клетки в таком состоянии, когда они более или менее непрерывно делятся (гл. 29). Выделение и идентификация этих белков будут способствовать пониманию механизма опухолевого роста.
Белки
Белки — один из основных классов биологических макромолекул. Широкий диапазон выполняемых ими функций находит отражение в огромном разнообразии их химических структур и пространственных форм. Глобулярные белки, которые в грубом приближении могут быть представлены в виде сфер, принимают участие в специфических процессах, таких как катализ (гл. 12, 13, 14), транспорт (гл. 15) или регуляция (гл. 28). Фибриллярные белки (гл. 11), например коллаген, кератины и фиброин шелка, сильно вытянуты и из-за присущей им эластичности или жесткости часто играют структурную роль.
Четыре уровня структурной организации белков
При описании того или иного белка обычно пользуются терминами первичная, вторичная, третичная и четвертичная структура. Под первичной структурой понимают химическую формулу белка, изображаемую в виде линейной последовательности аминокислотных остатков. Терминами вторичная, третичная и четвертичная структура обозначают различные уровни организации этой линейной последовательности в пространстве.
Аминокислотные остатки
Аминокислотные остатки, последовательно соединенные друг с другом, являются главными компонентами белков. Каждый остаток имеет константную (т. е. одинаковую для всех остатков) часть и, за исключением двух концевых остатков, связан с двумя другими таким образом, что формируется непрерывная, неразветвленная цепь, которая называется основной цепью белковой молекулы. К каждому ос-углеродному атому (сс- углероду, или С”) основной цепи присоединены вариабельные части аминокислотных остатков (боковые, или R-группы). В белках, как правило, встречается 20 разных R-rpynn.
Свободная аминокислота
Свободная аминокислота отличается от аминокислотного остатка наличием дополнительного атома водорода на одном конце (а следовательно, присутствием аминогруппы —NH2) и дополнительной гидрок- сильной группы (—ОН) на другом конце (а сле- довательно, наличием —СООН, или карбоксильной группы).
Пептидная связь
Пептидная связь образуется в результате реакции конденсации между аминогруппой одной свободной аминокислоты и карбоксильной группой другой (или между аминогруппой свободной аминокислоты и кар- боксильным концом полипептида). При этом выделя- ется вода. Таким образом, свободные аминокислоты представляют собой мономеры, из которых путем по- ликонденсации строится полимер — молекула белка.
Полипептидная связь
Полипептидная связь синтезируется в результате повторяющихся актов образования пептидной связи. На одном конце цепи находится свободная —NH2- группа (это N-конец), а на другом — свободная —СООН-группа (это С-конец).
Аминокислотная последовательность
Аминокислотной последовательностью
называется порядок расположения остатков вдоль полипептидной цепи. Обычно в белковых молекулах насчитывается 40 или более остатков, хотя встречаются полипептиды, состоящие из 1000 и более аминокислотных остатков. Значительная вариабельность последовательностей обеспечивает большое разнообразие структур и функций белков. Поскольку полипептиды построены в основном из 20 разных аминокислот, для белка, содержащего 100 остатков, возможно 20100 (т. е. примерно 10130) различных вариантов последовательности.
Классификация боковых групп
Классификация боковых групп основана на различии их свойств в обычных физиологических условиях, т. е. при рН около 7. Полярные отрицательно заряженные — Asp” и Glir — имеют отрицательно заряженную СОО- группу. Будучи в СООН- (т. е. в протонирован-ной) форме, они могут вести себя как кислоты. Полярные положительно заряженные — Arg+, His+ и Lys+ — несут положительный заряд вследствие протонирования атома азота. В депротонированной форме они могут проявлять свойства оснований. У полярных незаряжен- ных — Asn, Gin, Ser и Thr — имеются поляризованные ковалентные связи и, следовательно, электроотрица- тельные и электроположительные участки. Неполяр- ные, или гидрофобные, — Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Туг и Val — содержат объемные алифатиче- ские или ароматические углеводородные цепи. Гидро- фобные свойства Cys, Trp и Туг слегка ослабляются из-за наличия полярных групп (—SH, >NH и —ОН соответственно). Нейтральные остатки представлены одним Gly, боковая группа которого — атом водорода.
Дисульфидным мостиком
Дисульфидным мостиком называется ковалентная связь, соединяющая либо две части одной и той же полипептидной цепи, либо два разных полипептида. Дисульфидный мостик образуется при окислении двух остатков цистеина (т. е. при отщеплении водорода от двух реакционноспособных сульфгидрильных групп —SH). Новый остаток носит название цистин.
Пролин
Пролин — необычный остаток, поскольку один конец его боковой группы ковалентно связан с Са-ато-мом, а другой - с N-атомом основной цепи того же остатка, в результате чего образуется кольцо.
Стереоизомерия
Стереоизомерия характерна для всех аминокислот, за исключением Gly. Асимметричным является Сватом, так как с ним связаны четыре разные химические группы. В этом случае для каждой аминокислоты существуют две возможные конфигурации, известные под названием D- и L- форм (их называют также энан-тиомерами или стереоизомерами). Раствор одного из стереоизомеров поворачивает плоскость поляризации света в одном направлении, а раствор другого — в противоположном. Этот эффект носит название оптической активности. В белках встречаются только L-изомеры. Чтобы различить D- и L-конфигурации, нужно посмотреть в направлении от атома водорода к Сжатому и «прочесть» по часовой стрелке три оставшиеся при Са-атоме группы — тогда в случае L-формы группы СО, R и N составят слово CORN. Боковые группы Thr и Не имеют дополнительный оптический центр — Р- углеродный атом, связанный с ос-углеродом основной цепи.
Свободная энергия
Свободная энергия — это величина, которую можно определить как ту часть внутренней энергии химической системы, за счет которой может совершаться работа над окружающей средой. Чтобы выяснить, будет ли данный процесс идти самопроизвольно, находят изменение свободной энергии (общепринятое ее обозначение ∆G) между конечным и начальным состояниями
рассматриваемой системы
Если ∆G - отрицательная величина, система будет совершать работу самопроизвольно (подобно грузу, поднятому на некоторую высоту и готовому упасть); если же ∆G > 0, система не будет совершать работу без дополнительного притока энергии извне. Когда ∆G = 0, система находится в состоянии термодинамического равновесия. ∆G измеряется в джоулях (или килоджоулях) на моль вещества (Дж/моль или кДж/моль).
∆G =∆Н – Т∆S— соотношение, указывающее на наличие двух составляющих ∆G при постоянной температуре T (по шкале абсолютных температур Кельвина). Одна из них — это изменение энтальпии (∆Н), ко- торое можно приравнять изменению потенциальной энергии рассматриваемой системы: этот параметр связан с энергетическим состоянием молекул в данной химической системе. Другой параметр — изменение энтропии (∆S) - с точностью до множителя T является мерой энергии, которую нельзя использовать для совершения полезной работы. Сама энтропия (S) возрастает с увеличением беспорядка в системе и является мерой ее неупорядоченности. Таким образом, ∆S - величина положительная, если система становится менее упорядоченной (гл. 44).
∆Go химической реакции называется стандартным изменением свободной энергии и представляет собой такое значение ∆G , когда концентрация каждого из исходных реагирующих веществ до начала реакции составляет 1 моль * л - 1 ; при этом все реагенты, включая продукты реакции, находятся в стандартных условиях. Для реакции, протекающей в стандартных условиях, ∆G° связано с константой равновесия K’ со- отношением ∆G° = — RTlnK’ где R — универсальная газовая постоянная, Т— абсолютная температура. Биохимики часто пользуются несколько модифицированной формой ∆G°, которая обозначается символом ∆G°’(гл. 44).
Ковалентная связь
Ковалентная связь— это химическая связь между атомами в молекуле. Связывание осуществляется путем обобществления электронов, принадлежавших одному или нескольким атомам. Ковалентные связи относятся к прочным связям: ∆G их образования составляет примерно -300÷ - 400 кДж/моль. Чтобы столь большая энергия не растрачивалась впустую, любой биохимический процесс организован так, что разрыв какой-либо ковалентной связи неизменно энергетически сопряжен с образованием другой ковалентной связи.
АТФ
Аденозинтрифосфат (АТФ) служит источником энергии для очень многих биохимических реакций. Его строение описано в гл. 17. В связях —Р—О—Р— запасена значительная энергия.Отщепление конце- вой (в данном случае у-) фосфатной группы посредст- вом гидролиза с образованием аденозиндифосфата (ADP) и неорганического фосфата (Pj) характеризует- ся ∆G° = —30 кДж/моль:
АТР↔ ADP + Рi
АТР + X ↔ ADP + Pi + Y,
Примерно такое же количество энергии высвобож- дается и при отщеплении второго (т. е. (3-) фосфата. Вся эта энергия может пойти на обеспечение какой- нибудь биохимической реакции, в том числе такой, которая не протекает самопроизвольно в обычных ус- ловиях. Рассмотрим реакцию типа X ^± Y, для которой ∆G° составляет, скажем, +20 кДж/моль. Если превра- щение X в Y сопряжено с гидролизом АТР, то суммар- ная реакция будет иметь вид
и для нее ∆G°≈ (—30 + 20) кДж/моль = —10 кДж/моль, т. е. в стандартных условиях реакция будет идти само- произвольно.
Нековалентный тип связи
Нековалентный тип связи относится к взаимодействию между атомами, не связанными ковалентно друг с другом. Эти взаимодействия будут рассмотрены нами в дальнейшем на примере структуры белка, однако они встречаются и в других биологических молекулах. Поскольку нековалентные взаимодействия происходят не в вакууме, а в растворе, при их оценке необходимо учитывать влияние растворителя.
Стабильность свернутой молекулы белка
Стабильность свернутой молекулы белка в растворе относительно такого состояния белка, когда его цепь развернута, составляет обычно о к о л о —40 кДж/моль (например, для молекулы лизоцима). Это означает, что при переходе каждого моля лизоцима из развернутого состояния в свернутое высвобождается 40 кДж энергии.
Электростатические эффекты
Электростатические эффекты составляют значительную часть энтальпийного вклада нековалентных взаимодействий в А (7. Разноименные заряды притяги- ваются друг к другу; для них, таким образом, энерге- тически выгодно сближение. Согласно закону Куло- на, энергия взаимодействия между двумя зарядами q{ и q2, удаленными друг от друга на расстояние г, прямо пропорциональна отношению
где е — диэлектрическая проницаемость соответству- ющей среды (е служит мерой способности данной сре- ды экранировать заряженные атомы). В вакууме е=1, внутри молекулы белка она равна примерно 4, а в во- де е = 80. Пользуясь законом Кулона, можно показать, что сближение положительного и отрицательного эле-ментарных зарядов из бесконечности до расстояния 0,3 нм сопровождается термодинамически выгодным изменением свободной энергии, равным примерно —500 кДж/моль в вакууме, —125 кДж/моль внутри бел- ковой молекулы и —6 кДж/моль в воде.
Ионная связь
Ионная связь, (соленой мостик) образуется при сильном сближении (0,3 нм) двух атомов с разно- именными зарядами. В самой белковой молекуле группа —СОО- боковой цепи остатка глутаминовой кислоты и группа —NH+3 боковой цепи остатка лизина могут взаимодействовать между собой подобно низкомолекулярным ионам соли, образуя солевой мостик. Если, однако, такого мостика не образуется, боковые цепи могут взаимодействовать с растворителем; при этом свободная энергия системы также убывает. Поэтому образование солевого мостика, хотя и выгодно термодинамически, характеризуется ∆G, составляющим всего лишь около —4 кДж/моль, что гораздо меньше величины, следующей из закона Кулона.
Водородные связи
Водородные связи. Когда атом водорода связывается с электроотрицательным атомом типа кислорода или азота, происходит смещение электронов, приводящее к появлению дробного положительного заряда (обозначаемого δ+) на атоме водорода и дробного отрицательного заряда (обозначаемого δ-) на его партнере. При этом образуется электрический диполь, который может взаимодействовать с другими диполями. Связь такого типа называется водородной. В молекулах белка группы >N—H и >С=О основной цепи часто участвуют в образовании водородных связей. ∆G образования водородной связи в вакууме составляет при- мерно — 20 кДж/моль. Но те же группы >N—Н и >С=О белковой молекулы могли бы взаимодействовать с окружающими их молекулами воды, что также термодинамически выгодно, поэтому величина ∆G образования водородной связи в молекуле белка составляет около —3 кДж/моль.
Вандерваальсовы силы
Вандерваальсовы силы заставляют атомы притягиваться друг к другу Такие силы притяжения между атомами возникают, в частности, из-за наличия взаимодействий между флуктуирующими электрическими диполями, образуемыми электронным облаком и положительным ядром каждого атома. Однако два атома могут сближаться лишь до тех пор, пока их электронные облака не начнут перекрываться; дальнейшее сближение приводит к возникновению сильного отталкивания. Энергия такого взаимодействия описывается выражением где А и В — постоянные, зависящие от рода атомов. Таким образом, ввиду конкуренции двух взаимно противоположных эффектов — эффекта притяжения (— В/r6) и эффекта отталкивания (А/r 12) — естественно предположить, что существует какое-то оптимальное (равновесное) расстояние между двумя атомам. Это приводит к понятию эффективного радиуса атома, называемого обычно вандерваальсовым.
Структура воды вокруг молекулы заметно сказывается на энтропии системы. Обычно молекулы воды движутся в растворе и вступают во взаимодействие друг с другом путем образования и разрыва водородных связей. Когда же молекулам воды приходится принимать достаточно жесткую конфигурацию, подобную структуре льда, упорядоченность возрастает, что термодинамически невыгодно из-за убывания энтропии.
Гидрофобный эффект
Гидрофобный эффект — это тенденция неполярных групп ассоциировать друг с другом, чтобы избежать контакта с водой. В результате такой ассоциации происходит нарушение структуры воды, вследствие чего энтропия системы возрастает. Выражение неполярный характер имеют алифатические и ароматические боковые цепи аминокислотных остатков белков (гл. 6) и основания нуклеиновых кислот (
Тепловое движение
Тепловое движение — это хаотическое движение атомов и молекул, определяющее температуру систе- мы. Доля (/) молекул, у которых тепловая энергия больше некоторого произвольно взятого значения Е, дается уравнением Больцмана:
где R — универсальная газовая постоянная, Т — абсо- лютная температура. Таким образом, доля молекул с энергией, большей RT (= 2,5 кДж/моль при комнат- ной температуре), равна ехр(—1), или 0,37. Поэтому энергия связей должна превышать 2,5 кДж/моль, ина- че они будут легко рваться и вновь образовываться в результате теплового движения. Таким образом, связи, обусловленные вандерваальсовыми силами, а иногда и водородные связи и солевые мостики, непрерывно рвутся и снова восстанавливаются.
Конформациями молекулы белка
Конформациями молекулы называются такие варианты расположения в пространстве составляющих молекулу атомов, которые могут быть получены один из другого вращением вокруг одинарных ковалентных связей. В противоположность этому конфигурации — это такие варианты взаимного расположения атомов молекулы, переходы между которыми требуют разрыва и образования ковалентных связей. Так, D- и L-изомеры аминокислотных остатков (гл. 6) представляют собой различные конфигурации, а α-спираль и коллагеновая спираль (см. ниже) — различные конформации полипептидной цепи.
Пептидная связь
Пептидной связью называется связь между >С=О- группой одного остатка и >N—Н-группой следующего. Эта С—N-связь вопреки ожиданиям не является одинарной, а в силу резонанса оказывается частично двойной (С—N). При этом соответственно уменьшается порядок двойной связи С=О. Такое изменение порядка связей вызвано тем, что одна пара электронов связи С=О распределяется между атомами О, С и N. Вследствие этого перераспределения атомы О, С, N, Н (пептидная группа) и связанные с ними ковалентно два Са-атома оказываются лежащими в одной плоскости, называемой амидной, а вращение вокруг связи O*N становится запрещенным. Предположение о планарности пептидной группы было высказано Полингом и Кори. Они заметили, что длина пептидной связи (0,132 нм) имеет промежуточное значение между длиной одинарной С—N-связи (0,149 нм) и двойной С=Ы-связи (0,127 нм).
Транс-конформации пептидной группы.
Транс-конформации пептидной группы. Са-атомы, примыкающие с двух сторон к одной пептидной группе, обычно находятся в транс-конформации по отно шению друг к другу. Альтернативная ^ис-конформация невыгодна из-за слишком сильного сближения объемных групп, присоединенных к Са-атомам.
Са-атом связан одинарными связями с - атомом
одной пептидной группы и с С-атомом следующей. Вокруг этих одинарных связей возможно относительно свободное вращение
Углы ф и Ψ
. Для описания вращения вокруг связей N—Са и Са—С используются соответственно углы ф (фи) и Ψ(пси). Угол ф задает положение всех атомов, которые лежат в амидной плоскости, предшествующей Са-атому, а угол Ψ определяет положение всех атомов амидной плоскости, следующей за Са-атомом.
Некоторые пары значений ф и Ψ запрещены, поскольку при этом имеют место стерические ограничения из-за сближения двух атомов на расстояние, меньшее чем сумма их контактных (т. е. вандерваальсовых) радиусов. Например, при ф = 0°, Ψ= 180° возникают стерические контакты между двумя атомами кислорода.
Конформационная карта Рамачандрана, или (ф, Ψ)-
карта, показывает, какие пары значений ф и Ψ разрешены. Эта карта названа именем индийского ученого, рассчитавшего допустимые значения углов ф и Ψ. Каждая точка на карте соответствует определенной паре значений ф и Ψ и показывает, является ли данное взаимное расположение атомов двух амидных плоскостей и боковой группы, присоединенных к Са-атому, энергетически выгодным. При- веденная на рис. 8.1 (ф, Ψ)-карта характерна для большинства боковых цепей, за исключением глицина и пролина. В случае полностью разрешенных конформаций нежелательные контакты между атомами отсутствуют. Запрещенные углы (например, ф = 0°, Ψ = 180°) соответствуют конформациям, в которых отдельные атомы находятся друг от друга на расстоянии, меньшем суммы их контактных радиусов. Необходимо отметить что, поскольку атомы не являются жесткими сферами, возможно сближение их на расстояние, несколько меньшее суммы контактных радиусов. Хотя подобное сближение нежелательно,
оно тем не менее может иметь место, а со- ответствующие конформаций называются частично разрешенными (например, ф = —180°, Ψ = 180°). Если каждую полностью разрешенную пару значений ф и Ψ представить на карте темно-коричневой точкой, то получающиеся в результате темно-коричневые участки будут отвечать полностью разрешенным областям значений углов ф и Ψ. Частично разре-
Транс-конформации пептидной группы. Са-атомы, примыкающие с двух сторон к одной пептидной груп- пе, обычно находятся в транс-конформации по отно шению друг к другу. Альтернативная ^ис-конформация невыгодна из-за слишком сильного сближения объемных групп, присоединенных к Са-атомам.
шенные области значений углов ф и Ψ отмечены на карте светло-коричневым цветом. Следует подчеркнуть, что (ф, Ψ)-карты указывают разрешенные пары значений ф и Ψ для данного конкретного остатка. Боковая цепь глицина, состоящая лишь из одного атома водорода, по размеру меньше, чем у любого ж другого остатка. Поэтому на (ф, Ψ)-карте для глицина больше разрешенных областей, чем на картах других остатков. Напротив, в случае пролина ограничения, налагаемые ковалентной связью между атомом углерода боковой цепи и атомом азота основной цепи, приводят к значительному уменьшению размеров разрешенных областей.
Регулярные или спиральные структуры
Регулярные или спиральные структуры нескольких соседних вдоль цепи остатков значения ф и Ψ окажутся одинаковыми, то в пределах этого участка у каждого Са-атома основная цепь будет поворачиваться на один и тот же угол. В результате получится регулярная вторичная структура. Подобные структуры часто обнаруживаются в глобулярных и фибриллярных белках. Особенно важное значение имеют па- раллельная и антипараллельная (β-структуры (гл. 9), α- спираль (гл. 9) и коллагеновая спираль (гл. 11). Значения углов ф и Ψ, соответствующие эти типам вторичной структуры, приведены на рис. 8.1.
Вторичная структура белка
Под вторичной структурой участка полипептидной цепи понимают конформацию основной цепи этого фрагмента без учета конформации боковых групп. Согласно более раннему определению, употребляемому иногда и сейчас, вторичная структура — это те сегменты полипептидной цепи, которые участвуют в формировании регулярной сетки водородных связей. При некоторых конформациях образуются регулярные повторяющиеся структуры, стабилизированные водородными связями между >N—Н- и >С=О-группами основной цепи (например, α-спираль, β-слой, коллагеновая спираль).
Регулярная или спиральная, вторичная структура
Регулярная или спиральная, вторичная структура образуется тогда, когда у всех остатков значения углов ф и Ψ одинаковы. При этом основная цепь у каждого Са-атома поворачивается на один и тот же угол. Любую спираль можно рассматривать как результат наматывания цепи на боковую поверхность воображаемого цилиндра. Спираль характеризуется числом повторяющихся единиц (остатков), приходящихся на один виток (обозначается п), и расстоянием между соседними остатками вдоль оси спирали (d). Высота одного витка (р) равна произведению п на d. Спирали могут быть правыми и левыми. Утверждение, что какая-то спираль является правой, означает, что если вытянутый вперед большой палец правой руки направить вдоль оси спирали, то расположенные перпендикулярно ему зажатые в кулак остальные пальцы будут указывать направление хода цепи.
Цопни и Корм в 1951 г. предположили, что в белках должны встречаться два типа регулярной структуры — α-спираль (п = 3,6) и β-структура (п = 2). Эта догадка основывалась, во-первых, на известных данных о размерах пептидной группы и ее плоском строении, а во-вторых, на том, что оптимальные условия для об-
….О
разования водородной связи N—Н….О реализуются в
том случае, когда все три атома, N, Н и О, лежат на од- ной прямой. Именно способностью полипептидной цепи принимать форму α-спирали и β-структуры уда- лось объяснить результаты экспериментов по изуче- нию дифракции рентгеновских лучей на волокнах фиб- риллярного белка кератина (гл. 11), находящегося со- ответственно в α - и β-формах (отсюда и название — α - и β-структуры). α -Спираль и β-структура являются энергетически наиболее выгодными конформациями, поскольку обе они стабилизированы водородными связями (гл. 7) между >N—H- и >С=О-группами основной цепи. Кроме того, и α-спираль, и β -структура дополнительно стабилизируются благодаря плотной упаковке атомов основной цепи, которые подогнаны друг к другу, как кусочки одной картинки-головолом- ки.
В правой α –спирали ф = -57°, Ψ= -47°. Число остатков на виток (п) равно 3,6, расстояние между соседними остатками вдоль оси спирали (d) — 0,15 нм, а высота одно витка (р) составляет 0,54 нм (= 3,6× 0,15 нм). Каждая >С=О-группа образует водородную связь с четвертой по ходу цепи >N—Н-группой. Регулярность структуры означает, что все >N—H- и >С=О-группы, за исключением находящихся на концах спирали, мо- гут образовывать водородные связи. α-Спираль по форме напоминает прутик, в котором стебель — это основная цепь, а торчащие в разные стороны ветки - боковые цепи (R-группы).
β-Слой
β-Слой формируется из двух или более β -структур- ных участков полипептидной цепи, называемых β- участками. В каждом β-участке полипептидная цепь почти полностью вытянута; при этом >N—H- и >С=О-группы ориентированы примерно перпенди- кулярно направлению β-участка и могут образовывать водородные связи с соседними участками. В результа- те из нескольких β-участков образуется структура, ко- торая в грубом приближении оказывается плоской, напоминающей лист. Однако из-за того что плоско- сти пептидных групп в каждом β -участке наклонены поочередно в разные стороны относительно направ- ления β -участка, плоский β-слой приобретает склад- чатую форму. Если двигаться вдоль одного из β-участ- ков, составляющих β-слой, то боковые группы будут выступать по очереди то с одной, то с другой стороны β-слоя.
Параллельная и антипараллельная β-структуры
Существуют два разных варианта образования водородных связей между тяжами в составе р-слоя. Каждому варианту соответствует свои значения углов ф и Ψ. В параллельном β-слое (ф = - 119°, Ψ = 113°) соседние β- участки направлены в одну сторону (рис. 9.2), а в антипараллельном (ф = -139°, Ψ = 135°) — в противоположные
Коллагеновая спираль
Коллагеновая спираль представляет собой третий тип регулярной вторичной структуры со значениями углов ф = —60°, Ψ= 140°. В такой конформации нахо- дится основная часть полипептидной цепи фибрил- лярного белка коллагена
Большинство глобулярных белков
Большинство глобулярных белков имеет α-спиральные и/или β-структурные участки. α-Спирали обычно состоят из 6—24 остатков, соответственно длина их варьирует от 0,9 до 2,4 нм. Значения углов ф и Ψ в спирали всегда немного отличаются от стандартных. Иногда несколько остатков принимают конформацию спирали 310, отличную от конформации ос-спирали. На один виток спирали 310 приходится 3 остатка, а водородные связи в ней образуются между п и п — 3 по ходу цепи остатками. Участки β-слоя, как правило, со- стоят из 3—10 остатков и имеют длину от 1,0 до 3,3 нм. Типичный (3-слой содержит от 2 до 10 р-участков. В одних β-слоях все участки уложены параллельно друг другу, в других все соседние β-тяжи антипараллельны. Кроме того, иногда в одном и том же слое присутствуют оба типа укладки. Так же как и в случае α-спирали, реальная конформация β-слоя может несколько отличаться от стандартной.
β-Изгиб
β-Изгиб– это еще один тип вторичной структуры, встречающийся во многих глобулярных белках в тех местах, где направление полипептидной цепи меняется на противоположное. Данная структура часто рассматривается как связующее звено между двумя уложенными антипараллельно β-участками в составе β-слоя. На рис. 9.3 приведен пример β-изгиба из четырех остатков с одной водородной связью между >С=О-группой остатка 1 и >N—Н-группой остатка 4. В белках обнаруживаются и другие типы β-изгибов. В отличие от α-спирали, коллагеновой спирали и β - слоя в β-изгибе значения углов ф и Ψ у разных остатков неодинаковы. β-Изгибы обычно находятся у по- верхности белковой глобулы.
Предсказать, какие участки молекулы глобулярного белка будут иметь регулярную вторичную структуру,
Предсказать, какие участки молекулы глобулярного белка будут иметь регулярную вторичную структуру, основываясь на данных об их аминокислотной после- довательности, можно с точностью около 70%. Одни остатки (например, Glu, Met, Ala и Leu) часто встреча-ются в α -спиралях, в то время как другие (Gly и Pro) — значительно реже. Что касается пролина (Pro), то этот остаток может находиться в α-спирали лишь в одном из первых трех положений, поскольку в остальных позициях наличие ковалентной связи между боковой цепью пролинового остатка и атомом азота основной цепи не позволяет >N—Н-группе образовать водородную связь. Некоторые остатки предпочитают находиться в β-участках (например, Val, He, Туг и Phe), тогда как остатки Asp и Glu принимают эту конформацию довольно редко. Та- кие данные о встречаемости различных остатков в разных типах вторичной структуры используются при предсказании локализации в белке α - и β-участков.
Третичная структура белка
Под третичной структурой белка понимают расположение в пространстве всех атомов одиночной полипептидной цепи. Некоторые белки состоят из нескольких полипептидных цепей. Каждая цепь — это одна субъединица, или мономер. Димеры содержат две полипептидные цепи, тримеры — три, а тетрамеры — четыре. Молекулы гемоглобина представляет собой типичный тетрамер, в котором имеются две идентичные сс-цепи и две идентичные β-цепи.
Четвертичная структура белка
Термин четвертичная структура белка означает взаимное расположение в пространстве мономеров, формирующих молекулу белка, который состоит из нескольких субъединиц.
Рентгеноструктурный анализ
С помощью рентгеноструктурного анализа белковых кристаллов расшифрована трехмерная структура более ста различных белков. Положение большинства атомов, за исключением атомов водорода, может быть определено с точностью 0,1 нм. До сих пор кристаллографическими методами изучались в основном водорастворимые глобулярные белки, поэтому все, что будет сказано далее, касается именно этого класса белков.
На поверхности белковой глобулы
На поверхности белковой глобулы сосредоточены в основном полярные группы и заряженные атомы, предпочитающие взаимодействовать с водным окружением. Сюда относятся полярные группы >N—H и >С=О основной цепи, заряженные атомы боковых цепей остатков Gli-, Aspα, Lys+ и Arg+ и полярные бо- ковые цепи таких остатков, как Ser, Thr, Asn, Gin и др. Между противоположно заряженными группами (на- пример, между Gli- и Lys+) на поверхности белковой глобулы иногда образуются ионные связи, которые называются солевыми мостиками (гл. 7). Кроме того, на поверхности имеется некоторое количество неполярных атомов.
Внутренняя часть белковой глобулы
Внутренняя часть белковой глобулы представляет собой неполярную среду, защищенную от контактов с окружающим растворителем благодаря плотной упаковке атомов. Гидрофобное ядро образовано неполярными группами, входящими главным образом в состав алифатических и ароматических боковых цепей Ala, Val, He, Leu, Met, Phe и Тгр. Полярной или заряженной группе энергетически невыгодно находиться в таком гидрофобном окружении, если она при этом не взаимодействует с другой полярной группой или с атомом, имеющим противоположный заряд. Поэтому оказавшиеся внутри глобулы >N — Н- и >С=О-группы основной цепи образуют между собой водородные связи, формируя в результате а-спирали и β-слои. Точно так же находящиеся внутри глобулы противоположно заряженные группы (например, Gli- и Lys+) образуют ионные связи, известные под названием солевых мостиков.
Дисульфидный мостик
Дисульфидный мостик— это ковалентная связь между двумя цистеиновыми остатками. Такие мостики встречаются в некоторых секреторных белках (гл. 6). Мостик может быть расположен как внутри глобулы, так и на ее поверхности. Во многих белках нет дисульфидных мостиков, хотя имеются цистеины в восстановленной форме.
Ренатурация
Экспериментыпоренатурациипоказывают, что биологически активный белок после денатурации может самопроизвольно свернуться в исходную конформацию с восстановлением своей активности. Следовательно, при физиологических условиях состояние белка, имеющего нативную трехмерную структуру, термодинамически стабильно, т. е. соответствует минимуму свободной энергии. Более того, эти эксперименты говорят о том, что информация, необходимая для сворачивания белка в нативную конформацию, заложена в его аминокислотной последовательности.
Поэтому в принципе можно теоретически предсказать трехмерную структуру любого белка, исходя из его аминокислотной последовательности. Это было бы полезно в тех случаях, когда нельзя определить конформацию молекулы кристаллографическим методом. Хотя точность предсказания вторичной структуры белка (гл. 9) теперь довольно высока, предсказание третичной структуры остается нерешенной проблемой молекулярной биологии.
Сворачивание молекулы белка
Сворачивание молекулы белка из развернутого состояния должно осуществляться либо одним, либо очень немногими путями. Пусть белковая молекула состоит из 50 остатков, каждый из которых может принимать 10 разных конформаций. Тогда общее число возможных конформаций составит 1050, и если характерное время молекулярных перестроек составляет 10-13 с, то для того чтобы перепробовать все конформаций хотя бы по одному разу, потребуется примерно 1037 с (~1030 лет). Следовательно, должен существовать направленный путь сворачивания белка, ограничивающий этот перебор. Одно из предположений заключается в том, что отдельные участки белковой молекулы, например а-спирали, формируются в первую очередь и служат как бы центрами конденсации для остальных частей молекулы.
Стабильность свернутой молекулы
Стабильность свернутой молекулы белка в водном окружении крайне низка: для лизоцима из белка куриного яйца она составляет 40 кДж/моль. Основной движущей силой процесса сворачивания является энтропийный, гидрофобный эффект (гл. 7), вследствие которого неполярные группы стремятся выйти из водного окружения и оказаться внутри глобулы. К дальнейшей стабилизации структуры, по-видимому, при- водит образование внутренних водородных связей, а также дисульфидных и солевых мостиков. Существует и энтропийный эффект, препятствующий сворачиванию. Этот эффект обусловлен тем, что для свернутой молекулы белка число разрешенных конформаций основной и боковых цепей меньше, чем у развернутой, а уменьшение числа конформаций энтропийно невыгодно (т.е. приводит к уменьшению энтропии).
Участки полипептидной цепи
Одни участки полипептидной цепи, находящиеся внутри свернутой белковой глобулы, являются а-спиралями или же (β-структурами, другие принимают нерегулярные, но вполне определенные конформаций (coil-участки). Полипептидная цепь, образующая белковую глобулу, свернута довольно сложным образом. Это иллюстрирует рис. 10.2, где при помощи отрезков, соединяющих последовательные Са-атомы, изображена молекула лизоцима. (Сравните такое представление структуры белка с более упрощенным, приведенным на рис. 10.1).
Домены в крупных белках при сворачивании полипептидной цепи часто образуются две или более пространственно разделенные области, называемые доменами. По своей структуре каждый домен напоми- нает отдельный небольшой белок. Обычно в одном
домене содержится от 40 до 300 остатков. В молекуле иммуноглобулина (гл. 40) как тяжелая , так и легкая цепи образуют несколько доменов, один из которых, константный домен легкой цепи, изображен на рис. 10.1.
Все домены можно подразделить на четыре класса: α/α, β/β, α/β и а + β, в зависимости от взаимного рас- положения в цепи а-спиральных и β-структурных участков. Примеры доменов каждого класса приведены на рис. 10.1; полипептидная цепь изображена в виде ленты, при этом а-спиральные участки представлены спиралями, β-структурные — стрелками, а не- регулярные — светлыми петлями. Боковые цепи не показаны, хотя во всех белках пространство между атомами основной цепи заполнено атомами боковых цепей. α/α-Домены состоят в основном из α-спиралей, β-участки в них практически отсутствуют. а- Спирали упакованы таким образом, что неполярные боковые цепи оказываются спрятанными внутрь. В β/β-доменах имеется несколько β-цепей и нет (или почти нет) а-спиралей. Этот класс доменов представ- лен на рисунке константным доменом молекулы иммуноглобулина, состоящим из двух упакованных вместе β -слоев. На диафамме видно, что β-слои не плоские, а слегка скручены. В а/β-доменах а- и β- участки чередуются вдоль цепи. Часто β-участки образуют параллельный β-слой, окруженный а- спиралями. В а + β-доменах а- и β-участки обычно располагаются в разных сегментах полипептидной цепи.
Упаковка субъединиц
Упаковка субъединиц в мультимерном (состоящем из нескольких субъединиц) белке осуществляется благодаря взаимодействиям того же типа, что и при образовании третичной структуры белка. Обычно субъединицы бывают упакованы довольно симметрично (хотя не всегда имеет место полная симметрия), как, например, в молекуле гемоглобина, где четыре субъединицы располагаются в вершинах тетраэдра
Внутренняя подвижность белков
Внутренняя подвижность белков. Из экспериментов известно, что белки не являются жесткими структурами: отдельные их части перемещаются друг относительно друга, что позволяет говорить о внутренней подвижности белков. Во многих глобулярных белках, включая четыре белка, представленных на рис. 10.1, атомы основной цепи способны смещаться на 0,01 нм относительно среднего положения, а боковые цепи, находящиеся на поверхности белковой глобулы, имеют еще большую подвижность.
Фибрилляцирные белки
ФИБРИЛЛЯРНЫМИ называются белки, имеющие Конформацию полипептидной цепи большинства сильно вытянутую форму. Благодаря присущей этим фибриллярных белков можно отнести к одному из белкам жесткости или эластичности они часто выпол- трех типов регулярной вторичной структуры: к колла-разновидностях шелка, и к α-спиральной структуре, характерной для а-кератинов и тропомиозина.
няют в живых организмах структурные функции. геновой спирали, (β-слою, обнаруженному во многих
Коллаген
КОЛЛАГЕН наиболее распространенный белок млекопитающих, образует основу сухожилий, костей, кожи, зубов и хрящей. Структурной единицей коллагенового волокна является тропоколлагеновая молекула, состоящая из трех полипептидных цепей, каждая из которых содержит около 1000 аминокислотных остатков. В зависимости от функции коллагена его поли- пептидные цепи либо идентичны, либо имеют довольно близкие последовательности.
Аминокислотный состав коллагена
Аминокислотный состав коллагена необычен. Во- первых, примерно одну треть всех остатков составляют остатки глицина, и, во-вторых, имеется большое число остатков пролина. Кроме того, в коллагене встречаются остатки двух аминокислот, обычно не обнаруживаемых в белках, — гидроксипролина и гидроксилизина. Боковые цепи этих аминокислот содержат гидроксильную (—ОН) группу, присоединенную к одному из углеродных атомов вместо атома водорода. Гидроксилирование осуществляется специфическими ферментами после включения пролина или лизина в полипептидную цепь коллагена.
Аминокислотная последовательность коллагена
Аминокислотная последовательность большей части цепи коллагена представлена регулярно повторяющимися единицами Gly—X—Y, где X и Y могут быть произвольными аминокислотными остатками. Пролин (Pro) чаще встречается в положении X, тогда как гидроксипролин (Hyp) — преимущественно в положении Y. Типичный фрагмент последовательности коллагена выглядит следующим образом:
—GLy— Pro—Hyp—Gly—Pro—Met—Gly—Pro-
—Hyp—Gly—Leu—Ala-
Такая регулярная последовательность принимает
конформацию, называемую коллагеновой спиралью. В участках из первых 16 остатков у N-конца и из последних 25 остатков у С-конца полипептидной цепи коллагена подобной регулярности в чередовании аминокислотных остатков не обнаруживается. Эти сегменты, называемые телопептидами, имеют конформацию, отличную от коллагеновой спирали.
Одиночная пептидная цепь коллагена
Одиночная пептидная цепь коллагена принимает форму спирали, в которой расстояние между аминокислотными остатками вдоль оси составляет 0,29 нм, а на один виток спирали приходится немного менее трех остатков. Спираль оказывается левой в том смысле, что если пальцы левой руки расположить так, чтобы они прослеживали путь Gl—X2—Y3—G4, то большой палец будет указывать направление от N- к С-концу. Между атомами основной цепи одиночно- го полипептида водородных связей не образуется. Тем не менее такая конформация (значительно более вы- тянутая, чем α-спираль, у которой расстояние между остатками составляет 0,15 нм) оказывается предпоч тительной для полипептидной цепи, содержащей мас- сивные пирролидиновые кольца остатков пролина и гидроксипролина.
Термин тройная коллагеновая спираль
Термин тройная коллагеновая спираль применяется для описания структуры регулярной части молекулы тропоколлагена. В тройной коллагеновой спирали три одиночные коллагеновые цепи уложены параллельно и закручены одна вокруг другой, образуя похожую на канат витую структуру. Такое закручивание оказывается возможным благодаря наличию у левых одиночных коллагеновых спиралей правой сверхспи- рализации, которую можно наблюдать по результиру- ющему смещению А-цепи при переходе от G1 к G4 (G1 и G4 — это глициновые остатки, стоящие соответ- ственно в первом и четвертом положениях). Одиноч- ная цепь коллагена содержит примерно 1000 остатков, а длина молекулы тропоколлагена составляет при этом около 300 нм.
Глицин
Глицин- единственный остаток, который может располагаться вблизи оси тройной спирали, поскольку имеющегося там свободного пространства недостаточно для размещения любой другой, большей по объему боковой цепи. На один виток одиночной цепи приходится примерно три остатка, поэтому в каждом третьем положении аминокислотной последовательности должен стоять глицин. Боковые цепи остатков X и Y направлены в сторону от оси тройной спирали и могут быть большими по объему. В тройной спирали существуют водородные связи между >N—Н-группой каждого внутреннего глицинового остатка и >С=О- группой другой цепи.
Сборка коллагена
Сборка коллагена начинается с синтеза в фибро- бластах молекул проколлагена. Проколлаген — это предшественник коллагена, имеющий дополнительные пептиды на В- и С-концах. В фибробластах моле- кулы проколлагена самопроизвольно сворачиваются в тройные спирали, в каждой из которых С-концы трех цепей связываются друг с другом дисульфидными мостиками. В таком виде тройные спирали секретируются из клетки и затем после удаления дополнительных пептидов проколлагена с помощью фермента, проколлагеновой пептидазы, превращаются в молекулы тропоколлагена.
Микрофибрилла
Микрофибрилла представляет собой совокупность уложенных параллельно молекул тропоколлагена, каждая из которых сдвинута в продольном направлении относительно соседней на 67 нм (этот сдвиг называет- ся D-уступом). Кроме того, между С-концом одной молекулы и N-концом следующей существует промежуток длиной 40 нм. Микрофибриллы, ассоциируя друг с другом, образуют фибриллу, а несколько фибрилл — коллагеновое волокно.
Коллагеновые волокна
Коллагеновые волокна стабилизируются с помощью ковалентных сшивок между полипептидными цепями и в результате оказываются слаборастяжимыми и весьма прочными, так как сколько-нибудь заметное удлинение волокон требует разрыва этих сшивок.
Соединительные ткани в таких образованиях, как кости, сухожилия и хрящи, обычно имеют сложную структуру и состоят из коллагена и других молекул, главным образом неорганических. В сухожилиях, как было показано, в промежутке между соседними коллагеновыми молекулами откладывается кальций. Аналогичная ситуация имеет место и в костях.
Структура шелка
Шелк чаще всего имеет структуру антипараллельного β-слоя, в котором β-цепи уложены вдоль оси волокна. Во многих разновидностях шелка расстояние между β-слоями поочередно составляет то 0,35, то 0,57 нм. Аминокислотная последовательность представляет собой в основном многократное повторение фрагмента Gly—Ala—Gly—Ala—Gly—Ser. Боковые цепи всех Ala и Ser при этом располагаются с одной стороны β-слоя, а с другой стороны выступают атомы водорода глициновых остатков. β-Слои упакованы таким образом, что друг с другом контактируют одноименные их поверхности. Расстояние между слоями, контактирующими по «глициновым» поверхностям,
составляет 0,35 нм, а по поверхностям, в которых выступают остатки Ala и Ser, — 0,57 нм. Волокна шелка малорастяжимы, поскольку любое достаточно большое удлинение приводит к разрыву ковалентных связей в полипептидной цепи. Некоторая растяжимость тем не менее наблюдается и может быть обусловлена нарушением регулярности аминокислотной после- довательности и появлением в цепи остатков с массивными боковыми группами, таких, как Туг, Arg, Asp и Glu. А этих местах β-структура нарушается, по- липептидная цепь принимает нерегулярную конфор- мацию и может быть растянута без разрыва кова- лентных связей.
Кератин
КЕРАТИН— важный белковый компонент волос, шерсти, ногтей, когтей и перьев. В одной из форм, называемой α-кератином, в основе структуры полипептидной цепи лежит правая α-спираль. Предположение о том, что кератин имеет α-спиральную конформацию, было высказано Полингом и Кори для объяснения полученных Астбюри в 30-х годах данных по дифракции рентгеновских лучей на волокнах кератина. Однако шаг кератиновой спирали составил 0,51 нм, что меньше шага стандартной ос-спирали, равного 0,54 нм. Это связано с тем, что в кератине две, а возможно и три цепи закручиваются одна вокруг другой, образуя некую витую (coiled-coil) структуру, называемую протофибриллой. 11 протофибрилл формируют микрофибриллу, а пучок микрофибрилл — кератиновое волокно. α-Кератины легкорастяжимы, поскольку при вытягивании разрываются водородные связи и поли-пептидные цепи приобретают β-структурную конформацию. При этом образуются межцепочечные водородные связи и формируются β-слои. Кератины с такой структурой называются β-кератинами.
Тропомиозин
ТРОПОМИОЗИН— это фибриллярный белок, обна- руживаемый в мышцах (гл. 36) и состоящий из двух закрученных одна вокруг другой α-спиралей, подобно тому как это имеет место в α-кератине.
Фермент
Фермент — это белок, который увеличивает скорость биохимической реакции (т. е. работает как катализатор). Скорость реакции при этом может возрастать до 1010 раз по сравнению со скоростью той же реакции в отсутствие фермента.
Субстрат
Субстрат - это молекула (обозначаемая S), которая после взаимодействия с ферментом (Е) превращается в продукт (Р).
Активный центр фермента
Активный центр фермента молекулы белка, где может связываться субстрат (или субстраты) с образованием фермент-субстратного (E—S) комплекса. Активный центр почти всегда построен всего лишь из нескольких аминокислотных остатков. Хотя эти остатки пространственно сближены, в линейной белковой молекуле они часто далеко отстоят друг от друга. Как правило, формирование
Е—S-комплекса происходит без образования кова- лентных связей, а осуществляется за счет более сла- бых, но и более специфических типов взаимодейст- вий, таких как водородные связи, солевые мостики, гидрофобные силы и плотная упаковка атомов. Одна- ко известны исключения, когда между ферментом и субстратом формируется ковалентная связь, напри- мер при образовании промежуточного продукта в хо- де функционирования ферментов, принадлежащих семейству сериновых протеиназ.
Специфичность фермента
Под специфичностью фермента понимают его способность отличать свой истинный субстрат от других родственных молекул. Такая избирательность обусловлена высокой специфичностью фермент- субстратных взаимодействий. Ранняя модель это вза- имодействия, называемая моделью «замка и ключа», была дополнена идеей «индуцированного соответст- вия» (см. ниже). Специфичность узнавания у разных ферментов значительно варьирует — некоторые фер- менты могут катализировать реакцию с участием только одного субстрата, тогда как другие — с не- сколькими химически родственными веществами. Например, формамидаза гидролизует только форма- мид, тогда как амидаза гидролизует любой алифати- ческий амид.
Аналогичный «замок-ключ» для объяснения специфичности ферментов была предложена в 90-х годах XIX в. Фишером: к ферменту (замку) подходит лишь свой субстрат (ключ).
Гипотеза «индуцированного соответствия»
Гипотеза «индуцированного соответствия» для объяснения специфичности ферментов была высказана Кошландом в 1959 г. Согласно этой ныне общепринятой гипотезе, связывание ферментов правильного субстрата индуцирует в белке небольшие конформационные изменения. В результате этих изменений каталитические группы фермента ориентируются таким образом, что становится возможным превращение субстрата в продукт. Дальнейшее развитие модели индуцированного соответствия связано с учетом того, что конформация субстрата при связывании с ферментом также может слегка изменяться. В этом случае говорят о напряжении в молекуле субстрата. Гипотеза о существовании конформационных изменений в ферменте и субстрате при их связывании друг с другом объяснила тот факт, что молекулы, очень похожие по форме на истинный субстрат, могут связываться с ферментом, но не превращаются в продукт, т. е. действуют как ингибиторы. Таким образом, правильный субстрат — это больше, чем просто «ключ» к соответствующему «замку».
Положение равновесия реакции
Положение равновесия реакции не зависит от при- сутствия или отсутствия фермента в реакционной смеси. Рассмотрим изменение свободной энергии для обратимой реакции S↔Р (соответствующий график приведен на предыдущей странице). Свободная энергия реакции ∆G0 равна разности свободных энергий S и Р и определяет положение равновесия реакции. В присутствии любого катализатора, в том числе и фермента, свободная энергия исходных реагентов (S) и продуктов реакции (Р) не изменяется и, следовательно, не изменяется ∆G0.
Переходное состояние, или активированный комплекс (обозначается X), - это высокоэнергетическая промежуточная структура, которая образуется во время реакции. Разность свободных энергий исходных реагентов (т. е. субстратов) и переходного состояния называется свободной энергией активации и обозначается ∆G‡ Скорость реакции зависит от величины ∆G‡: чем она меньше, тем больше скорость реакции, и наоборот.
Фермент увеличивает скорость реакции следующими способами.
Фермент увеличивает скорость реакции следующими способами.
1. Понижая свободную энергию переходного состоя ния путем стабилизации активированного комплекса.
2. Увеличивая энергию субстрата, когда тот связыва ется с ферментом при образовании фермент-субстрат ного (Е—S) комплекса. В итоге уменьшается разность свободных энергий Е—S-комплекса и переходного состояния.
3. Поддерживая микроокружение активного центра в состоянии, отличном от такового в водной среде. Час то у боковых цепей аминокислотных остатков, нахо дящихся в области активного центра, способность приобретать электрический заряд изменяется по срав нению с тем случаем, когда эти цепи целиком погру жены в водную среду. В результате боковые цепи мо гут обладать «повышенной реактивностью».
4. Располагая реагирующие атомы в правильной ори ентации и на необходимом расстоянии друг от друга, так чтобы обеспечить оптимальное протекание реак ции. Столкновения атомов в отсутствие фермента очень редко приводят к химической реакции, по скольку в этом случае очень редко атомы оказываются в правильной ориентации.
Ингибитор
Ингибиторами называются молекулы, которые, связываясь с ферментом, блокируют какую-то стадию ферментативной реакции. Ингибиторы бывают обратимыми и необратимыми. Обратимое ингибирование подразделяется на конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное.
Конкурентный ингибитор
Конкурентный ингибитор — это молекула, настолько похожая по своей структуре на молекулу субстрата, что фермент не может различить их. В результате связывания конкурентного ингибитора с активным центром фермента падает концентрация Е—S- комплексов и, следовательно, уменьшается скорость реакции. Ингибитор обычно в продукт не превращается.
Неконкурентный ингибитор
Неконкурентный ингибитор – это молекула, свя- зывающаяся не с активным центром, а с каким-то другим участком фермента. Поскольку связывание с неконкурентным ингибитором не мешает ферменту образовывать Е—S-комплекс, этот ингибитор не по-нижает концентрацию таких комплексов, а влияет на эффективность превращения S в Р.
Бесконкурентный ингибитор
Бесконкурентный ингибитор— это молекула, которая связывается только с фермент-субстратным комплексом и не может связаться со свободным ферментом. В односубстратных ферментных системах этот тип ингибирования встречается довольно редко.
Необратимый ингибитор
Необратимый ингибитор непрерывно модифицирует молекулы фермента, в результате чего они частично или полностью теряют свою активность.
Кинетические свойства
Кинетические свойства многих, но не
всех ферментов можно объяснить в рамках модели Михаэлиса-Ментен. Согласно этой модели, субстрат S связывается с ферментом Е с константой скорости к1. Образующийся фермент-субстратный комплекс Е—S может либо диссоциировать на Е и S с константой скорости к2 либо с константой скорости к3 превратиться в продукт Р и свободный фермент:
В модели предполагается, что продукт не может обратно превращаться в субстрат, что справедливо для ранних стадий реакции, когда концентрация продукта низка. Скорость реакции v связана с концентрацией субстрата [S] следующим соотношением:
где Vmax - максимальная скорость реакции, достигающаяся в том случае, когда все молекулы фермента связаны с субстратом, а
KM , константа Михаэлиса, численно равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной величины. KM — это мера сродства данного субстрата к ферменту (в том случае, когда к3 « к2), которое в свою очередь отражает прочность связывания субстрата с активным центром. График зависимости v от [S] представляет собой гиперболу.
График Лайнуивера-Бэрка
График Лайнуивера-Бэрка в двойных обратных координатах. Существует альтернативный способ представления уравнения Михаэлиса-Ментен — с помощью графика двойных обратных координат, предложенного Лайнуивером и Бэрком. Перепишем уравнение в виде
Кинетические свойства многих, но не
всех ферментов можно объяснить в рамках модели Михаэлиса-Ментен. Согласно этой модели, субстрат S связывается с ферментом Е с константой скорости к1. Образующийся фермент-субстратный комплекс Е—S может либо диссоциировать на Е и S с констан- той скорости к2 либо с константой скорости к3 превратиться в продукт Р и свободный фермент:
В модели предполагается, что продукт не может обратно превращаться в субстрат, что справедливо для ранних стадий реакции, когда концентрация продукта низка. Скорость реакции v связана с концентрацией субстрата [S] следующим соотношением:
Если построить зависимость 1/v от 1/[S], то мы полу- чим прямую с наклоном KM/Vmax, отсекающую от оси 1/v отрезок длиной 1/Vmx. Использование такой формы записи уравнения Михаэлиса— Ментен позволяет легко определить значения величин Vmax и KM
Конкурентные и неконкурентные ингибиторы
Конкурентные и неконкурентные ингибиторы
можно отличить друг от друга по тому, как в их присутствии изменяются кинетические свойства ферментной системы. Это легче всего проиллюстрировать с помощью графика Лайнуивера—Бэрка (рис. 13.2). Если поведение фермента подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен, то это свойство фермента будет сохраняться и в присутствии ингибитора — как первого, так и второго типа. Однако при добавлении конку
рентного или неконкурентного ингибитора график в двойных обратных координатах будет изменяться, причем в зависимости от типа ингибитора характер изменений будет различным.
Конкурентные ингибиторы увеличивают Км реакции, но не влияют на Vmax. Роль ингибитора, поскольку он конкурирует за активный центр фермента, сводится фактически к разбавлению субстрата. Следовательно, для достижения скорости реакции, равной половине Vmax, требуется теперь большая концентрация субстрата (которая, как известно, численно равна Км). Так как путем увеличения количества субстрата можно нейтрализовать действие ингибитора, Vmax не меняется.
НеконкурентныеингибиторыпонижаютVmax ,но не влияют на Км. Поскольку ингибиторы этого типа не мешают связыванию субстрата с активным центром фермента, величина Км не меняется. Механизм ингибирования состоит в снижении скорости, с которой субстрат в составе фермент-субстратного комплекса превращается в продукт, поэтому при неконкурентном ингибировании уменьшается лишь величина Vmax.
Регуляция активности фермента
РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА может осуществляться самыми разными путями, например с помощью активации зимогена (профермента), ковалентной модификации, ингибирования по типу отрицательной обратной связи, за счет кооперативных или аллостерических эффектов.
Зимоген
Зимоген — это неактивный предшественник фермента.
Чтобы зимоген превратился в активный фермент, какая-то часть (или части) его полипептидной цепи
должна быть отщеплена. Например, в семействе сериновых протеиназ химотрипсиноген и трипсиноген являются зимогенами соответственно химотрипсина и трипсина.
Ковалентной модификацией называется
Ковалентной модификацией называется ковалентное присоединение или отщепление от фермента небольшой химической группы, регулирующее его активность. С помощью таких модификаций обычно либо полностью неактивная форма фермента становится активной, либо, наоборот, полностью активный фермент инактивируется. Например, гликогенсинтаза из клеток млекопитающих, превращающая
глюкозу в гликоген, инактивируется после ковалентного присоединения фосфатной группы к боковой цепи одного из сериновых остатков и снова активируется при отщеплении фосфата.
Ингибирование по типу отрицательной обратной связи
Ингибирование по типу отрицательной обратной связи характерно для ферментных систем, в которых субстрат претерпевает несколько последовательных превращений, причем каждая реакция катализируется своим ферментом (см., например, ферменты Е, - Е4 на рис. 13.3). Ингибирование имеет место, если конечный продукт Т блокирует одну из более ранних стадий в цепи реакций, а для этого продукт Т должен быть либо структурно похожим на Р (т. е. действовать как конкурентный ингибитор), либо связываться с какой-либо другой частью фермента, регулируя таким образом его активность (т. е. выступать в роли неконкурентного ингибитора).
Кооперативные эффекты характерны для мульти-субъединичных белков, в том числе и для ферментов.
Если имеет место кооперативный эффект, то кинетические свойства фермента уже не описываются уравнением Михаэлиса-Ментен: график зависимости v от |S] в
этом случае представляет собой S-образную кривую, а не гиперболу, а график Лайнуивера-Бэрка перестает быть прямой (рис. 13.1). При этом небольшое увеличение концентрации субстрата будет приводить к значительному возрастанию скорости реакции. Для объяснения этого эффекта были предложены различные модели,
из которых наиболее известны модели Моно, Уаймена и Шанжё (симметричная модель), а также Кошланда, Немети и Филмера (последовательная модель).
Симметричная модель
В симметричной модели предполагается, что каждый мультимерный ферментный комплекс может существовать по крайней мере в двух разных состояниях с неодинаковой четвертичной структурой, причем в каждом состоянии все субъединицы имеют одинаковую третичную структуру. В простейшей модели рассматриваются два состояния, находящиеся в равновесии друг с другом. В одном из них белок имеет высокое сродство к субстрату (R-состояние, от англ. relax — ослаблять), а в другом — низкое (Т - состояние, от англ. tense - напрягать). Добавленный субстрат будет предпочтительно связываться с R-конформерами фермента, а связывание его с Т-конформером приведет к
возникновению напряжения в субъединицах фермента, что вызовет одновременный переход всех субъединиц в R-состояние (в котором напряжение отсутствует). При таком согласованном переходе сохраняется
молекулярная симметрия каждой мультимерной молекулы. При дальнейшем добавлении субстрата все
больше и больше молекул будет переходит из Т- в R-состояние. Такой сдвиг равновесия в присутствии субстрата представляет собой эффект положительной кооперативности. В результате этого эффекта график
зависимости v от [S] будет иметь S-образную форму (см. предыдущую страницу).
В последовательной модели предполагается что, отдельные субъединицы мультимерной молекулы могут в одно и в то же время иметь разные третичные структуры. При этом связывание субстрата одной субъединицей может вызывать изменение третичной структуры соседней субъединицы (или соседних субъединиц) и в результате увеличивать (положительная
кооперативность) или уменьшать (отрицательная кооперативность) их сродство к субстрату.
Аллостерическая регуляция
Аллостерическая регуляция (от греч. аллос — другой и стереос — тело, пространство) представляет собой эффект, наблюдаемый в тех случаях, когда небольшие молекулы (эффекторы), связываясь с ферментом не в
области активного центра, изменяют скорость реакции. Подобная регуляция может быть гомотропной, когда молекула субстрата, взаимодействуя с ферментом, изменяет его сродство к молекулам того же субстрата, и гетеротропной, когда сродство к субстрату изменяется при взаимодействии фермента с молекулой, не похожей на молекулы субстрата. Гомотропные и гетеротропные эффекторы могут быть активаторами или ингибиторами. Аллостерический активатор, действующий на фермент, описываемый симметричной
моделью, будет связываться предпочтительно с R-KOH-формером, стабилизируя это состояние. В результате
активатор будет увеличивать начальную концентрацию R-конформеров по сравнению с концентрацией Т-конформеров и, следовательно, увеличивать сродство фермента к своему субстрату (положительная кооперативность). Аллостерический ингибитор, наоборот, предпочтительно связывает и стабилизирует фермент, находящийся в Т-состоянии, вызывая таким образом уменьшение сродства фермента к своему субстрату (отрицательная кооперативность). В целом роль аллостерических эффекторов заключается в том, чтобы либо расширить (в случае ингибитора), либо сузить (в случае
активатора) диапазон концентраций субстрата, в котором фермент способен увеличивать скорость реакции.
Лизоцим
Лизоцим — это фермент, способный разрушать определенные бактериальные клетки, расщепляя полисахаридные цепи клеточной стенки. Лишенная жесткой
клеточной стенки, бактерия разрывается под действием осмотического шока, вызываемого быстрым проникновением воды внутрь клетки.
Полисахарид клеточной стенки
Полисахарид клеточной стенки представляет собой полимер, в котором чередуются остатки сахаров двух типов — N-ацетилглюкозамина (NAG) и N-ацетилмурамовой кислоты (NAM). Сахара, имеющие β-конфигурацию относительно аномерного С1-атома, образуют полимерную цепь с помощью гликозидных связей между С1 -атомом одного сахарного кольца и С4-атомом следующего (гл. 31).
Структура лизоцима
Лизоцим из белка куриного яйца состоит из одной полипептидной цепи, насчитывающей 129 остатков и имеющей четыре дисульфидных мостика (гл. 10). Фермент может связываться с ингибиторами, химически сходными с полисахаридом клеточной стенки. С помощью рентгеноструктурного анализа Филлипсом и др. была определена пространственная структура белка как такового и белка, закристаллизованного вместе с ингибитором. Оказалось, что лизоцим состоит из двух доменов, образующих щель, в которой находится активный центр, способный связать гексосахарид, причем для связывания каждого из шести сахарных колец на ферменте имеется свой участок (эти участки обозначаются буквами А, В, С, D, Е и F) (рис. 14.2).
Расщепление полисахарида
Расщепление полисахарида осуществляется путем гидролиза гликозидной связи между сахарными кольцами, располагающимися в участках D и Е. Анализ кристаллографических данных позволил предположить, что непосредственно перед и во время гидролиза сахарное кольцо в участке D имеет не обычную конформацию кресла, а конформацию полукресла,
характеризующуюся тем, что в ней пять из шести атомов, образующих сахарное кольцо, лежат практически в одной плоскости (рис. 14.3)
функционирование лизоцима
Центральную роль в функционировании лизоцима играют остатки глутаминовой кислоты 35 и аспарагиновой кислоты 52. Боковые цепи этих остатков располагаются близко к гликозидной связи (примерно на расстоянии 0,3 нм) между сахарными
кольцами, локализованными в участках D и Е. Glu 35 находится в неполярном окружении, и поэтому его карбоксильная группа остается протонированной
(т. е. находится в форме —СООН). Окружение Asp52, наоборот, полярно, поэтому карбоксильная группа этого остатка депротонирована (т. е. находится в
форме —СООН).
Реакция гидролиза
Реакцию гидролиза можно подразделить на
несколько этапов.
1. —СООН-группа остатка Glu 35 предоставляет свой
протон гликозидному кислороду, что приводит к разрыву связи между этим атомом кислорода и С,-атомом сахарного кольца, располагающегося в участке
D. Получившийся в результате фрагмент исходного полисахарида, включающей в себя сахарные кольца, которые находятся в участках Е и F, является продуктом и может освободиться из комплекса с ферментом.
2. Сахарное кольцо, располагающееся в D-участке, имеет искаженную конформацию, соответствующую конформации переходного состояния. При этом Сгатом оказывается положительно заряженным. Углеродный атом в таком состоянии называет
ся карбоний-ионом. Он стабилизируется с помощью отрицательного заряда близко расположенного остатка Asp 52.
3. Гидроксильный ион (ОН), донором которого служит молекула воды из окружающей среды, присоединяется к карбоний-иону, после чего второй фрагмент
расщепленного полисахарида становится продуктом реакции. Одновременно из-за связывания иона водо-рода (Н+) протонируется карбоксильная группа Glu 35,
переходя в форму —СООН.
4. Теперь фермент находится в первоначальном состоянии и готов осуществлять следующую реакцию рас-
щепления полисахарида.
Этот пример позволяет проследить некоторые общие принципы ферментативного катализа
1.Увеличение энергии субстрата за счет искажения структуры сахарного кольца NAM, находящегося в участке D.
2.Наличие необычного окружения Glu 35, обусловливающее появление реакционноспособного протона.
3.Правильная ориентация протона в Glu 35, необходимая для атаки гликозидной связи.
4.Уменьшение свободной энергии переходного состояния за счет стабилизации карбоний-иона карбоксильной группой остатка Asp 52.
Гемоглобин
Гемоглобин- это белок, переносящий кислород от легких к тканям и осуществляющий транспорт углекислого газа от тканей обратно к легким. Гемоглобин локализован в красных кровяных клетках — эритроцитах. Молекула гемоглобина состоит из четырех полипептидных цепей - двух идентичных ос-цепей (обозначаемых а, и а2) и двух идентичных р-цепей (обозначаемых р, и р2). Каждая цепь связана с особой
группой — гемом.
Миоглобин
Миоглобин — это белок, переносящий кислород в мышечных клетках. Он состоит из одной полипептидной цепи и имеет один гем.
Аминокислотная последовательность миоглобина отличается от последовательностей как α-, так и β-цепей гемоглобина, однако ме-жду всеми тремя последовательностями имеется определенное сходство (гл. 16). В каждой цепи содержится примерно 140—150 остатков.
Используя метод рентгеноструктурного анализа, Кендрью и Перутц с сотрудниками определили пространственные структуры миоглобина и гемоглобина.
Третичная структура α- и β-цепей гемоглобина
Третичная структура α- и β-цепей гемоглобина и цепи миоглобина оказалась сходной. Во всех трех полипептидах около трех четвертей остатков входит в
состав ос-спиралей. Все три цепи состоят из шести длинных ос-спиральных сегментов, обозначаемых А, В, Е, F, G и Н, в каждом из которых находятся от 10 до 25 остатков (гл. 10). В области между спиралями В
и Е структура цепей различается. В миоглобине имеются две дополнительные α-спирали, С и D, которые в цепях гемоглобина либо отсутствуют, либо деформированы. Общая укладка α-спиралей во всех трех
цепях настолько похожа, что принято говорить о «глобиновом типе сворачивания». Соседние вдоль цепи α-спирали связаны перемычками из нескольких
остатков. Эти перемычки имеют нерегулярные конформации. В глобинах остатки иногда обозначаются
согласно тому, какое место по порядку они занимают и в какой α-спирали. Например, HisF8 р-цепи — это восьмой остаток в α-спирали F, ValFG5 — пятый оста-
ток перемычки между ос-спиралями F и G, а ТугНС2 — это второй остаток в С-концевом нерегулярном участке, расположенном за α-спиралью Н.
Гем
Гем состоит из атомов углерода, азота и водорода, образующих плоское кольцо, называемое порфирином. В центре этого кольца находится атом железа,
связанный с атомами кольца четырьмя из шести своих возможных координационных связей.
К гему примыкают два остатка His. Ближайший гистидин (HisF8) связан с атомом железа через пятую
координационную связь. По шестой связи присоединен кислород.
Дальний гистидин (HisE7) располагается с
противоположной стороны порфиринового кольца по отношению к HisF8 и не образует связи с гемовым железом -здесь должно остаться достаточно
свободного пространства для размещения кислорода.
Дезоксигемоглобин
Дезоксигемоглобин — это гемоглобин, не связанный с кислородом. В дезоксигемоглобине атом железа находится вне плоскости порфиринового кольца и, кроме того, имеется несколько солевых мостиков и водородных связей, которых нет в оксигенированной форме белка. Некоторые из этих связей образуются
между атомами одной и той же цепи (например, водородная связь между ОН-группой ТугНС2 и карбонильным кислородом ValFG5 р-цепи), другие — между атомами, принадлежащими различным цепям (например, солевой мостик между LysC5 ос-цепи и концевой СОО-группой р-цепи).
Оксигемоглобин
Оксигемоглобин — это гемоглобин, связанный с кислородом. Кислород присоединен по шестой координационной связи атома железа гема и располагается рядом с дальним остатком гистидина. При связывании кислорода атом железа перемещается в плоскость порфиринового кольца. Одновременно с этим происходят
и некоторые другие конформационные изменения, в том числе сдвиг Е- и F-спиралей (рис. 15.1). Основная
перестройка происходит в четвертичной структуре гемоглобина — α1 и β1 цепи поворачиваются как единое
целое относительно α2- и β2 -цепей. В результате всех этих изменений в оксигемоглобине оказывается меньше солевых мостиков, чем в дезоксигемоглобине.
Связывание кислорода
Связывание кислорода миоглобином и гемоглобином можно описать с помощью кривых связывания,
представленных на рис. 15.3. Степень оксигенации гемогрупп зависит от концентрации присутствующего
в среде кислорода (на графике концентрация кислорода выражена в виде его парциального давления).
Для миоглобина график представляет собой гиперболу, что и следует ожидать при простом одноэтапном связывании. Однако в случае гемоглобина график
имеет S-образную форму; это говорит о наличии эффекта положительной кооперативности, т. е. о том,
что после оксигенации одной или большего числа субъединиц сродство остальных субъединиц к кислороду возрастает.
S-образность кривой связывания кислорода гемоглобином
S-образность кривой связывания кислорода гемоглобином объясняет, каким образом в тканях происходит освобождение кислорода из этого белка. Уменьшение парциального давления кислорода при переходе от артерий к венам приводит к снижению степени оксигенации от почти 100% до примерно 75%. Кислород, диссоциировавший из комплекса с гемоглобином в венах, подхватывается миоглобином, имеющим к нему большее сродство.
Кооперативные эффекты связывания кислорода
Кооперативные эффекты связывания кислорода гемоглобином можно объяснить в рамках симметричной модели Моно, Уаймена и Шанжё (гл. 13). Действительно, как и предполагается в модели, гемоглобин
может находиться в двух состояниях, различающихся взаимным расположением субъединиц и числом межсубъединичных контактов. Структура белка в одном
из состояний соответствует структуре дезоксигемоглобина, а в другом — структуре оксигемоглобина. В первом состоянии белок обладает меньшим сродством к кислороду и имеет больше солевых мостиков и
водородных связей, чем во втором. Согласно модели Моно, Уаймена и Шанжё, первое состяние гемоглобина — это Т-форма (tense-state), а второе — R-форма
белка (relaxed-state).
Положение равновесия между T- и R-формами
Положение равновесия между T- и R-формами зависит от концентрации кислорода — чем она выше, тем в
большей степени равновесие сдвинуто в сторону R-формы. Пусть какая-то молекулы гемоглобина не связана с кислородом и при этом находится в Т-состоянии. Связывание молекулы кислорода одной из цепей
вызывает конформационные изменения в гемогруппе этой цепи и далее во всей субъединице. Эти изменения
увеличивают вероятность перехода всей молекулы гемоглобина из Т- в R-состояние. Связывание второй и третьей молекул кислорода еще больше увеличивает
эту вероятность. Оказавшись в R-форме, гемоглобин еще легче связывает последнюю, четвертую молекулу
кислорода. В результате гораздо более вероятно, что молекула гемоглобина не будет связывать ни одной или связывать четыре молекулы кислорода, чем какое-либо промежуточное их число.
Эффект Бора
Эффект Бора, заключающийся в высвобождении протонов при присоединении кислорода к гемоглобину, очень важен для транспорта углекислого газа из тканей к легким.
Дифосфоглицерат(ДФГ)
Дифосфоглицерат(ДФГ), обнаруживаемый в эритроцитах, участвует в регуляции процесса присоединения кислорода к гемоглобину. ДФГ легко образует комплекс с дезоксигемоглобином, связываясь в щели между двумя β-цепями, но обладает низким сродством к оксигемоглобину. Поэтому присутствие ДФГ в высоких концентрациях уменьшает сродство гемоглобина к кислороду и вызывает высвобождение кислорода в ткани.
Гемоглобин
Гемоглобин плода человека (фетальный гемоглобин) отличается от гемоглобина взрослых тем, что в нем две β-цепи заменены двумя γ-цепями. Гемоглобин
плода связывает ДФГ менее сильно, чем дезокси-гемоглобин взрослых, и поэтому имеет более высокое сродство к кислороду. В результате, когда кровь плода
обогащается кислородом за счет материнской крови, что имеет место в плаценте, кислород переходит от матери к плоду с высокой эффективностью.
Глобины
Глобины — это группа белков, участвующих в транспорте кислорода. Они встречаются у высших эукариот, и на примере их эволюции будет рассмотрена эволюция белков вообще.
Известные аминокислотные последовательности разнообразных глобинов из многих видов можно совместить друг с другом. Для этого в некоторые последовательности иногда бывает необходимо включить
пропуски, как, например, в положение F10 при совмещении последовательностей α- и (β-цепей гемоглобина с последовательностью миоглобина.
Инвариантный остаток
Инвариантным называется такой остаток, который встречается в определенном положении любой из совмещаемых последовательностей. Инвариантность почти всегда является следствием того, что данный остаток играет особую функциональную или структурную роль.
Так, во всех миоглобинах и гемоглобинах в положении F8 обнаруживается His, поскольку он должен образовать ковалентную связь с железом гема.
Термин замена означает изменение остатка в определенном положении одной последовательности, обнаруживаемое при совмещении ее с другой. При
консервативных заменах сохраняются химические свойства боковых цепей; например, во всех глобинах остатки в положении F6 имеют полярные боковые цепи. Боковые цепи, находящиеся во внутренней части белковой глобулы, почти всегда неполярны, и эта неполярность сохраняется на протяжении всей эволюции белков. Остатки, расположенные на поверхности белков, подвергаются более частым и разнообразным заменам, поскольку в большинстве случаев на химические свойства их боковых цепей не налагается жестких ограничений.
Число различий в аминокислотных остатках
Число различий в аминокислотных остатках для любой пары глобинов определяют, совмещая соответствующие последовательности, а результаты таких
подсчетов для всего семейства глобинов могут быть представлены в виде таблицы. Для простоты часто считают, что каждый единичный пропуск эквивалентен одной замене. К примеру, при совмещении после-
довательностей миоглобина и α- и β-цепей гемоглобина сравнивают 155 положений и найденное число различий заносят в таблицу
Древо родственных связей
Древо родственных связей для глобинов строится на основе математического анализа числа различий в
аминокислотных остатках. В результате длина «пути» от белка из одного вида до общего предшественника (точка разветвления) и затем до белка из другого вида оказывается пропорциональной числу аминокислотных различий в сравниваемых последовательностях, которое, например, в случае пары р-цепь гемоглобина
цыпленка/р-цепь гемоглобина лошади равно 47, а для пары р-цепь гемоглобина человека/р-цепь гемоглобина лошади составляет 24.
Мутация
Мутацией называется любое изменение в нуклеотидной последовательности определенного гена (гл. 27). Наиболее часто происходят так называемые точковые мутации, связанные с изменением одного
азотистого основания, что влечет за собой изменение типа аминокислотного остатка в одном положении полипептидной цепи. Другие мутации приводят к вставкам или удалению одного или более аминокислотных остатков. Особым типом мутации является удвоение гена, в результате чего в организме появляются две копии одного и того же гена.
Согласно теории естественного отбора, в популяции фиксируются предпочтительно выгодные мутации, т. е. мутации, дающие организму какое-то преимущество.
Дивергентная эволюция белков
Дивергентная эволюция белков семейства глобинов. Все глобины имеют сходные последовательности. Этот
факт объясняется происхождением их от одного общего предка. Эволюция глобинов происходила, очевидно, по дивергентному пути с помощью мутаций. Число различий в аминокислотных последовательностях между любыми двумя белками непосредственно связано с числом мутаций, зафиксированных после того, как эти два белка разошлись от своего общего предка. Поэтому древо родственных связей служит схематическим изображением эволюционного процесса и является филогенетическим древом.
Предковый глобин
Предковый глобин как полагают, представлял собой
мономерный белок с включенной в него гемогруппой и уже обладал некоторой способностью переносить кислород. В результате удвоения гена появились две его идентичные копии, которые, последовательно подвергаясь мутациям, дали начало двум разным белкам. Поскольку между αα- и β-цепями гемоглобина существует меньше различий , чем между каждым из этих полипептидов и миоглобином, предполагают, что
первоначальное удвоение гена привело к возникновению примитивных миоглобина и гемоглобина, а разделение на α- и β-цепи произошло позднее, после удвоения гена примитивного гемоглобина.
Видообразование
Видообразование. С помощью целого ряда методов удается проследить пути развития различных биологических видов от их общего предка. Рассмотрим с
этой точки зрения ту часть филогенетического древа
глобинов, которая касается β-цепей. Видно, что β-цепи лошади и человека различаются меньше, чем β-цепи цыпленка и человека. Это означает, что в эволюционном отношении человек находится ближе к лошади, чем к цыпленку. В общем случае эволюционные связи между видами, установленные на основе анализа
β-цепей, довольно хорошо согласуются с соответствующими данными классической биологической таксономии. Фактически число аминокислотных различий между двумя видами может служить мерой времени, прошедшего после дивергенции их об общего предка. Значения времени, оцененные подобным способом, находятся в неплохом соответствии с аналогичными результатами, полученными с помощью
других методов, таких, например, как палеонтологическое датирование.
Скорость эволюции белков
Скорость эволюции белков можно определить как время, за которое происходит накопление в среднем
1% различий в аминокислотных последовательностях между двумя белками, дивергировавшими от общего предка. Скорость эволюции белков в пределах одного семейства постоянна (прямые на рис. 16.2), однако она сильно варьирует для белков, принадлежащих к разным семействам, что, по-видимому, связано с разным давлением отбора.
Гистон IV
Гистон IV — это сильно основ-
ный белок, связанный с ДНК, и в сущности любое изменение его аминокислотной последовательности скорее всего нарушило бы его функцию и оказалось летальным для организма. Поэтому гистон IV эволюционирует очень медленно (1% изменений в последовательностях за 600 млн. лет). Прямо противоположным примером служат фибринопептиды — фрагменты цепи фибриногена, отщепляющиеся при превращении его в фибрин в процессе свертывания крови. Очевидно, что сохранение определенной последовательности в данном случае не столь важно, поэтому скорость эволюции фибринопептидов весьма высока (1%
за 1 млн. лет).
Цитохром
Цитохром с — белок, состоящий при-
близительно из 105 аминокислотных остатков, — принимает участие в транспорте электронов, обнаруженном как у животных и растений, так и у бактерий.
Вследствие своей широкой
распространенности в природе цитохром с представляет собой прекрасную модель для изучения скорости эволюции белков.
Скорости эволюции и цитохрома с, и глобинов занимают промежуточное положение между скоростями эволюции фибринопептидов и гистона IV. По сравнению с глобинами цитохром с эволюционирует медленнее, что говорит о более жестких ограничениях,
налагаемых на структуру цитохрома с. Чтобы соотнести между собой временную шкалу, изображенную на рисунке, с той, которая используется в классической
таксономии, нужно принять во внимание, что растения и животные дивергировали около 1200 млн. лет назад, а видообразование у млекопитающих происходило в последние 100 млн. лет.
Серповидноклеточная анемия
Серповидноклеточная анемия — заболевание, возникающее при замене остатка глутаминовой кислоты
в шестом положении р-цепи гемоглобина на остаток валина. Это единственное изменение приводит к уменьшению растворимости дезоксигемоглобина и к
появлению у него способности агрегировать с образованием длинных волокон. В результате эритроциты приобретают вытянутую форму, напоминающую
серп. Деформированные таким образом, они могут закупоривать капилляры, нарушая нормальное кровообращение, либо легко подвергаться лизису, что и является непосредственной причиной наблюдаемой анемии. Замена Glu на Val не влияет на растворимость оксигемоглобина. Шестой остаток Р-цепи находится на поверхности тетрамерного гемоглобина. Вместо за-
ряженной боковой цепи Glu серповидноклеточный гемоглобин несет в том же положении неполярную
боковую цепь Val. В дезоксигемоглобине этот неполярный участок непосредственно контактирует с комплементарным неполярным участком, расположенным на поверхности другого тетрамерного гемоглобина, вызывая тем самым слипание молекул.
Предполагают, что в оксигемоглобине комплементарный участок по каким-то причинам не может взаимодействовать с шестым Val, и поэтому агрегации
не происходит.
Пространственная структура
Пространственная структура α- и β-цепей
гемоглобина человека и миоглобина кита была определена с помощью рентгеноструктурного анализа.
Оказалось, что, несмотря на большое число различий в аминокислотных остатках, для всех трех белков характерен одинаковый способ трехмерной укладки цепей, известный под названием «глобинового типа
сворачивания» (гл. 15). Это связано с одинаковым функциональным назначением всех трех белков — обеспечить подходящее окружение для гема, удерживающего кислород. Таким образом,
выполняемая функция налагает на
пространственную структуру белков более строгие ограничения, чем на их аминокислотную последовательность, и первая эволюционирует медленнее, чем
вторая. Это позволяет высказать предположение о наличии эволюционных связей между различными белками (или отдельными частями различных белков),
имеющими похожие пространственные структуры, даже если у этих белков не обнаруживается сходства в последовательностях.
Нуклеиновые кислоты
Нуклеиновые кислоты - дезоксирибонуклеиновая
(ДНК) и рибонуклеиновая (РНК) — это полимерные макромолекулы, участвующие в хранении и переносе генетической информации. Они построены из мономерных звеньев — нуклеотидов.
Нуклеотид
Нуклеотид состоит из трех частей — азотистого основания, моносахарида (сахара) и одной или нескольких фосфатных групп. В составе ДНК и РНК к нуклеотидам присоединена одна фосфатная группа.
Нуклеозид
Нуклеозид — это нуклеотид без фосфатной группы (групп). Таким образом, нуклеотиды являются фосфоэфирами нуклеозидов.
Сахар, входящий в состав нуклеотида
Сахар, входящий в состав нуклеотида –это
пентоза, которая может присутствовать в одной из двух форм: β-D-рибозы и β-D-2-дезоксирибозы.
Различие между ними состоит в том, что
гидроксильная (—ОН) группа рибозы при 2’-
углеродном атоме пентозы замещена в дезоксирибозе на атом водорода. Нуклеотиды, содержащие рибозу,
называются рибонуклеотида-ми и являются
мономерными звеньями РНК, а нуклеотиды,
содержащие дезоксирибозу, являются дезоксирибонуклеотидами, и из них строится ДНК.
Азотистые основания
Азотистые основания представляют собой производные одного из двух соединений - пурина или пиримидина. В нуклеиновых кислотах в основном присутствуют два пуриновых производных — аденин
(обозначаемый А) и гуанин (G) и три пиримидиновых — цитозин (С), тимин (Т) и урацил (U). В рибонуклеотидах
используются основания A, G, С и U, а в дезоксирибонуклеотидах — A, G, С и Т. Основание присоединяется к
сахару с помощью β-N-гликозидной связи, соединяющей С1’-атом пентозы с N1-атомом пиримидина или с N9-атомом пурина.
фосфатные группы
Одна, две или три фосфатнβые группы молут быть присоединены эфирной связью к 5’-углероду пентозы. Соответственно нуклеотиды называются нуклео-
зид-5’-моно-, нуклеозид-5’-ди- и нуклеозид-5’-трифосфатами и обозначаются сокращенно ХМР, XDP и ХТР, где X - то или иное азотистое основание. Для
обозначения трех разных положений фосфата используют буквы α, β и γ. При физиологических значениях рН (близких к 7) основания не заряжены. Однако од-
на, две или три фосфатные группы в ХМР, XDP и ХТР являются кислыми и несут два, три или четыре отрицательных заряда соответственно.
Номенклатура оснований, их нуклеотидов (в форме 5’-монофосфатов) и нуклеозидов приведена в табл.
17.1. Приставка перед обозначением нуклеотида указывает на то, что пентозой является дезоксирибоза.
Аденозинтрифосфат
Аденозинтрифосфат (ATP) —это главный поставщик энергии во всех клетках. Каждая их трех фосфатных групп может быть отщеплена путем гидролиза в форме ортофосфата (НРО2-4), который часто называют неорганическим фосфатом и обозначают Pj. Гидролиз сопровождается уменьшением свободной энергии (гл. 7):
Обычно ATP, ADP и AMP в клетке находятся в комплексе с ионами магния или марганца (Mg2+ или Мп2+).
РНК и ДНК построены соответственно из связанных коваленто рибонуклеотидных или дезоксирибонуклеотидных звеньев, образующих полинуклеотидные цепи. Звенья соединяются между собой с помощью фосфодиэфирных мостиков, связывающих 5’- гидроксильную группу одного нуклеотида и З’-гидроксильную группу следующего. При этом образуется
регулярная основная цепь фосфат—сахар—фосфат—сахар и т. д. Разные основания присоединены к сахарам аналогично тому, как присоединены боковые
группы в белках. Порядок следования оснований вдоль цепи называется первичной структурой нуклеиновой кислоты (ср. с белками, гл. 6). Полинуклеотидная цепь обладает полярностью, и, согласно принятому соглашению, последовательность оснований читается в направлении от 5’- к 3’-углеродному атому пентозы. О первом и последнем нуклеотидах говорят, что они на-
ходятся на 5’- и 3’-концах цепи соответственно.
Часто используют упрощенную форму записи химической структуры полинуклеотида. Можно указывать просто последовательность оснований, начиная с
5’-конца молекулы, например ACG; можно, кроме того, отметить с помощью буквы «р» положение фосфатных групп: pApCpG. Природу сахара указывают
буквой г (рибоза) и d (дезоксирибоза): dAdCdG. Применяют и схематическую запись, в которой вертикальной чертой обозначают пентозу; к ней приписывают букву, отвечающую тому или иному основанию.
Фосфатную группу, соединяющую сахара, изображают косой линией с буквой Р:
ДНК
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота — это биологическая макромолекула, носитель генетической информации во всех эукариотических и прокариотических клетках и во многих вирусах.
Исследования на пневмококках
Исследования на пневмококках, проведенные Эвери, Мак-Леодом и Мак-Карти в 1944 г., свидетельствовали о том, что именно ДНК является генетическим
материалом. Они рассмотрели две формы бактерий — инфекционную (вирулентную, обозначаемую S), образующую гладкие колонии на агаре, и мутантную,
невирулентную (обозначаемую R), образующую шероховатые колонии. Эвери и его коллеги показали, что ДНК, выделенная из убитых теплом S-бактерий, способна трансформировать невирулентную R-форму
в вирулентную, причем вирулентность трансформированных R-бактерий передавалась следующим поколениям. Отсюда следовало, что ДНК несет генетическую информацию.
Исследования бактериофага Т2
Исследования бактериофага Т2, проведенные Херши и Чейзом в 1952 г., позволили получить дополни-тельные данные о генетической роли ДНК. Эти авторы пытались выяснить, какой компонент вируса - ДНК или белок — ответствен за заражение бактерий Е. coll.
Они растили вирус в присутствии радиоактивных изотопов 32Р (чтобы пометить ДНК) и 35S (чтобы пометить бе-
лок) и инфицировали этим вирусом Е. coll. Оказалось, что инфицирующим агентом являются молекулы, содержащие 32Р. Таким образом, было показано, что информация, необходимая для образования новых вирусных частиц, содержится в вирусной ДНК.
МОДЕЛЬ СТРУКТУРЫ
ДНК
ДВОЙНАЯ СПИРАЛЬ – МОДЕЛЬ СТРУКТУРЫ
ДНК— была построена Уотсоном и Криком в 1953 г.
Согласно этой трехмерной модели, молекула ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей, которые об-
разуют правую спираль1 относительно одной и той же оси; отсюда название - двойная спираль. Направление цепей взаимно противоположное. Сахарофосфатный остов располагается по периферии двойной спирали, а азотистые основания находятся внутри, и их
плоскости перпендикулярны оси спирали.
Между основаниями образуются связи
Между основаниями образуются специфические водородные связи, в результате чего осуществляется так
называемое уотсон-криковское спаривание. Аденин всегда образует водородные связи с тимином, а гуанин с цитозином. Таким образом, более объемные пурины
всегда спариваются с пиримидинами, имеющими меньшие размеры. Это приводит к тому, что расстояния между С1`-атомами дезоксирибозы в двух цепях оказываются одинаковыми для AT- и CG-nap и
равными 1,085 нм. В результате AT- и GC-пары включаются в двойную спираль без какого-либо заметного
изменения геометрии остова.
Под комплиментарностью понимают
Под комплиментарностью понимают взаимное соответствие последовательностей оснований в про-
тивоположных цепях ДНК. Если в одной цепи в каком-то месте стоит аденин, то в другой в этом месте должен находиться тимин, и наоборот, так чтобы между основаниями могли образовываться специфические
водородные связи. Аналогично, если в одной из цепей в каком-то месте стоит гуанин, то в другой должен находиться цитозин, и наоборот. Комплементарность очень важна для копирования (репликации) ДНК
(гл. 20, 21).
Соотношения между числом разных оснований
Соотношения между числом разных оснований в ДНК, установленные, установленные Чаргаффом и др. в
50-х годах, сыграли важную роль в построении двойной спирали. Чаргафф обнаружил, что у ДНК самого разного происхождения количество аденина
равно количеству тимина, а количество гуанина — количеству цитозина, т. е и Эти равенства являются следствием избирательного спаривания оснований.
Геометрия двойной спирали
Геометрия двойной спирали такова, что соседние пары оснований находятся друг от друга на расстоянии 0,34 нм и повернуты на 36° вокруг оси спирали. На один виток спирали приходится, следовательно, 10 пар
оснований (360°/36° = 10), и шаг спирали равен 3,4 нм (10 * 0,34 нм). Диаметр двойной спирали равен примерно 20 нм. В двойной спирали ДНК образуются желобки. Это связано с тем, что сахарофосфатный ос-
тов расположен дальше от оси спирали, чем основания. В двойной спирали имеются два желобка — большой и малый.
Рентгенограммы волокон ДНК
Рентгенограммы волокон ДНК, полученные Франклин и Уилкинсом между 1950 и 1953 гг., дали очень важную для построения двойной спирали информацию.
Идеализированная дифракционная картина (рис.18.2) имеет вид креста из рефлексов (пятен), образующегося из-за регулярности структуры ДНК. Расстояние между слоевыми линиями отвечает периоду 3,4 нм, т. е. шагу двойной спирали, а сильный рефлекс
на 10-й слоевой линии — периоду 0,34 нм, т. е. расстоянию между парами оснований. Эти параметры относятся к В-форме ДНК (см. ниже).
Стабильность двойной связи
Стабильность двойной связи обусловлена разными взаимодействиями. Отчасти за нее ответственны водородные связи между основаниями. Однако, по-видимому, более важную роль играет межплоскостное
взаимодействие — стэкинг. При этом обеспечиваются не только выгодные вандерваальсовы контакты между
атомами, но и возникает дополнительная
стабилизация благодаря перекрыванию -орбиталей атомов контактирующих оснований. Стабилизация
осуществляется также за счет благоприятного гидрофобного эффекта, проявляющегося в том, что неполярные основания защищены от непосредственного
контакта с растворителем. Напротив, сахарофосфатный остов с его полярными группами и заряженными атомами экспонирован, что также стабилизирует
структуру.
Полиморфизм ДНК
Полиморфизм ДНК— это способность двойной спирали принимать различные конформации. Рентгеноструктурные исследования кристаллов полинуклеотидов1 выявили три основных типа структур — А-,
В- и Z-формы. В-ДНК— это стандартная уотсон-криковская структура, в которой плоскости пар оснований перпендикулярны оси двойной спирали. В А-ДНК
плоскости пар оснований повернуты примерно на 20° от нормали к оси правой двойной спирали. На виток
спирали здесь приходятся 11 пар оснований. А-ДНК образуется при высушивании волокон В-ДНК. Z-ДНК — это левая спираль с 12 парами оснований на виток. Буква Z указывает на зигзагообразную форму
сахарофосфатного остова ДНК в этой форме. Плоскости оснований примерно перпендикулярны оси спирали. В клетке ДНК обычно находится в В-форме, но отдельные ее участки могут находиться в А-, Z- или
даже в иной конформации1
секвенирование
Определение нуклеотидной последовательности ДНК (секвенирование) теперь не занимает много времени, и это крупное достижение позволило
молекулярным биологам решить очень важную задачу определения структуры генов (гл. 26— 28). Широко применяются два метода секвенирования: метод химического расщепления Максама и Гилберта и
метод обрыва цепи Сэнгера и др. Каждый из них может использоваться для секвенирования фрагментов ДНК длиной лишь несколько сотен оснований. Поэтому первый этап состоит в расщеплении
длинных цепей (например, целых хромосом) на фрагменты, с которыми можно вести дальнейшую работу.
Для этой цели применяют рестрицирующие ферменты.
Рестрицирующие ферменты
Рестрицирующие ферменты выделены из бактерий и бывают двух типов. При секвенировании используются только ферменты типа II, которые расщепляют
(разрезают) двухцепочечную ДНК в местах со специфической последовательностью оснований, обычно имеющей размер 4—6 пар оснований (гл. 30). Рестрицирующих ферментов очень много, и каждый из них
специфичен к определенной последовательности оснований. Например, фермент ЕсоR1 из Е. coli разрезает последовательность в местах, обозначенных стрелками:
Главная особенность последовательностей оснований, расщепляемых рестрицирующими ферментами,
заключается в том, что они, как правило, являются палиндромами: последовательности обеих цепей,
прочитываемые от 5’- к З’-концу, оказываются одинаковыми. Такие последовательности обладают осью
симметрии 2-го порядка, обозначенной на рисунке знаком
метода химического расщепления
В случае метода химического расщепления сначала метят 5`-конец молекулы ДНК радиоактивным ‘Образование Z-формы, крестообразных и иных структур стимулируется сверхспирализацией ДНК. — Прим. ред. 32РО4 с помощью фермента полинуклеотидкиназы.
Затем ДНК обрабатывают соответствующими реагентами, расщепляющими эту цепь около определенных оснований. Такое расщепление проводят в ходе четырех параллельных реакций в условиях, когда разрыв происходит после А в одной из реакций, после G в другой, после С в третьей и после С и Т в четвертой. Условия реакций таковы, что получаются смеси, содержащие фрагменты всевозможной длины, отсчитываемой от меченого 5’-конца до каждой точки цепи, где находится данное основание. Например, если G находится в положениях 1, 5, 7 и 19 во фрагменте из 20 оснований, то одна из смесей, полученных в ходе деградации, будет содержать радиоактивные фрагменты длиной 5, 7 и 19 оснований, а также свободный G. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле каждую из четырех смесей разделяют на фрагменты разной длины. Затем гель помещают на фотопленку, на которой появляется почернение в тех местах, где находился ра-
диоактивный материал (этот процесс называется радиоавтографией). Последовательность оснований
прямо считывается с пленки, как это показано, например, на рис. 19.3.
Метод обрыва цепи
Метод обрыва цепи использует другой подход. Он основывается на синтезе радиоактивно меченной комплементарной цепи ДНК с использованием в качестве матрицы нативной ДНК (гл. 20, 21). Синтез
осуществляется с помощью фермента ДНК-полимеразы I (гл. 20, 21). В реакционной смеси присутствуют четыре немеченных дезоксирибонуклеозидтрифосфата, из которых строится комплементарная цепь ДНК.
Однако помимо них в системе находится модифицированная форма одного из оснований (его 2’3’-дидезоксианалог), при включении которой рост цепи прекращается. В результате синтезируются цепочки
ДНК всевозможной длины. Используются четыре реакционные смеси, в каждую из которых добавляют помимо четырех мономеров аналог одного из оснований в качестве терминатора роста цепи. Затем цепи в каждой смеси разделяют с помощью гель-электрофореза и проводят радиоавтографию. С полученной фотопленки непосредственно считывают последовательность оснований. Метод Сэнгера и др. был развит на основе более раннего, так называемого плюс-минус-
метода, в котором также использовался синтез комплементарных цепей ДНК.
Структура РНК
Рибонуклеиновые кислоты (РНК) , присут-
ствующие в клетках как про-, так и эукариот, бывают трех основных типов: информационная (матричная, мРНК), транспортная (тРНК) и рибосомная (рРНК).
В ядре клеток эукариот содержится РНК четвертого типа — гетерогенная ядерная РНК (гяРНК). У некоторых вирусов РНК служит носителем генетической информации (гл. 5). мРНК является копией (транскриптом) соответствующей ДНК. Этот транскрипт служит матрицей для синтеза белка.
Каждые три последовательных основания мРНК (называемые кодоном) детерминируют один аминокислотный остаток. Молекулы тРНК переносят специфические аминокислотные остатки к определенному участку мРНК в ходе синтеза белка. В настоящее время структура тРНК хорошо известна (см. ниже). Молекулы рРНК встречаются в раз-
личных формах и образуют в комплексе с белками ри-
босому (гл. 24) — сложную органеллу, в которой про-
исходит синтез белка.
Сведберг
Сведберг (S)-единица измерения коэффициента седиментации, являющегося мерой массы макромолекулы (гл. 44). Его находят, измеряя скорость осаждения молекул в центробежном поле. Значения коэффициента седиментации РНК Е. coll приведены в табл. 19.1.
Транспортная РНК
Транспортная РНК (тРНК) узнает соответствующий кодон в мРНК и переносит нужную аминокислоту к растущей полипептидной цепи. Узнавание кодона в
мРНК осуществляется с помощью трех последовательных оснований в тРНК, называемых антикодоном. Аминокислотный остаток может присоединяться к З’-концу молекулы тРНК.
Специфичность такой системы переноса
обеспечивается тем, что имеется по крайней
мере одна тРНК для каждой аминокислоты. Так, тРНК для Phe обозначается тРНКРЬе.
Химическая структура тРНК.
Молекула тРНК со-
стоит примерно из 75 нуклеотидов, ковалентно связанных друг с другом в линейную цепочку с мол. массой Мг = 25000 и коэффициентом седиментации 4S. Установлены нуклеотидные последовательности многих тРНК; первая из них — для тPHKAla из дрожжей — была определена Холл и в 1965 г. Все тРНК начинаются с фосфорилированного 5’-конца; первым основанием обычно является G. На З’-конце всегда присутствуют три основания — ССА и концевая З’- гидроксильная (—ОН) группа. Составляющими тРНК являются не только четыре обычных основания А, С, G и U, но также несколько необычных, или минорных, оснований.
Например, в дрожжевой тРНКРhе минорными основаниями являются псевдоуридин (обозначаемый Ψ), дигидроуридин (D) и основание, обозначаемое Y. Кроме того, в
некоторых обычных основаниях один или два атома водорода могут быть замещены на метильные (СН3) группы; метилированные или диметилированные основания отмечаются соответственно с помощью символов m или т2
при букве, обозначающей то или иное основание.
Клеверный лист
Клеверный лист — это структурное представление молекулы тРНК, полученное из условия образования максимального числа уотсон-криковских
пар оснований при данной нуклеотидной
последовательности. Участки, в которых с
помощью водородных связей образовались
такие пары оснований, называются стеблями, а одноцепочечные участки — петлями. Все известные тРНК образуют «клеверный лист» с четырьмя стеблями (акцепторным, D, антикодоновым и Т) и тремя петлями (D, антикодоновой и Т). Некоторые тРНК имеют дополнительные петли и/или стебли (например, вариабельная петля дрожжевой
тPHKPhe).
Трехмерная структура дрожжевой тPHKPhe
Трехмерная структура дрожжевой тPHKPhe была установлена с помощью рентгеноструктурного анализа кристаллов этой тРНК. Термин «вторичная структура» относится к расположению в пространстве атомов внутри стебля. Третичная структура - это пространственное расположение всех частей молекулы.
Вторичная структура
Каждый стебель состоит из двух
антипараллельных цепей, основания которых образуют друг с другом уотсон-криковские пары с помощью водородных связей. Такое пространственное расположение, установленное
экспериментально, было правильно предсказано исходя из структуры клеверного листа. Стебли имеют форму правой двойной спирали, известной как А-форма РНК.
Двойная спираль РНК в А-форме
Двойная спираль РНК в А-форме содержит 11 пар оснований на виток, шаг спирали равен 3,1 нм. Расстояние между соседними парами оснований вдоль оси спирали составляет 0,28 нм (3,1 нм/11); они
повернуты друг относительно друга на угол 33° (360°/11). Плоскости оснований составляют ~20° с нормалью к оси двойной спирали. А-форма РНК близка к А-фор-ме ДНК (гл. 18). РНК не способна переходить в В-форму. Это обусловлено присутствием в ней объемной 2’- гидроксильной группы рибозы, которой нет в дезоксирибозе.
Третичная структура тРНК.
Молекула напоминает по форме букву Г. Она значительно более вытянута, чем глобулярные белки той же молекулярной массы. Акцепторный и Т-стебли уложены в пространстве таким образом, что образуют одну непрерывную спираль — «перекладину» буквы Г; антикодоновый и D-
стебли образуют «ножку». Эти две части содержат каждая около 10 пар оснований. Почти все основания в тРНК участвуют в
вандерваальсовых и гидрофобных
взаимодействиях, стабилизирующих
пространственную структуру молекулы.
В тРНК имеются разнообразные водородные
связи.
В тРНК имеются разнообразные водородные
связи. В стеблях, являющихся двойными
спиралями, образуются уотсон-криковские
водородные связи. Многие основания,
расположенные вне стеблей, образуют во-
дородные связи с другими основаниями, но эти связи отличаются от уотсон-криковских.
Помимо этого 2’-гидроксильные группы
полинуклеотидной цепи также образуют
водородные связи — с основаниями и с атомами водорода основной цепи.
Антикодон молекулы тРНК
Антикодон молекулы тРНК - это три последовательных основания, с помощью которых распознается соответствующий кодон мРНК.
Узнавание осуществляется путем образования уотсон-криковских водородных связей между основаниями кодона, с одной стороны, и антикодона — с другой, при условии что полинуклеотидные цепи антипараллельны (рис. 19.2).
ДРУГИЕ МОЛЕКУЛЫ РНК.
ДРУГИЕ МОЛЕКУЛЫ РНК. К таким
молекулам относятся мРНК и одноцепочечная вирусная РНК. Их нуклеотидная последовательность также была определена
экспериментально. Эти исследования показали, что отдельные участки молекул РНК могут, подобно тРНК, образовывать шпильки, стабилизированные водородными связями.
Двухцепочечная вирусная РНК, по-видимому, находится в А-подобной форме. Для более подробного изучения строения всех этих молекул необходимы рентгеноструктурные исследования.
СЕКВЕНИРОВАНИЕ РНК
СЕКВЕНИРОВАНИЕ РНК в настоящее время
может осуществляться очень быстро, причем сразу для участков длиной в несколько сотен оснований. Раньше эта процедура была весьма длительной и трудоемкой и можно было определять последовательность участков РНК длиной не более 100 оснований (как в работе
Холли 1965 г.; см. выше). Ныне для этой цели используется ряд методов. Здесь применяют два основных подхода — прямой подход и метод копирования.
СЕКВЕНИРОВАНИЕ РНК прямого подхода
В случае прямого подхода определяют последовательность оснований в самой РНК. Сначала метят 5’- или З’-конец молекулы РНК с помощью 32РО4. Затем
меченую цепь расщепляют с помощью ферментов, специфичных к определенным последовательностям. Проводя гель-электрофорез и радиоавтографию, получают
карту, по которой находят
последовательность оснований, подобно тому как это делается для ДНК (гл. 18).
СЕКВЕНИРОВАНИЕ РНК
В методе копирования вначале синтезируют цепочку ДНК, комплементарную РНК, и затем с помощью методов, описанных в гл. 18, определяют ее нуклеотидную
последовательность. Для получения комплементарной цепи ДНК обычно используют обратную транскриптазу. Это фермент обнаружен в некоторых вирусах
и осуществляет обратную транскрипцию, т. е. катализирует процесс синтеза ДНК (обозначаемой кДНК), комплементарной РНК-матрице. (Обратная транскрипция — это процесс, играющий ключевую роль и
при клонировании генов; см. гл. 30.) Пусть, например, какой-то участок РНК имеет последовательность 3’- GGGUCA. Тогда кДНК будет иметь последователь-
ность 5’-GCCAGT. Применив метод химического расщепления для секвенирования ДНК (гл. 18), получают
радиоавтограмму, представленную на рис. 19.3.
Репликация ДНК
Репликация ДНК — это процесс, при котором информация, закодированная в последовательности оснований молекулы родительской ДНК, передается с максимальной точностью дочерней ДНК. Мы рассмотрим здесь репликацию только двухцепочечной ДНК; репликация одноцепочечной вирусной ДНК описана
в гл. 4.
полуконсервативной репликации
При полуконсервативной репликации дочерние клетки первого поколения получают одну цепь ДНК от родителей, а вторая цепь является вновь синтезированной. Такой же процесс повторяется при образовании дочерних клеток второго поколения из клеток
первого поколения. Таким образом, только две из четырех дочерних клеток второго поколения содержат по одной цепи исходной родительской ДНК, образующей двойную спираль с новосинтезированной цепью. Остальные две дочерние клетки второго поколения не содержат исходной родительской ДНК. Процесс полуконсервативной репликации на протяжении двух поколений иллюстрирует рис. 20.1.
Мезельсон и Сталь
Мезельсон и Сталь в 1958 г. доказали, что репликация ДНК происходит по полуконсервативному механизму. Сначала они выращивали бактерии длительное
время на среде, содержавшей тяжелый изотоп азота (I5N), который включался в ДНК, а затем переносили их на среду, содержащую обычный (легкий) изотоп
азота (14N). После репликации дочернюю ДНК первого поколения фракционировали по плотности. Оказалось, что вся дочерняя ДНК однородна и имеет плотность, промежуточную между плотностью тяжелой и легкой ДНК. Следовательно, одна цепь молекулы дочерней ДНК содержала I5N, а другая 14N, что отвечает полуконсервативному механизму репликации.
Спаривание оснований в родительской ДНК означает, что против G в одной цепи всегда располагается С, а против А - всегда Т. При репликации цепи родительской ДНК расплетаются, и каждая из них служит
матрицей, определяющей последовательность оснований в новой, комплементарной цепи ДНК. Таким
образом, информация, заключенная в последовательности оснований ДНК, с высокой точностью передается следующему поколению.
Инициация синтеза ДНК
Инициация синтеза в небольших геномах эукариот (вирусов) и прокариот (например, Е. coli) происходит в одной строго определенной точке. Репликация ДНК
у прокариот осуществляется довольно быстро: у Е. coli ее скорость составляет 1700 пар оснований в 1 с, так
что весь геном копируется за 40 мин. В более крупных клетках, например в клетках животных, репликация происходит медленнее — скорость ее составляет при-
мерно 50 пар оснований в 1 с. Однако инициация в этом случае осуществляется сразу в нескольких местах молекулы ДНК, т. е. в ДНК эукариот образуется много единиц репликации, называемых репликонами. В
результате хромосома дрозофилы, например, состоящая из 65 * 106 пар оснований, реплицируется за несколько минут. Для инициации репликации двухцепочечная ДНК должна расплестись в точке начала репликации и образовать петлю (рис. 20.2).
Репликативная вилка
Репликативная вилка - это та часть молекулы ДНК, которая уже расплелась и в данной момент служит матрицей для синтеза дочерней ДНК. В ходе репликации репликативная вилка перемещается вдоль
молекулы.
Двунаправленная репликация
Двунаправленная репликация— это наиболее распространенный механизм репликации ДНК. После инициации репликация идет одновременно в обоих
направлениях вдоль цепи ДНК. Для осуществления синтеза двойная спираль родительской ДНК должна раскрутиться и ее цепи должны разойтись. В этих процессах участвуют различные белки (гл. 21). В линей-
ной ДНК раскручивание осуществляется путем вращения одной цепи вокруг другой. В двухцепочечной кольцевой ДНК, например в ДНК Е. coli, раскручивание и репликация ведут к образованию структуры, напоминающей кольцо с внутренней петлей. Ее называют тэта-петлей, поскольку по форме она похожа на греческую букву Θ.
Кэрнс
Кэрнс первым наблюдал такие петли с помощью радиоавтографии. Культуру Е. coli выращивали на среде, содержавшей радиоактивные нуклеотиды, которые включались в ДНК. Затем реплицирующуюся
ДНК наносили на фотопленку, на которой и получалось изображение Θ-петли.
Однонаправленная репликация
Однонаправленная репликация — более редкое явление; она наблюдается у некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК, например у вируса
фХ174. Однонаправленная репликация происходит после образования двухцепочечной формы ДНК в
клетке-хозяине. Механизм, с помощью которого это осуществляется, называется механизмом катящегося кольца. В одной из цепей ДНК (наружной на рис. 20.2)
образуется разрыв, и синтез новой цепи начинается с З’-конца этой разорванной родительской цепи с использованием второй (внутренней) в качестве матрицы. Это приводит к вытеснению 5’-конца наружной
цепи, которая впоследствии служит матрицей для синтеза другой новой цепи.
Репликация у прокариот
E.coli - это бактерия, содержащая двухцепочечную кольцевую ДНК. Репликация ДНК Е. coli изучена весьма детально, и нам известны механизмы многих стадий этого процесса. Эти механизмы характерны для репликации всех прокариот. Аналогичным образом протекает репликация у эукариот, но в ней участвуют другие ферменты.
ДНК-полимеразы
ДНК-полимеразы — это ферменты, участвующие в синтезе ДНК. Ферменты присоединяют нуклеотид к
—ОН-группе на З’-конце одной из цепей ДНК, которая, следовательно, растет в направлении 5’ —> 3’. Поэтому говорят, что данные ферменты обладают 5’ —> З’-полимеразной активностью. Для синтеза новой цепи ДНК необходимы: 1) ДНК-матрица, которая может быть как в одно-, так и в двухцепочечной форме;
2) дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (ATP, CTP, GTP и ТТР) и 3) З’-ОН-группа нуклеиновой кислоты-затравки, к которой присоединяется следующее основание. Схема реакции показана на рис. 21.2.
ДНК-полимеразы
Выделены три ДНК-полимеразы — I, II и III, обозначаемые polI, polII и polIII. Хотя первой была выделена polI (Корнбергом в 1958 г.), основным ферментом , катализирующим синтез растущей цепи ДНК, является polIII. PolI участвует в процессе созревания (см. ниже), роль роШ неясна. Помимо 5’ —> З’-полимеразной активности все три фермента проявляют способность деградировать ДНК, отщепляя нуклеотиды в направлении У —> 5’, т. е. являются У —> 5’-экзо-нуклеазами. Poll и pollII обладают также 5’ —> З’-экзо-нуклеазной активностью.
Репликативная вилка ДНК
Репликативная вилка – это та часть молекулы ДНК, в которой в данный момент осуществляется синтез новой ДНК. Здесь родительская ДНК расплетена и находится в одноцепочечной форме. Каждая из цепей служит матрицей для синтеза новой ДНК. В ходе синтеза репликативная вилка перемещается вдоль молекулы, и при этом расплетаются все новые участки родительской ДНК — до тех пор, пока вилка не дойдет до точки окончания синтеза (точка терминации). Поскольку ДНК-полимеразы катализируют репликацию только в направлении 5’ —» 3’, а цепи роди-
тельской ДНК антипараллельны, только одна из новых цепей синтезируется непрерывно; она называется
лидирующей. Вторая цепь, называемая отстающей, синтезируется в виде фрагментов, которые затем сшиваются (лигируются), и образуется непрерывная вторая цепь. Этот процесс называется созреванием.
Фрагменты ДНК, о которых идет речь, называются фрагментами Оказаки, по имени исследователя, который их впервые обнаружил. У прокариот они имеют
длину около 1000 нуклеотидов, а у эукариот — 100—200 нуклеотидов.
РНК - затравка
Для синтеза ДНК необходима РНК - затравка. Поскольку для своей работы ДНК-полимераза нуждается
в свободной З’-ОН-группе, возникает вопрос, как начинается синтез ДНК. В результате многочисленных исследований было показано, что синтез начинается
на маленьком фрагменте РНК, выступающей в роли затравки (праймера). Сначала фермент РНК-полимераза, не нуждающийся для инициации синтеза в свободной З’-ОН-группе, синтезирует короткую молекулу РНК (длиной 10—60 нуклеотидов), используя в качестве матрицы родительскую двухцепочечную ДНК.
Эта РНК-затравка остается спаренной с расплетенной ДНК и действует как место инициации синтеза, предоставляя свою свободную З’-ОН-группу для присоединения первого нуклеотида ДНК; эту последнюю
операцию производит ДНК-полимераза III. Аналогичная затравка образуется и перед синтезом отстающей цепи, но, поскольку матрицей для ее образования служит одноцепочечная ДНК, бактерии часто используют для синтеза РНК-затравки другой фермент - праймазу. РНК-матрица удаляется из молекулы ДНК в процессе созревания с помощью poll.
Удаление РНК-затравки
При созревании РНК-затравка удаляется как с 5’- конца лидирующей цепи, так и с 5’-концов фрагмен-тов Оказаки, а эти фрагменты сшиваются друг с другом. Удаление РНК-затравки осуществляется с помощью ДНК-полимеразы I, действующей как У —> 5’-экзонуклеаза. Этот же фермент присоединяет вместо удаленной РНК дезоксинуклеотиды, используя при
этом свою 5’ —> З’-полимеразную активность. Наконец, фермент ДНК-лигаза соединяет в нужном порядке фрагменты ДНК, катализируя образование фосфо-диэфирной связи.
Корректорская правка
«Корректорская правка» — это удаление неправильных (образующих некомплементарные пары) оснований,
включенных во вновь синтезированную ДНК. Этот процесс обеспечивает чрезвычайно высокую точность репликации, отвечающую одной ошибке на 109 пар оснований. Коррекция осуществляется в тех случаях,
когда к З’-концу растущей цепи присоединяется «неправильный» нуклеотид, неспособный образовывать нужные водородные связи с матрицей.
Когда polIII ошибочно присоединяет неправильное основание, «включается» ее 3’—5’-экзонуклеазная активность, и это основание немедленно удаляется,
после чего восстанавливается полимеразная активность. Такой простой механизм действует благодаря тому, что pollII способна работать как полимераза
лишь на совершенной двойной спирали ДНК с абсолютно правильным спариванием оснований.
Расплетание двойной спирали РНК
Расплетание двойной спирали РНК необходимо для того, чтобы цепи ДНК могли разойтись и играть роль матриц при репликации. У Е. сой имеется особый фермент, так называемый rep-белок, который выполняет функцию расплетания двойной спирали. Энергия, необходимая для этого, получается за счет гидролиза
АТР. Образовавшиеся при расплетании одноцепочечные участки ДНК стабилизируются в этом состоянии
целым рядом белков: это белок, связывающийся с одноцепочечной ДНК, белок, дестабилизирующий двойную спираль, ДНК-связывающий белок и белок, расплетающий двойную спираль.
Топоизомеразы
Топоизомеразы— ферменты,
катализирующие переходы в молекулах ДНК, связанные с изменением степени сверхспирализации.
ДНК, различающиеся только по степени
сверхспирализации, называются топологическими изомерами или топоизомерами, отсюда и название
ферментов — топоизомеразы. Одни топоизомеразы вызывают релаксацию сверхспиральной ДНК, а другие, напротив, приводят к появлению в ней сверхвитков (гл. 26). ДНК-гираза Е. coli переводит
двухцепочечную кольцевую ДНК в состояние с отрицательной сверхспирализацией. Это необходимо для снятия положительных сверхвитков, возникающих при репликации (и транскрипции; гл. 22) из-за
раскручивания двойной спирали ДНК.
Транскрипция ДНК
Транскрипция— процесс переноса генетической информации от ДНК к РНК. Все виды РНК - мРНК, рРНК и тРНК - синтезируются в соответствии с последовательностью оснований в ДНК, служащей матрицей. Транскрибируется только одна, так называемая «+»-цепь ДНК. Процесс транскрипции у прокариот и эукариот существенно различается.
ТРАНСКРИПЦИЯ У ПРОКАРИОТ
ДНК-зависимая РНК-полимераза — это фермент, катализирующий синтез РНК. Он состоит из несколько субъединиц: двух α, одной β, одной β’ и одной σ. Их комплекс называется холоферментом (α2ββ’σ) и
имеет мол. массу (Мг) около 500 000. Фермент, лишенный σ-субъединицы, называется кор-ферментом
инициация транскрипции У ПРОКАРИОТ
Для инициации транскрипции необходимы
холо-фермент, нуклеозидтрифосфат (всегда АТР или GTP) и наличие специального участка в ДНК, называемого промотором. Когда полимераза связывается с промотором, происходит локальное
расплетание двойной спирали ДНК и образуется открытый промоторный комплекс.
Промотр - это участок молекулы ДНК, имеющий размер около 40 пар оснований и расположенный непосредственно перед участком инициации транскрипции. Синтез РНК всегда начинается с оснований
А или G в «+»-цепи ДНК. Участок связывания холофермента расположен «левее» сайта инициации (в направлении 3’ - 5’ в «+»-цепи) на расстоянии примерно 10 оснований. Если сравнить последовательности оснований «+»-цепи ДНК у разных промоторов, то мы обнаружим, что они весьма близки, хотя и не
идентичны. Эта так называемая последовательность
Прибнова имеет вид TATPuATPu, где Ри означает пурин (А или G). Таким образом, холофермент связывается со специфической последовательностью или
группой последовательностей. Обычно на расстоянии около 40 оснований «левее» участка инициации находится второе место связывания РНК-полимеразы, где, как полагают, происходит связывание а-субъединицы с ДНК.
Элонгация цепи РНК У ПРОКАРИОТ
Элонгация цепи РНК— это та стадия транскрипции, которая наступает после присоединения примерно восьми рибонуклеотидов. В этот момент РНК-полимераза претерпевает структурное изменение, при котором от комплекса отделяется σ-субъединица и
остается кор-фермент (α2ββ’), катализирующий дальнейшее удлинение цепи РНК. При этом к цепи присоединяются те рибонуклеозидтрифосфаты, которые
обеспечивают правильное спаривание с «—»-цепью ДНК. Движущийся вдоль ДНК кор-фермент действует подобно застежке-молнии, «раскрывая» двойную спираль, которая замыкается позади фермента по ме-
ре того, как соответствующие основания РНК спариваются с основаниями ДНК в «—»-цепи. «Раскрытая» ферментом область простирается только на несколько пар оснований. На рис. 22.2 представлена химическая реакция удлинения цепи РНК от З’-конца.
Терминация У ПРОКАРИОТ
Терминация (прекращение роста) цепи РНК про-
исходит на специфических участках ДНК, называе-
мых терминаторами. Начало этих участков обычно
обогащено GC-парами, а остальная последователь-
ность — АТ-парами. GC-богатый участок часто пред-
ставляет собой палиндром. Это означает, что при дви-
жении вдоль «+»-цепи в одном направлении, а вдоль
«—»-цепи - в противоположном читается одна и та же
последовательность оснований. В остановке синтеза
РНК именно на терминаторе важную роль играет р-
белок .
Посттранскрипционный процессинг У ПРОКАРИОТ
Посттранскрипционный процессинг — это
процесс созревания, при котором первичный
РНК-транс-крипт модифицируется и превращается в зрелую
РНК. Характер и степень модификации РНК зависят
от типа РНК.
Молекулы мРНК у прокариот
Молекулы мРНК у прокариот не подвергаются
процессингу. У некоторых бактерий транскрипция и
трансляция сопряжены, т. е. происходят одновремен-
но. 5’-конец мРНК может транслироваться на рибосо-
ме и затем подвергаться деградации еще до заверше-
ния синтеза ее З’-конца. Молекулы тРНК вначале
синтезируются в виде про-тРНК, которая примерно
на 20% длиннее, чем соответствующая тРНК. Лиш-
ние последовательности, расположенные у 5’- и 3’-
концов, удаляются с помощью таких ферментов, как
рибонуклеазы Q и Р. Иногда молекула про-тРНК со-
стоит из двух или более молекул тРНК, соединенных
между собой. Их разделение также осуществляется с
помощью рибонуклеаз. Если З’-конец тРНК не несет
концевой последовательности ССА, то эти основания
присоединяются при постсинтетической модифика-
ции. Все тРНК содержат минорные основания (гл. 19),
которые являются химически модифицированными
формами четырех главных оснований (А, С, G и U).
Эта модификация происходит после завершения
транскрипции.
Гены рРНК прокариот
Гены рРНК прокариот расположены в транскрип-
ционных блоках. Три генарРНК Е. coli (16S, 23S и 5S)
(гл. 24) располагаются вместе с генами нескольких
тРНК в одном таком блоке и транскрибируются в ви-
де одной молекулы РНК. Эти молекулы рРНК и тРНК
отделены друг от друга спейсерной РНК. Расщепле-
ние первичного транскрипта на отдельные составляю-
щие катализирует рибонуклеаза Q; поскольку этот
фермент специфичен к двухцепочечной РНК, пред-
полагают, что в области спейсеров образуются двухце-
почечные шпильки, которые фермент узнает и выре-
зает.
ТРАНСКРИПЦИЯ И ЭУКАРИОТ
ТРАНСКРИПЦИЯ И ЭУКАРИОТ
У эукариот для транскрипции используются тр и
ДНК - зависимых РНК-полимеразы. Полимераза I
локализована в ядрышке, где она катализирует синтез
рРНК в виде большого первичного транскрипта, со-
держащего молекулы рРНК 18S, 5,8S и 28S. Полиме-
раза II находится в нуклеоплазме и, вероятно, участ-
вует в синтезе первичного транскрипта мРНК. Поли-
мераза III также локализована в нуклеоплазме и уча-
ствует в синтезе тРНК и 5S-pPHK.
Синтез РНК эукариот
Синтез РНК включает стадии инициации, элонга-
ции и терминации, но в этих процессах часто прини-
мают участие другие ферменты и последовательности
оснований, чем у прокариот. Например, промоторные
последовательности у эукариот отличаются от тако-
вых у прокариот. Однако первыми основаниями,
включаемыми в РНК при инициации, являются, как и
у прокариот, А или G.
Молекулы мРНК эукариот
Молекулы мРНК обычно образуются из больших по
размеру молекул-предшественников, называемых гетерогенной ядерной РНК (гяРНК). Для образова-
ния зрелой мРНК эти молекулы подвергаются моди-
фикации по 5’- и З’-концами и сплайсингу. После та-
кой модификации транскрипты переносятся из ядра в
цитоплазму.
Сплайсинг гяРНК эукариот
Сплайсинг гяРНК — это удаление
последовательностей РНК, соответствующих
интронам ДНК, и соединение участков, которые
транскрибированы с кодирующих
последовательностей (экзонов) (гл. 27). Место
сплайсинга должно быть определено с высокой
точностью, поскольку ошибка даже в одно основание
приведет к синтезу белка с неправильной аминокис-
лотной последовательностью. Такая специфичность
сплайсинга обеспечивается строго определенной пос-
ледовательностью оснований в интроне, отвечающей
обычно основаниям GU или GA в начале соответст-
вующей РНК и основаниям AG - в конце.
Модификация эукариот
Модификация 5’-конца мРНК приводит к образо-
ванию особой последовательности, называемой кэп-
структурой. При модификации З’-конца к нему при-
соединяется последовательность poly(A) длиной
150-200 нуклеотидов.
Процессинг тРНК у эукариот
Процессинг тРНК у эукариот протекаетпо такому же
механизму, как и у прокариот. Функционально
активные молекулы образуются из более длинного
предшественника, который подвергается
расщеплению и модификации с включением минор-
ных оснований.
Процессинг рРНК эукариот
Процессинг рРНК также аналогичен
соответствующему процессу у прокариот.
Первичный транскрипт содержит участки,
отвечающие 18S-, 5,8S- и 28S-рРНК (гл. 24),
разделенные спейсерами. Как и у прокариот, эти три
рРНК образуются при расщеплении спейсерных
последовательностей.
Генетический код
Генетический код связывает последовательность ос-
нований данного гена или его РНК-транскрипта с
аминокислотной последовательностью соответствую-
щего белка.
Код триплетный
Код триплетный, т. е. одна аминокислота задается
последовательностью из трех нуклеотидов, называе-
мой кодоном. В ДНК имеются четыре основания, а в
белках — 20 аминокислотных остатков; синглетный
код мог бы кодировать только четыре аминокислот-
ных остатка, дублетный 4 * 4 = 16 аминокислот, а три-
плетный образует 4 * 4 * 4 = 64 разных кодона.
Код не перекрывается т. е. в последовательности
оснований ABCDEFGHI первые три основания, ABC,
кодируют аминокислоту 1, DEF — аминокислоту 2 и
т. д. Если бы код был перекрывающимся, то последо-
вательность ABC кодировала бы аминокислоту 1,
CDE - аминокислоту 2 и т. д. Неперекрывающийся
характер кода относится только к случаю, когда рамка
считывания не меняется (см. ниже). В коде отсутству-ют запятые, т. е. нет знаков, отделяющих один кодон
от другого.
Направление чтения
Направление чтения закодированной записи — от
5’-конца к З’-концу мРНК, являющейся транскрип-
том «+»-цепи ДНК, считанным с нее в направлении
5’ -* 3’. Первый с 5’-конца кодон отвечает N-конце-
вой аминокислоте полипептидной цепи. Следова-
тельно, белки синтезируются от N-конца к С-концу.
Таблица кода
Таблица кода указывает, какая аминокислота коди-
руется тем или иным кодоном (рис. 23.1). В таблице на
рис. 23.1 первый (с 5’-конца) нуклеотид помещен в ле-
вом столбце, второй — в верхней строке, а третий (на
З’-конце) — в правом столбце. Из представленных в
таблице 64 кодонов 61 кодон детерминирует ту или
иную аминокислоту (например, CUA отвечает лейци-
ну Leu), а три остальных кодона являются сигналами
терминации (Терм.). Эти три кодона называются нон-
сенс-кодонами, поскольку они не определяют ника-
кой аминокислоты. Помимо этого, когда кодоны AUG для Met и иногда GUG для Val находятся в нача-
ле последовательности и соответствующие аминокис-
лоты должны быть помещены в начале белковой це-
пи, эти аминокислоты обычно присутствуют в виде N-
формильных производных (гл. 25). Когда же эти
кодоны находятся в любом другом месте последова-
тельности, то в пептидную цепь включаются нормаль-
ные Met и Val.
Код вырожден
Код вырожден, т. е. большинство аминокислот ко-
дируется более чем одним кодоном (см. табл. 23.1).
Например, Phe кодируется двумя кодонами, UUU и
UUC. Кодоны, которые определяют одну и ту же ами-
нокислоту, называются кодонами-синонимами. Вы-
рожденность кода, как правило, выражается в том,
что у кодонов, определяющих одну и ту же аминокис-
лоту, первые два основания фиксированы, а третье
положение может занимать одно из двух, трех или че-
тырех разных оснований. В частности, кодоны с од-
ним из двух пиримидинов (С или U) в третьем поло-
жении всегда являются синонимами, в то время как
кодоны с одним из двух пуринов (А и G) в третьем по-
ложении бывают синонимами лишь иногда. Различия
по всем трем положениям наблюдаются лишь в неко-
торых случаях (например, UCG и AGU оба кодируют
Ser).
Гипотеза «качания» была предложена Криком для
объяснения вырожденности кода по третьему поло-
жению основания в кодоне. Эта гипотеза, впоследст-
вии получившая подтверждение, состоит в том, что
соответствие третьего основания кодона первому ос-
нованию антикодона тРНК является нестрогим. Часто
первое положение в антикодоне тРН К бывает занято
необычным основанием инозином (I), которое может
образовывать водородные связи с U, С или А, на-
ходящимися в кодоне в третьем положении (рис.
23.2). Полный набор образующихся при этом пар
приведен в табл. 23.2. В связи с механизмом «качания»
клетке требуется меньше 64 разных тРНК. Каждая
тРНК может узнавать до трех кодонов.
Химические свойства
Химические свойства разных аминокислот
находят отражение в структуре кода. Все кодоны с U
во втором положении кодируют аминокислоты с
гидрофобной боковой цепью (Phe, Leu, He, Met и Val).
Если исключить терминирующие кодоны, то наличие
А во втором положении определяет полярную или
заряженную боковую цепь (Туг, His, Gin, Asn, Lys, Asp
и Glu).
Рамка считывания
Рамка считывания задает положение первого
основания кодона мРНК (или гена). Поскольку код
три-плетен, число возможных рамок считывания
равно трем. Обычно функциональный белок
синтезируется только при одной рамке считывания,
но некоторые вирусы используют две или даже три
рамки считывания, при этом синтезируются разные
белки (гл. 27). Примером такого рода могут служить
белки, кодируемые К-, С- и А-генами вируса G4 (рис.
23.1).
Мутация
Мутация— это изменение в последовательности
оснований генетического материала данного организ-
ма. Знание генетического кода позволяет объяснить
эффект некоторых мутаций.
Молчащая мутация
Молчащая мутация— это такое изменение в нук-
леотидной последовательности, которое приводит к
образованию синонимичного кодона, и в результате
аминокислотная последовательность кодируемого
белка не изменяется. Структура кода такова, что мол-
чащие мутации часто бывают обусловлены изменени-
ями оснований лишь в третьем положении кодона.
Замена
Замена (миссенс-мутация) ведет к замещению од-
ной аминокислоты другой в результате такого изме-
нения последовательности оснований, которое не
приводит к образованию синонимичного кодона.
Так, заболевание серповидноклеточная анемия (гл. 16)
возникает в результате замены Glu на Val в шестом по-
ложении (3-цепи гемоглобина человека. Это обуслов-
лено изменением кодона GAA на GUA, т. е. заменой А
на U во втором положении.
Мутация со сдвигом рамки
Мутация со сдвигом рамки обусловлена вставкой
или удалением (делецией) одного или большего числа
оснований в последовательности, так что при этом из-
меняется рамка считывания. Это приводит к измене-
нию аминокислотной последовательности белка от
точки мутации до С-конца молекулы.
Универсальность генетического кода
Универсальность генетического кода означает,
что все живые организмы — эукариоты, прокариоты и
ви-русы - используют один и тот же код. Хотя, вообще
говоря, это положение справедливо, проведенные
сравнительно недавно (1981 г.) определения нуклео-
тидной последовательности митохондриальных ДНК
человека и дрожжей выявили некоторые необычные
факты. Например, триплет UGA не является терми-
нирующим кодоном, а кодирует Тгр, а триплеты AGA
и AGC не кодируют Arg, а являются терминаторами.
Генетический код расшифрован
Генетический код был расшифрован в начале 60-х
годов Ниренбергом, Кораной и их сотрудниками.
Ниренберг получил клеточный экстракт Е. сой, со-
держащий все компоненты, необходимые для синтеза
белка, включая рибосомы, все тРНК и амино-ацил-
тРНК-синтетазы (гл. 24). В систему добавляли
полинуклеотид poly(U) (т. е. UUUUUUU…), функ-
ционировавший как искусственная мРНК. Оказа-
лось, что poly(U) детерминирует синтез poly(Phe)
(т. е. Phe, Phe, Phe…); следовательно, триплет UUU
кодирует Phe. Аналогичные опыты показали, что
триплет ССС кодирует Pro, а триплет ААА — Lys.
Следующий шаг заключался в использовании поли-рибонуклеотидов, содержавших два, три или четыре
разных основания, расположенных в случайном поряд-
ке. В результате этих исследований удалось определить
состав других кодонов, но не последовательность основа-
ний в них; так, было показано, что кодон, содержа-
щий 2U и 1G, детерминирует Cys, но порядок осно-
ваний оставался неизвестным. Корана использовал
полирибонуклеотиды не со случайной, а с заранее
заданной последовательностью и определил структу-
ру нескольких кодонов. Эти исследования получили
дальнейшее развитие с помощью другого подхода,
разработанного Ниренбергом. Он обнаружил, что
тринуклеотиды вызывают связывание специфичных
аминоацил-тРНК с рибосомой (гл. 24). Например, в
присутствии UGU с рибосомой связывается только
аминоацил-тРНК для Cys. Следовательно, UGU
кодирует Cys. Три кодона, UAA, UAG и UGA, не ко-
дируют никаких аминокислот и называются нон-
сенс-кодонами. Позднее исследования на мутантных
бактериофагах показали, что эти кодоны определяют
терминацию синтеза.
Трансляция
Трансляция — это процесс декодирования мРНК, в
результате которого информация с языка последова-
тельности оснований мРНК переводится на язык
аминокислотной последовательности белка. В этом
разделе описан трансляционный аппарат клетки; ме-
ханизм трансляции рассмотрен в гл. 25.
Синтез белка
Синтез белка осуществляется путем последователь-
ной поликонденсации отдельных аминокислотных
остатков, начиная с амино-(1М)-конца полипептидной
цепи, в направлении к карбоксильному (С)-концу.
Декодирование мРНК происходит соответственно в
направлении 5’ —> 3’.
Декодирование
Декодирование происходит при специфическом
связывании антикодона транспортной РНК (тРНК) с
соответствующим кодоном мРНК (гл. 19). До такого
взаимного узнавания кодона и антикодона к тРНК
присоединяется соответствующий аминокислотный
остаток: образуется аминоацил-тРНК. Этот процесс
называется активацией тРНК. Синтез белка происхо-дит в рибосоме. Все этапы этого процесса осуществля-
ются с помощью множества разных ферментов и дру-
гих белков (таких, например, как факторы инициа-
ции)(гл. 25).
Активация тРНК
Активация тРНК — это присоединение аминокислоты к
З’-концевому аденозину молекулы тРНК с об-
разованием аминоацил-тРНК. Этот процесс катали-
зируется ферментом аминоацил-тРНК—синтетазой, и
для каждой аминокислоты существует по крайней ме-
ре один такой фермент-катализатор. Источником
энергии для этого процесса служит гидролиз АТР. Ре-
акция выглядит следующим образом:
Аминокислота в аминоацил-тРНК соединена эфир-
ной связью (—О—) с 2’- либо З’-ОН-группой аденози-
на (рис. 24.2). Связывание фермента аминоацил-
тРНК—синтетазы со своей и только своей аминокис-лотой обеспечивается с очень высокой точностью: не-
правильная активация тРНК приведет к тому, что в
полипептидную цепь включится в данном месте не та
аминокислота, которая должна была бы быть. Суще-
ствует еще один механизм проверки правильности ак-
тивации, часто называемый механизмом корректор-
ской правки; суть его состоит в том, что соответству-
ющая синтетаза автоматически катализирует деаци-
лирование любой неправильно активированной
тРНК, в результате которого последняя диссоциирует
на исходные составные части, т. е. на свободную ами-
нокислоту и свободную тРНК.
Рибосома
Рибосома— это органелла, состоящая из двух субчастиц,
на которой происходит синтез белка. Каждая
субчастица представляет собой сложный комплекс из
белков и молекул РНК. В течение всего процесса син-
теза белка растущая полипептидная цепь, мРНК и очередная аминоацил-тРНК остаются прикреплен-
ными к рибосоме. Коэффициент седиментации рибо-
сом прокариот типа Е. coli составляет примерно 70S, а
у эукариот для рибосом, обнаруживаемых в цитоплаз-
ме, он равен 80S. Митохондрии и хлоропласты — орга-
неллы, присутствующие в эукариотических клетках, —
обладают своими собственными рибосомами с коэф-
фициентом седиментации 70S, которые во всем по-
добны рибосомам прокариот.
Диссоциация рибосомы
Диссоциация рибосомы на большую и малую субчастицы
in vitro происходит при низкой концентрации Mg2+.
708-рибосома прокариот состоит из 50S- и ЗОБ-
субчастиц, а SOS-рибосома эукариот - из 60S- и 408-
субчастиц. Эти субчастицы могут в свою очередь
диссоциировать на составные части — белок и рРНК
(рис. 24.3) — при соответствующей химической обра-
ботке. Весовое отношение рРНК: белок для рибосом
из прокариот и эукариот составляет соответственно
2:1 и 1:1.
нуклеотидная последовательность рРНК
У некоторых молекул рРНК определена
нуклеотидная последовательность. При анализе этих
последовательностей обнаружены участки, в которых
может происходить спаривание оснований и которые
могут участвовать в образовании вторичной
структуры, подобно тому как это происходит в
стеблях молекулы тРНК(гл. 19).
рибосомные белки
Многие рибосомные белки являются основными
благодаря наличию большого числа боковых цепей
Arg+ и Lys+. По всей вероятности, многие из этих по-
ложительно заряженных групп взаимодействуют с от-рицательно заряженными фосфатными группами мо-
лекул рРНК, что и стабилизирует комплекс белок—
нуклеиновая кислота.
Самосборка целой функциональной рибосомы
Самосборку целой функциональной рибосомы
из составляющих ее белков и рРНК удалось
осуществить in vitro. Это говорит о том, что сложная
структура рибосомы обусловлена исключительно
взаимодействиями между входящими в ее состав
молекулами.
Строение рибосомы
Строение рибосомы изучали с помощью электрон-
ного микроскопа. На рис. 24.4 представлены две вза-
имно перпендикулярные проекции 708-рибосомы из
Е. coli. «Габаритные» размеры рибосом прокариот со-
ставляют примерно 20 нм в наименьшем измерении и
30 нм в наибольшем. Более крупные (80S) рибосомы
эукариот подобны по форме своему аналогу из клеток прокариот, но примерно в 1,15 раза больше в любом
измерении (соответственно 23 нм х 35 нм).
Участки связывания на рибосоме
Участки связывания на рибосоме — это места, к ко-
торым присоединяется та или иная молекула, участву-
ющая в трансляции. Между большой и малой субчас-
тицами рибосомы остается узкая щель (рис. 24.4), за-
нимаемая молекулой мРНК. Подойдя к рибосоме,
очередная молекула аминоацил-тРНК соединяется с
участком, называемым участком {сайтом) Л. Другой
участок, обозначаемый Р, связывается с молекулой
пептидил-тРНК, несущей синтезируемую цепочку
(гл. 25).
Полисома
Полисома. или полирибосома, представляет
собой молекулу мРНК с несколькими
расположенными на ней активными рибосомами, на
каждой из которых синтезируется молекула белка
(рис. 24.1).
Если говорить в самых общих чертах, то синтез белка
Если говорить в самых общих чертах, то синтез
белка начинается с того момента, когда образуется
комплекс, состоящий из большой и малой субчастиц
рибосомы, мРНК и соответствующей аминоацил-
тРНК. Далее целая рибосома движется вдоль мРНК от
5’- к З’-концу. Такое перемещение сопровождается
ростом полипептидной цепи. После того как синтез
полипептидной цепи полностью завершен, она
отходит от рибосомы, которая в свою очередь
отщепляется от мРНК и диссоциирует на большую и
малую субчастицы. Эти субчастицы могут теперь
участвовать в синтезе другой молекулы белка;
подробнее весь процесс описан в следующей главе.
Механизм трансляции у прокариот на примере Е. colL
Стартовым сигналом
Механизм трансляции у прокариот мы опишем на
примере Е. colL
Стартовым сигналом к началу синтеза белка служит
расположенный на мРНК кодон AUG, кодирующий
метионин (Met) [иногда это кодон GUC для ва-лина
(Val)]. В растущей полипептидной цепи первым
аминокислотным остатком всегда будет либо Met, ли-
бо Val. Тогда возникает законный вопрос: каким обра-
зом клетка отличает стартовый сигнал от кодонов
AUG или GUC, расположенных в середине молекулы
мРНК? Эта проблема решается с помощью модифи-
цированной формы Met (или Val) и специальной ини-
циирующей тРНК (см. ниже).
Механизм трансляции у прокариот на примере Е. colL
Формилметионин
Формилметионин ( fMet) и является той модифи-
цированной формой Met, с которой начинается син-
тез белка. Он присоединяется к молекулам тРНК оп-
ределенного типа (тРНКг), отличным о тРНКМе„ по-
средством которых Met включается в срединную часть
полипептидной цепи. И тРНКг, и тРНКМе( узнают кодон
AUG, но лишь тРНКг способна присоединяться к
стартовому кодону AUG.
Механизм трансляции у прокариот на примере Е. colL
Инициация
Инициация синтеза белка начинается с момента
образования инициирующего комплекса на 30S-cy6-
частице, состоящего из мРНК, ЗОЭ-субчастицы рибо-
сомы и молекулы аминоацил-тРНКг с присоединен-
ным fMet, которая связывается с участком Р. Следую-
щим шагом является присоединение 508-субчастицы,
в результате чего образуется 705-инициирующий ком-
плекс. Источником энергии для инициации синтеза
белка служит реакция гидролиза GTP до GDP и Pj.
На этом этапе необходимы еще несколько белков, на-
зываемых факторами инициации (IF1, IF2 и IF3).
Механизм трансляции у прокариот на примере Е. colL
Элонгация
Элонгация — это последовательное включение
аминокислотных остатков в состав растущей поли-
пептидной цепи. Каждый акт элонгации состоит из
трех этапов: 1) узнавание кодона, 2) образование пеп-
тидной связи и 3) транслокация (рис. 25.1).
Механизм трансляции у прокариот на примере Е. col
Узнавание кодона
Узнавание кодона заключается в связывании анти-
кодона очередной молекулы аминоацил-тРНК с кодо-
ном свободного участка А на рибосоме. Чтобы при-
крепиться к рибосоме, тРНК с присоединенной к ней
аминокислотой должна сначала образовать комплекс
с белком, называемым фактором элонгации EF-Tu,
или EF1, который предварительно должен быть акти-
вирован с помощью GTP. После того как произойдет
связывание всего комплекса TPHK-EFI * GTP с уча-
стком А рибосомы, осуществляется гидролиз GTP до
GDP и Рь удовлетворяющий энергетические потреб-
ности на этом этапе элонгации. Фактор EF1 * GDP,
неспособный более связываться с тРНК, покидает ри-
босому, на которой остается аминоацил-тРНК. Реге-
нерацию активированного фактора EF1 катализирует
второй фактор элонгации, EF-Ts, или EF2, который
замещает GDP в неактивированном комплексе, в ре-
зультате чего образуется комплекс EF1 * EF2. Схема,
иллюстрирующая эту последовательность событий,
представлена на рис. 25.2.
Механизм трансляции у прокариот на примере Е. colL
Образование пептидной связи
Образование пептидной связи происходит лишь тогда,
когда оба участка, А и Р, заняты молекулами
аминоацил-тРНК. Часть 508-субчастицы представляет
собой фермент пептидилтранферазу, катализирую-
щий образование пептидной связи согласно схеме,
представленной на рис. 25.3. В результате этой реак-
ции растущая полипептидная цепь оказывается при-
соединенной к тРНК участка А, а тРНК участка Р вы-
свобождается из комплекса с пептидом и несет на З’-
конце группу —ОН (рис. 25.3).
Механизм трансляции у прокариот на примере Е. colL
Транслокация
Транслокация включает три акта, катализируемых
еще одним фактором элонгации, EF-G(EF3), и энер-
гетически сопряженных с гидролизом GPT. Сначала
тРНК участка Р, не связанная с пептидом, покидает
рибосому, затем молекула полипептидил-тРНК пере-
ходит с участка А на Р и, наконец, рибосома переме-
щается вдоль мРНК на три нуклеотидных остатка в
сторону З’-конца. В результате этих трех актов освобож-
дается участок А и экспонируется очередной кодон,
что позволяет начаться следующему циклу
элонгации.
Механизм трансляции у прокариот на примере Е. colL
Терминация
Терминация т. е. окончание синтеза, происходит по
команде кодонов UAA, UGA или UAG. В природе не
существует таких молекул тРНК, антикодоны ко-торых соответствовали бы этим кодонам. Вместо про-
должения синтеза цепи происходит терминация, ката-
лизируемая специальными белками, которые названы
факторами терминации и которые узнают терминиру-
ющие кодоны, когда свободен участок А. Эти факто-
ры изменяют специфичность фермента пептидил-
трансферазы таким образом, что происходит гидролиз
связи между концевым пептидом и тРНК, а освобож-
денная полипептидная цепь диффундирует от рибо-
сомы. Вслед за этим происходит диссоциация комп-
лекса мРНК—рибосома. Далее рибосома диссоцииру-
ет на 30S- и 505-субчастицы. После реассоциации
этих субчастиц с другой молекулой мРНК весь цикл
синтеза белка начинается сначала.
ТРАНСЛЯЦИЯ У ЭУКАРИОТ
ТРАНСЛЯЦИЯ У ЭУКАРИОТ, осуществляющаяся в
цитоплазме, включает такие же этапы, что и трансля-
ция у прокариот. Основным отличием здесь является
то, что первым остатком в растущей полипептидной
цепи является Met, а не fMet. Тем не менее и в этом
случае есть два типа молекул тРНК, узнающих кодон
AUG: один — когда кодон инициирующий, а другой —
когда он кодирует Met, который должен быть присо-
единен в середине растущей полипептидной цепи. В
роли факторов инициации и элонгации выступают
различные белки. Еще одно существенное отличие со-
стоит в том, что в цитоплазме эукариот рибосомы бо-
лее крупные (80S).
У митохондрий и хлоропластов трансляция
У митохондрий и хлоропластов трансляция осуще-
ствляется в самих этих органеллах. Рибосомы, кото-
рые они содержат, представляют собой 708-частицы и
похожи на рибосомы бактерий. При инициации ис-
пользуется fMet.
Упаковка генетического материала прокариот
Клетки прокариот содержат единственную копию ге-
номной ДНК и являются, таким образом, гаплоидны-
ми. ДНК прокариотической клетки, кодирующая все
клеточные белки и нуклеиновые кислоты (рРНК,
тРНК и др.), входит в состав хромосомы. Е. coli, на-
пример, содержит единственную хромосому, являю-
щуюся комплексом из ДНК, РНК и белков. ДНК
представляет собой кольцевую молекулу и содержит
4,6 * 106 пар нуклеотидов (или 4600 тысяч пар нуклео-
тидов, т.п.н.). Диаметр такого кольца составил бы
примерно 1 мм, но, поскольку сама Е. coli имеет в по-
перечнике менее 2 мкм, ее ДНК должна быть плотно
упакована (сконденсирована), чтобы поместиться
внутри клетки.
Упаковка генетического материала эукариот
Клетки эукариот устроены сложнее, чем клетки прокариот,
и все они, за исключением гамет, содержат две
совершенно одинаковые копии генома; другими
словами, они диплоидны. Клетка нематоды содержит
ДН К примерно в 40 раз, а клетка саламандры — в 40
000 раз больше, чем Е. coli. В клетке человека ДНК
примерно в 700 раз больше, чем в Е. coli. Поскольку
принято думать, что человек — это более сложный ор-
ганизм, чем саламандра, приходится заключить, что
на основе суммарного содержания ДНК в клетке мож-
но лишь весьма приблизительно судить о сложности
того или иного организма.Клетки эукариот устроены сложнее, чем клетки прокариот,
и все они, за исключением гамет, содержат две
совершенно одинаковые копии генома; другими
словами, они диплоидны. Клетка нематоды содержит
ДН К примерно в 40 раз, а клетка саламандры — в 40
000 раз больше, чем Е. coli. В клетке человека ДНК
примерно в 700 раз больше, чем в Е. coli. Поскольку
принято думать, что человек — это более сложный ор-
ганизм, чем саламандра, приходится заключить, что
на основе суммарного содержания ДНК в клетке мож-
но лишь весьма приблизительно судить о сложности
того или иного организма.
ДНК эукариотических клеток
ДНК эукариотических клеток находятся в ядре в
виде набора отдельных фрагментов, называемых хро-
мосомами. Каждая хромосома может содержать ДНК
в количестве от 400 (дрожжи) до 100 000 т.п.н. (чело-
век). Если бы всю клеточную ДНК в форме простой
двойной спирали вытянуть в одну линию, то она имела
бы слишком большую длину (1,74 м для клетки че-
ловека) и в таком виде не поместилась бы в ядре, поэ-
тому хромосомы должны представлять собой сильно
конденсированные структуры.
Вирусы могут содержать как одно-, так и двухцепо-
чечную ДНК, которая может быть как непрерывной,
так и состоящей из фрагментов. У некоторых вирусов
(например, ВТМ, реовирусы; гл. 5) генетическим ма-
териалом служит РНК, которая также может быть как
одно-, так и двухцепочечной.
Число генов
Число генов в различных организмах можно оце-
нить, исходя из того, что средняя длина гена составля-
ет 1 т.п.н. В табл. 26.1 приведены соответствующие
цифры.
Конденсация двухцепочечной ДНК, в результате
которой продольные размеры молекулы уменьша-
ются в 10 000 раз, осуществляется одним из двух
способов — путем сфероидальной намотки (т. е. свер-
тывания в витки по сфероидной образующей) либо
через образование сверхспиральной ДНК. Сферои-
дальная намотка по сути дела имеет место только в
вирусах, тогда как образование сверхспиральной
ДНК происходит во всех прокариотических и эука-
риотических клетках и во многих вирусах, поража-
ющих эукариот.
Сфероидальная намотка ДНК
Сфероидальная намотка ДНК происходит так, что в
результате образуется компактная «шпулька». В бак-
териофаге Т4 ДНК свернута в двухслойную «шпуль-
ку» внутри головки фага, имеющей форму икосаэдра.
Сначала образуются витки наружного слоя, затем —
внутреннего; между слоями остается некоторый про-
свет. Оставшийся конец ДНК проходит через оба слоя
и выводится в хвостовой отросток вируса через цент-
ральное отверстие (гл. 4). В других вирусах ДНК мо-
жет свертываться не совсем так, как в Т4, но во всяком
случае весьма похожим образом.
Сверхспиральная (сверхскрученная) ДНК образуется
при введении в двойную спираль ДНК дополнительных
витков (сверхвитков). В результате в молекуле воз-
никает напряжение, которое проявляется, в частности,
в том, что ось двойной спирали сама закручивается
в спираль (спирализуется), что и показано на рис.
26.2 на примере кольцевой замкнутой двухцепочеч-
ной ДНК.
Стабилизация компактных форм ДНК
Стабилизация компактных форм ДНК
необходима как в случае сфероидальной намотки
ДНК, так и для сверхспиральной ДНК, поскольку в
результате более плотной упаковки отрицательно
заряженные фосфатные группы оказываются в
непосредственной близости друг от друга. Взаимное
отталкивание между этими группами компенсируется
путем связывания их с положительно заряженными
белками и с малыми молекулами, представляющими
собой полиамины. Послед -ние содержатся во всех без исключения прокариоти-
ческих и эукариотических клетках, но отсутствуют во
многих вирусах. К числу полиаминов, обнаруженных
в эукариотических клетках, относится, например,
спермидин, структура которого изображена на рис.
26.3. Специфические белки, стабилизирующие моле-
кулу ДНК, есть в клетках любого типа, но лишь в не-
многих вирусах (например, в вирусе SV40).
Упаковка ДПК в клетках прокариот
Упаковка ДПК в клетках прокариот имеет,
вероятно, универсальный характер; покажем, как она
осуществляется, например, в бактерии Е. coli.
Сверхспиральный участок ДНК в комплексе с
гистоноподобными (см. ниже) белками,
обладающими сродством к ДНК, и полиаминами
образует «бусину» диаметром около 12 нм. Внутри
бусины ось двойной спирали ДНК перекручена и
образует примерно шесть витков. Бусины соединены
между собой участками ДНК, в которых
сверхспиральность отсутствует, и объединяются, таким
образом, в структуру, напоминающую ожерелье, четки
или бусы. Такая организованная в бусы ДНК образует
далее большие петли, которые стабилизируются и
окончательно конденсируются благодаря взаи-
модействию с соответствующими белками и РНК.
Упаковка ДНК в эукариотических клетках
Упаковка ДНК в эукариотических клетках
включает в себя ассоциацию сверхспиральной ДНК с
различными белками (гистонами), в результате
которой образуется комплекс, называемый
хроматином. Хроматин в свою очередь образует
соленоидоподобную структуру, с которой связываются
хромосомные структурные белки’, получившийся в
конечном счете комплекс называется хромосомой.
Хроматин
Хроматин состоит из двухцепочечной ДНК, кото-
рая обвивается вокруг особых гранул, состоящих из
специфических белков — гистонов. Так образуется
структура, похожая на бусы, которую называют хро-
матиновым волокном. Каждая бусина, называемая
нуклеосомой, имеет около 10 нм в диаметре (напри-
мер, в Е. coli). В результате конденсации ДНК в хро-
матин ее продольные размеры уменьшаются примерно
в 5—6 раз.
Нуклеосома
Нуклеосома представляет собой сегмент двухцепо-
чечной ДНК длиной около 200 пар оснований, нави-тый на белковую сердцевину, состоящую из восьми
молекул белков — гистонов. Ее структура, впервые ус-
тановленная Клугом с сотрудниками, изображена на
рис. 26.1. Нуклеосомы обнаружены во всех эукарио-
тических клетках и в некоторых вирусах, поражающих
эукариот. Гистоны представляют собой основные бел-
ки с мол. массой (А/г) от 11 300 до 21 000. Всего известно
пять типов гистонов: HI, Н2А, Н2В, НЗ и Н4. В нуклео-
сомную сердцевину входит по две молекулы гистонов
Н2А, Н2В, НЗ и Н4. Обращенные наружу поверхности
этих белковых молекул несут положительные заряды и
образуют стабилизирующий остов, вокруг которого
может закручиваться отрицательно заряженная моле-
кула ДНК. Гистон HI размещается на участках ДНК,
соединяющих одну нуклеосому с другой; ДНК этих
участков называют поэтому соединительной (или
линкерной) ДНК. Поскольку HI, по-видимому, не
участвует в стабилизации структуры хромосомы, он,
возможно, наряду с некоторыми другими белками,
не входящими в число гистонов, играет какую-то
роль в регуляции транскрипционной активности
хроматина.
Соленоидоподобная структура клеточного
хроматина
Соленоидоподобная структура клеточного
хроматина была предложена для того, чтобы
объяснить происхождение так называемых
гетерохроматиновых волокон толщиной 20—30 нм,
наблюдаемых в электронный микроскоп в
интерфазном ядре (гл. 29). Каждый такой соленоид
образуется в результате дальнейшей спирализации
уже спирализованной дополнительно в области
нуклеосом двойной спирали ДНК. На один виток
соленоида приходится примерно 6 нуклеосом. Этот
этап конденсации приводит к дальнейшему
уменьшению продольных размеров ДНК —
примерно в 40 раз по сравнению с размерами
двухцепочечной ДНК. В настоящее время считают,
что гетерохроматин представляет собой неактивную
в отношении транскрипции форму хроматина. По-
скольку продольные размеры ДНК в виде простой
двойной спирали и той же ДНК в сильно конденси-
рованной хромосоме различаются в 5 000—10 000 раз,
осталось еще объяснить, откуда берется множитель
100-200 [40 * 100(200) = 5 000(10 000)]. Пока, однако,
неизвестно, как происходит дальнейшая конденса-
ция соленоидоподобной структуры хроматина в его
хромосомную форму.
Хромосомные структурные белки
Хромосомные структурные белки образуют
каркас, на котором происходит окончательная
конденсация хроматина в структуру с наиболее
плотной упаковкой, характерной для
эукариотических хромосом. Этот белковый остов не
разрушается даже после удаления всех гистонов.
Структурный ген
Структурный ген- это наименьший отрезок ДНК или
РНК, кодирующий полную аминокислотную последова-
тельность какого-либо белка. В клетке высших организ-
мов может содержаться до 100000 генов (по последним
данным их существенно меньше). Однако ДНК в ней
столько, что ее хватило бы на образование в 10 раз боль-
шего числа генов. До сих пор не вполне ясно, зачем клет-
ке «лишняя» ДНК, хотя результаты последних исследова-
ний структуры эукариотической ДНК позволяют сделать
кое-какие предположения на этот счет (см. ниже). В ви-
русах может быть всего лишь 5—6 генов, а геном прокари-
от составляет примерно 0,1% от генома высших.
ХРОМОСОМА ПРОКАРИОТ
ХРОМОСОМА ПРОКАРИОТ содержит примерно 2000—
3000 неперекрывающихся генов, расположенных
вдоль ДНК. Структурные гены подразделяются на три основных типа: независимые гены, транскрипци-
онные единицы (транскриптоны) и опероны. Кроме то-
го, в клетке могут находиться более мелкие, автоном-
но реплицирующиеся единицы, называемые плазми-
дами.
Независимые гены
Независимые гены называются так потому, что их
транскрипция происходит без участия каких бы то ни
было механизмов регуляции транскрипционной ак-
тивности в отличие от двух других классов генов. При
этом говорят, что у такого гена конститутивная фор-
ма экспрессии, т. е. экспрессия без регуляции на
уровне транскрипции. Всякий структурный ген пред-
ставляет собой непрерывную последовательность ко-
донов, следующих вплотную друг за другом, а мРНК,
реплицированная с такого гена, всегда моноцистрон-
ная (под цистроном понимают нуклеотидную после-
довательность, кодирующую целиком одну белковую
цепь).
Спейсерная ДНК
Спейсерная ДНК располагается между генами и не всегда
транскрибируется. Иногда участок такой ДНК между
соседними генами (так называемый спейсер)
содержит какую-то информацию, относящуюся к ре-
гуляции и инициации транскрипции, но он может
представлять собой и просто короткие повторяющие-
ся последовательности избыточной ДНК, роль кото-
рой остается неясной.
Транскрипционные единицы
Транскрипционные единицы (транскриптоны)
представляют собой группу следующих друг за дру-
гом генов, транскрибируемых совместно. Обычно
это гены белков или нуклеиновых кислот, связанных
между собой в функциональном отношении. На-
пример, в Е. coli обнаружены транскрипционные
единицы, в которые входят гены различных рРНК
(каждый ген — в единственном числе) и ряд генов
разных тРНК. На рис. 27.1 изображена одна из таких
единиц: в нее входят два гена тРНК и три гена, соот-
ветствующие трем разным рРНК. Транскрипцион-
ные единицы с тремя и даже четырьмя генами тРНК
встречаются довольно часто, при этом в их располо-
жении относительно генов рРНК не наблюдается ни-
какой закономерности. Для этого класса генов моле-
кула мРНК представляет собой транскрипт целой
группы генов, поэтому такая мРНК называется по-
лицистронной.
Опероны
Опероны — это группы следующих подряд структурных
генов, находящихся под контролем определенного
участка ДНК, называемого оператором. Примером
может служить lac-оперон (гл. 28), состоящий из трех
структурных генов (Z, Y и А) и регуляторного участка
ДНК, который в свою очередь состоит из двух
последовательностей — промотора и оператора. Кро-
ме того, еще один ген, ген-регулятор (I), кодирует бе-
лок, так называемый репрессор, с помощью которого
происходит регуляция транскрипционной активности
lac-оперона. Известно несколько метаболитов, необ-
ходимых для жизнедеятельности клетки, биосинтез
или метаболизм которых контролируется фермента-ми, кодируемыми генами, которые организованы в
оперон (гл. 28). В опероне обычно не бывает спейсе-
ров.
Плазмиды
Плазмиды представляют собой небольшие кольцевые
молекулы ДНК разной длины. Крупные плазмиды
могут содержать до 100 генов. Такие плазмиды часто
(хотя и не всегда) несут генетическую информацию,
которая позволяет им переходить из одной клетки в
другую во время процесса, называемого конъюгацией.
В мелких плазмидах число генов может составлять
всего около 10, и они неспособны переходить из клет-
ки в клетку при конъюгации. Число генов в плазмиде
непостоянно. Обмен генетической информацией с ге-
номом клетки или с другими плазмидами происходит
путем переноса определенных участков плазмидной
ДНК, способных к перемещению (транспозиции), с
одной молекулы ДНК на другую и называемых поэто-
му транспозонами.
Транспозоны
Транспозоны - участки ДНК, способные к перемещению с
одной молекулы на другую, - часто содержат гены
резистентности (нечувствительности) к анти-
биотикам. Гены, которые оказались в транспозоне,
могут переходить от плазмид к хромосомной ДНК и
обратно. Таким образом, вследствие переноса плаз-
мид при конъюгации гены резистентности могут бы-
стро распространяться в популяции бактерий.
ВИРУСЫ, ПОРАЖАЮЩИЕ ПРОКАРИОТ,
ВИРУСЫ, ПОРАЖАЮЩИЕ ПРОКАРИОТ,
используют в качестве генетического материала как
ДНК, так и РНК. РНК в данном случае всегда бывает
одно-цепочечной (гл. 5). ДНК может быть и
двухцепочечной (как в бактериофагах Т2, Т4, Т5 и Т6),
и одноцепочеч-ной (как в бактериофаге фХ 174). Одно
из существенных различий в организации ДНК между
некоторыми вирусами прокариот, с одной стороны, и
прокариоти-ческими клетками — с другой, состоит в
том, что у этих вирусов в отличие от клеток есть
перекрывающиеся гены.
Перекрывание генов
Перекрывание генов наблюдается в том случае, когда одна и
та же нуклеотидная последовательность кодирует два
или три разных белка. Такие гены были впервые
обнаружены в колифаге (т. е. бактериофаге, пора-
жающем Е. coli) фХ174 Сэнгером с сотрудниками в
1977 г. Определив нуклеотидную последовательность
фаговой ДНК, они обнаружили, что три гена (обозна-
чаемые буквами К, С и А) занимают одно и то же по-
ложение в молекуле ДНК, но соответствующие этим
генам последовательности нуклеотидов прочитыва-
ются каждая в своей системе отсчета (со своей рамкой
считывания). Такое использование ДНК, хотя и дает
значительную экономию генетического материала,
сильно ограничивает возможность варьирования пос-
ледовательности, особенно в области кодонов иници-
ации и терминации различных белков. Так, для гена А
последним основанием первого изображенного на ри-
сунке кодона обязательно доложен бытьаденин, с ко-
торого начинается стартовый кодон гена С, кодирую-щий fMet. Аналогичным образом первым основанием
в третьем кодоне гена С также должен быть аденин,
поскольку им оканчивается терминирующий кодон
гена А.
КЛЕТКИ ЭУКАРИОТ
КЛЕТКИ ЭУКАРИОТ используют в качестве генети-
ческого материала лишь двухцепочечную ДНК. Струк-
турные гены, функционирование которых тесно связано
со специфическими последовательностями в молекуле
ДНК, называемыми регуляторными участками, под-
разделяются на независимые гены, повторяющиеся гены
и кластеры генов. В кодирующие последовательности
этих генов могут вклиниваться некодирующие, назы-
ваемые интронами. Кроме того, между генами могут
находиться участки ДНК с большим числом повторов
(сателлитной ДНК) и спейсерной ДНК, транскриби-
руемой или нетранскрибируемой.
Независимые гены
Независимые гены — это гены, транскрипция которых,
как и у прокариот, не связана с транскрипцией других
генов в рамках транскрипционной единицы. Их
активность может, однако, регулироваться экзо-
генными веществами, например гормонами.
Повторяющиеся гены
Повторяющиеся гены присутствуют в хромосоме
в виде повторов одного гена. Ген рибосомной 5S-PHK
повторяется много сотен раз, причем повторы распо-
лагаются тандемом, т. е. следуют вплотную друг за
другом, без промежутков. Близкие к нему в функцио-
нальном отношении гены 5,8S-, 18S- и 28S-pPHK так-
же присутствуют в виде многочисленных повторов, но
локализованы в ядрышковой ДНК.
Кластеры генов
Кластеры генов — это локализованные в определенных
участках (локусах) хромосомы группы различных
генов с родственными функциями. Кластеры тоже
часто присутствуют в хромосоме в виде повторов.
Например, кластер гистоновых генов повторяется в
геноме человека 10—20 раз, образуя тандемную груп-
пу повторов.
Интроны
Интроны - это участки ДНК, разбивающие экс-
прессируемую, т. е. кодирующую, часть гена на участ-
ки, называемые экзонами. Впервые феномен сущест-
вования прерывистых генов был открыт при изучении
аденовируса и подтвердился в 1977 г. при исследова-
нии гена глобина мыши и рибосомных генов плодо-
вой мушки Drosophila melanogaster. В одном гене может
находиться довольно много интронов; например, ген
яичного альбумина курицы содержит 8 интронов, об-
щая длина которых превышает сумму всех кодирую-
щих последовательностей в этом гене. В процессе
транскрипции РНК-полимераза снимает копию со
всего гена. Затем специальные сплайсинг-ферменты
осуществляют «монтаж» (сплайсинг) транскрипта, т. е. вырезают интроны и «склеивают» экзоны друг с
другом, в результате чего образуется зрелая, но еще
немодифицированная мРНК. Чтобы подобный «мон-
таж» мог осуществиться, на границах интронов с эк-
зонами в ДНК должны быть особые нуклеотидные
последовательности. Такая последовательность изо-
бражена на рис. 27.2; она встречается в геноме до-
вольно часто и после транскрипции может служить
участком узнавания для сплайсинг-ферментов. Далее
происходит нормальное созревание и трансляция
мРНК(гл. 22).
Сателлитная ДНК
Сателлитная ДНК состоит из обладающих харак-
терными особенностями нуклеотидных последова-
тельностей (их длина может составлять от 10 до 200
нуклеотидов), которые расположены тандемно и сот-
ни раз повторяются. Функция этой ДНК пока не вы-
яснена.
ВИРУСЫ. ПОРАЖАЮЩИЕ ЭУКАРИОТ,
ВИРУСЫ. ПОРАЖАЮЩИЕ ЭУКАРИОТ,
используют разные формы организации гена;
известны и такие вирусы, в которых есть как
перекрывающиеся, так и прерывистые гены.
Перекрывающиеся гены обнаружены, например, в
вирусе млекопитающих SV40, в ДНК которого имеется
участок (с 1488 по 1601 нуклеотид-ный остаток, считая
от точки начала репликации), кодирующий два белка:
VP1 и VP2. Таким образом, увеличение емкости
генетического материала благодаря использованию
нескольких систем отсчета (рамок считывания) при
кодировании встречается у вирусов как прокариот, так
и эукариот, но в геномах клеток ничего подобного пока
не обнаружено. В вирусе SV40 есть также прерывистые
гены. Один из генов поздней транскрипции,
кодирующий антиген TL (называемый обычно
«большим Т»: L = large = большой), расщеплен на два
экзона. Длина первого экзона (Т,) составляет 246 пар
оснований, второго (Т2) — 1879. Единственный раз-
деляющий их интрон имеет в длину 345 пар оснований
и вырезается из транскрипта гена TL при сплайсинге,
после чего происходит «склеивание» двух кодирующих
последовательностей.
28.
