Биохимия белков Flashcards
Биохимия
Биохимия – это наука о химическом составе живой материи, химических процессах, происходящих в живых организмах, а также связи этих превращений с деятельностью органов и тканей.Таким образом, биохимия состоит как бы из трех частей:1) статическая биохимия(это анализ химического состава живых организмов);2) динамическая биохимия(изучает совокупность превращения веществ и энергии в организме);3) функциональная биохимия(исследует процессы, лежащие в основе различных проявлений жизнедеятельности).
Главнымдля биохимии является выяснение функционального, то есть биологического назначения всех химических веществ и физико-химических физико-химических процессов в живом организме, а также механизм нарушения этих функций при разных заболеваниях.
Задачи
заболеваниях.Современная биохимия решает следующие задачи:1. Биотехнологическую, т.е. создание фармацевтических препаратов (гормонов, ферментов), регуляторов роста растений, средств борьбы с вредителями, пищевых добавок.2. Проводит разработку новых методов и средств диагностики и лечения наследственных заболеваний, канцерогенеза, природы онкогенов и онкобелков.3. Проводит разработку методов генной и клеточной инженерии для получения принципиально новых пород животных и форм растений с более ценными признаками.4. Изучает молекулярные основы памяти, психики, биоэнергетики, питания и целый ряд других задач.
Рассматривая процессы, протекающие в живых организмах, следует обратить внимание на отличия этих организмов от неживых тел. Таких важнейших отличий
несколько:
Обмен веществ между организмом и внешней средой является обязательным условием существования живого, тогда как у неживых тел он приводит к их разрушению, превращению в другие тела.
Живые организмы обладают способностью реагировать на внешние воздействия, изменяя ход реакций обмена веществ, и таким образом приспосабливаться к изменениям во внешней среде.
Для живых организмов присуща способность к размножению и передаче по наследству характерных признаков строения и обмена веществ.
Качественно новой ступенью в развитии материи является строгая упорядоченность протекания биохимических процессов, связанная с особенностями биологических структур.
Биохимия как молекулярный уровень изучения структурной
Биологическая химия изучает молекулярные процессы, лежащие в основе развития и функционирования организмов. Биохимия использует методы «молекулярных» наук — химии, физической химии, молекулярной физики, и в этом отношении биохимия сама является молекулярной наукой. Однако главные конечные задачи биохимии лежат в области биологии: она изучает закономерности биологической, а не химической формы движения материи. С другой стороны , «молекулярные изобретения» природы , открываемые биохимиками, находят применение в небиологических отраслях знания и в промышленности (молекулярная бионика, биотехнология). В таких случаях биохимия выступает в роли метода, а предметом исследований и
разработок являются проблемы, выходящие за пределы биологии.
Обмен веществ
Живые организмы находятся в постоянной и неразрывной связи с окружающей средой. Эта связь осуществляется в процессе обмена веществ. Обмен веществ включает 3 этапа: поступление веществ в организм, метаболизм и выделение конечных продуктов из организма.
Поступление веществ в организм происходит в результате дыхания (кислород) и питания. В ЖКТ продукты питания перевариваются (расщепляются до простых веществ). При переваривании происходит гидролиз полимеров (белков, полисахаридов и других сложных органических веществ) до мономеров, всасывающихся в кровь и включающихся в промежуточный обмен.
Промежуточный обмен (внутриклеточный метаболизм) включает 2 типа реакций: катаболизм и анаболизм.
Катаболизм
Катаболизм- процесс расщепления органических молекул до конечных продуктов. Конечные продукты превращений органических веществ у животных и человека - СО2, Н2О и мочевина. В процессы катаболизма включаются метаболиты, образующиеся как при пищеварении, так и при распаде структурно-функциональных компонентов клеток.
Реакции катаболизма сопровождаются выделением энергии (экзергонические реакции).
Анаболизм
Анаболизмобъединяет биосинтетические процессы, в которых простые строительные блоки соединяются в сложные макромолекулы, необходимые для организма. В анаболических реакциях используется энергия, освобождающаяся при катаболизме (эндергонические реакции).
Практически любое заболевание начинается с повреждения (нарушения) одной реакции в метаболизме клетки, а затем оно распространяется на ткань, орган и
целый организм. Нарушение метаболизма ведет к нарушению гомеостаза в биологических жидкостях организма человека, что сопровождается изменениембиохимических показателей.
Большое значение клинико-биохимических методов
Большое значение клинико-биохимических методов исследования биологических жидкостей велико в медицине и важно для подготовки медицинских лабораторных техников. Достаточно напомнить, что тольковкрови человека можно определить современными методами биохимических исследований около1000показателей метаболизма.
Биохимические показатели биологических сред организма человека широко используются при:
1.постановке диагноза заболевания, особенно дифференциального диагноза;
2.выборе метода лечения;
3.контроле за правильностью назначенного лечения;
4.результаты биохимических анализов служат одним из критериев излеченности патологического процесса;
5.скрининге (выявлении болезни на доклинической стадии);
6.мониторинге (контроле за течением заболевания и результатом лечения);
7.прогнозе (информации о возможном исходе заболевания).
Аминокислоты,
Общие структурные особенностиаминокислот, входящих в состав белков
Общая структурная особенность аминокислот - наличие амино- и карбоксильной групп, соединённых с одним и тем же ?-углеродным атомом. R - радикал аминокислот - в простейшем случае представлен атомом водорода (глицин), но может иметь и более сложное строение. В
водных растворах при нейтральном значении рН?- аминокислоты существуют в виде биполярных ионов. В отличие от 19 остальных ?-аминокислот, пролин - иминокислота, радикал которой связан как с ?-углеродным атомом, так и с аминогруппой, в результате чего молекула приобретает циклическую структуру.
19/20 аминокислот
19 из 20 аминокислот содержат в ?-положении асимметричный атом углерода, с которым связаны 4 разные замещающие группы. В результате эти аминокислоты в природе могут находиться в двух разных изомерных формах - L и D. Исключение составляет глицин, который не имеет асимметричного ?-углеродного атома, так как его радикал представлен только атомом водорода. В составе белков присутствуют только L-изомеры аминокислот.
Чистые L- или D-стереоизомеры могут за длительный срок самопроизвольно и неферментативно превращаться в эквимолярную смесь
L- и D-изомеров. Этот процесс называют рацемизацией. Рацемизация каждой L-аминокислоты при данной температуре идёт с определённой скоростью. Все 20 аминокислот в организме человека различаются по строению, размерам и физико-химическим свойствам радикалов, присоединённых к ?-углеродному атому.
Классификация аминокислотпо химическому строению радикалов
По химическому строению аминокислоты можно разделить на алифатические, ароматические и гетероциклические
В составе алифатических радикалов могут находиться функциональные группы, придающие им специфические свойства: карбоксильная (-СООН), амино (-NH2), тиольная (-SH), амидная (-CO-NH2), гидроксильная (-ОН) и гуанидиноваягруппы.*
Для записи аминокислотных остатков в молекулах пептидов и белков используют трёхбуквенные сокращения их тривиальных названий, а в некоторых случаях и однобуквенные символы
Классификация аминокислот по растворимости их радикалов в воде
Все 20 аминокислот в белках организма человека можно сгруппировать по способности их радикалов растворяться в воде. Радикалы можно выстроить в непрерывный ряд, начинающийся полностью гидрофобными и заканчивающийся сильно гидрофильными.
Растворимость радикалов аминокислот определяется полярностью функциональных групп, входящих в состав молекулы (полярные группы притягивают воду, неполярные её отталкивают).
Аминокислоты с неполярными радикалами
К неполярным (гидрофобным) относят радикалы, имеющие алифатические углеводородные цепи (радикалы аланина, валина, лейцина, изолейцина, пролина и метионина) и ароматические кольца (радикалы фенилаланина и триптофана). Радикалы таких аминокислот в воде стремятся друг к другу или к другим гидрофобным молекулам, в результате чего поверхность соприкосновения их с водой уменьшается.
Аминокислоты с полярными незаряженными радикалами
Радикалы этих аминокислот лучше, чем гидрофобные радикалы, растворяются в воде, так как в их состав входят полярные
функциональные группы, образующие водородные связи с водой. К ним относят серии, треонин и тирозин, имеющие гидроксильные группы, аспарагин и глутамин, содержащие амидные группы, и цистеин с его тиольной группой.
Аминокислоты с полярными отрицательно заряженными радикалами
К этой группе относят аспарагиновую и глутаминовую аминокислоты, имеющие в радикале дополнительную карбоксильную группу, при рН около 7,0 диссоциирующую с образованием СОО-и Н+. Следовательно, радикалы данных аминокислот - анионы. Ионизированные формы глутаминовой и аспарагиновой кислот называют соответственно глутаматом и аспартатом.
Аминокислоты с полярными положительно заряженными радикалами
Дополнительную положительно заряженную группу в радикале имеют лизин и аргинин. У лизина вторая аминогруппа, способная присоединять Н+, располагается в ?-положении алифатической цепи, а у аргинина положительный заряд приобретает, гуанидиновая группа, Кроме того, гистидин содержит слабо ионизированную имидазольную группу, поэтому при физиологических колебаниях значений рН (от 6,9 до 7,4) гистидин заряжен либо нейтрально, либо положительно. При увеличении количества протонов в среде имидазольная группа гистидина способна присоединять протон, приобретая положительный заряд, а при увеличении концентрации гидроксильных групп - отдавать протон, теряя положительный заряд радикала. Положительно заряженные радикалы - катионы .Наибольшей растворимостью в воде обладают полярные заряженные радикалы аминокислот.
Изменение суммарного зарядааминокислот в зависимости от рН среды
При нейтральных значениях рН все кислотные (способные отдавать Н+) и все основные (способные присоединять Н+) функциональные группы находятся в диссоциированном состоянии.
Поэтому в нейтральной среде аминокислоты, содержащие недиссоциирующий радикал, имеют суммарный нулевой заряд. Аминокислоты, содержащие кислотные функциональные группы, имеют суммарный отрицательный заряд, а аминокислоты, содержащие основные функциональные группы, - положительный заряд
Изменение рН в кислую сторону (т.е. повышение в среде концентрации Н+) приводит к подавлению диссоциации кислотных групп. В сильно кислой среде все аминокислоты приобретают положительный заряд.
Напротив, увеличение концентрации ОН-групп вызывает отщепление Н+от основных функциональных групп, что приводит к уменьшению положительного заряда. В сильно щелочной среде все аминокислоты имеют суммарный отрицательный заряд.
Модифицированные аминокислоты,присутствующие в белках
Непосредственно в синтезе белков организма человека принимают участие только 20 перечисленных аминокислот. Однако в некоторых белках имеются нестандартные модифицированные аминокислоты - производные одной из этих 20 аминокислот.
Модификации аминокислотных остатков осуществляются уже в составе белков, т.е. только после окончания их синтеза. Введение дополнительных функциональных групп в структуру аминокислот придаёт белкам свойства, необходимые для выполнения ими специфических функций.
Химические реакции, используемые дляобнаружения аминокислот
Для обнаружения и количественного определения аминокислот, находящихся в растворе, можно использовать нингидриновую реакцию.
Эта реакция основана на том, что бесцветный нингидрин, реагируя с аминокислотой, конденсируется в виде димера через атом азота, отщепляемый от ?-аминогруппы аминокислоты. В результате образуется пигмент красно-фиолетового цвета. Одновременно происходит декарбоксилирование аминокислоты, что приводит к образованию СО2и соответствующего альдегида. Нингидриновую реакцию широко используют при изучении первичной структуры белков Так как интенсивность окраски пропорциональна количеству аминокислот в растворе, её используют для измерения концентрации ?-аминокислот.
Специфические реакции на отдельные аминокислоты
Качественное и количественное определение отдельных аминокислот возможно благодаря наличию в их радикалах особенных функциональных групп.
Аргинин определяют с помощью качественной реакции на гуанидиновую группу (реакция Сакагучи), а цистеин выявляют реакцией Фоля, специфичной на SH-группу данной аминокислоты. Наличие ароматических аминокислот в растворе определяют ксантопротеиновой реакцией (реакция нитрования), а наличие гидроксильной группы в ароматическом кольце тирозина - с помощью реакции Миллона.
Б. Пептидная связь. Строение и биологические свойства пептидов
Биологическая роль пептидов
В организме человека вырабатывается множество пептидов, участвующих в регуляции различных биологических процессов и обладающих высокой физиологической активностью.
Функции пептидов зависят от их первичной структуры. Ангиотензин I по структуре очень похож на ангиотензин II (имеет только две дополнительные аминокислоты с С-конца), но при этом не обладает биологической активностью.
Изменение в аминокислотном составе пептидов часто приводит к потере одних и возникновению других биологических свойств.
Так как пептиды - мощные регуляторы биологических процессов, их можно использовать как лекарственные препараты. Основное препятствие для терапевтического использования - их быстрое разрушение в организме. Одним из важнейших результатов исследований является не только изучение структуры пептидов, но и получение синтетических аналогов природных пептидов с целенаправленными изменениями в их структуре и функциях.
группы по их основному физиологическому действию
Открытые и изученные в настоящее время пептиды можно разделить на
группы по их основному физиологическому действию:
пептиды, обладающие гормональной активностью (окситоцин, вазопрессин, рилизинг-гормоны гипоталамуса, меланоцитстимулирующий гормон, глюкагон и др.);
пептиды, регулирующие процессы пищеварения (гастрин, холецистокинин, вазоинтестиналшый пептид, желудочный ингибирующий пептид и др.);
пептиды, регулирующие тонус сосудов и АД (брадикинин, калидин, ангиотензин II);
пептиды, регулирующие аппетит (лептин, нейропептид Y, меланоцитстимулирующий гормон, (?-эндорфины);
пептиды, обладающие обезболивающим действием (энкефалины и эндорфины и другие опиоидные пептиды). Обезболивающий эффект этих пептидов в сотни раз превосходит
анальгезирующий эффект морфина;
пептиды, участвующие в регуляции высшей нервной деятельности, в биохимических процессах, связанных с механизмами сна, обучения, памяти, возникновения чувства страха и т.д.
Первичной структурой белков
Первичной структурой белков называется линейная полипептидная цепь из аминокислот, соединенных между собой пептидными связями. Первичная структура - простейший уровень структурной организации белковой молекулы. Высокую стабильность ей придают ковалентные пептидные связи между α-аминогруппой одной аминокислоты и α-карбоксильной группой другой аминокислоты
Если в образовании пептидной связи участвует иминогруппа пролина или гидроксипролина, то она имеет другой вид.
При образовании пептидных связей в клетках сначала активируется карбоксильная группа одной аминокислоты, а затем она соединяется с аминогруппой другой. Примерно так же проводят лабораторный синтез полипептидов.
Пептидная связь
Пептидная связь является повторяющимся фрагментом полипептидной цепи. Она имеет ряд особенностей, которые влияют не только на форму первичной структуры, но и на высшие уровни организации полипептидной цепи:
копланарность - все атомы, входящие в пептидную группу, находятся в одной плоскости;
способность существовать в двух резонансных формах (кето- или енольной форме);
транс-положение заместителей по отношению к С-N-связи;
способность к образованию водородных связей, причем каждая из пептидных групп может образовывать две водородные связи с другими группами, в том числе и пептидными.
Исключение составляют пептидные группы с участием аминогруппы пролина или гидроксипролина. Они способны образовывать только одну водородную связь . Это сказывается на формировании вторичной структуры белка. Полипептидная цепь на участке, где находится пролин или гидроксипролин, легко изгибается, так как не удерживается, как обычно, второй водородной связью.
Особенности первичной структуры белка.
В остове полипептидной цепи чередуются жесткие структуры (плоские пептидные группы) с относительно подвижными участками (—СНR), которые способны вращаться вокруг связей. Такие особенности строения полипептидной цепи влияют на
укладку ее в пространстве.
Характеристика пептидной связи
Пептидная связь имеет характеристику частично двойной связи, поэтому она короче, чем остальные связи пептидного остова, и вследствие этого мало подвижна. Электронное строение пептидной связи определяет плоскую жёсткую структуру пептидной группы. Плоскости пептидных групп расположены под углом друг к другу .
Связь между ?-углеродным атомом и ?-аминогруппой или ?-карбоксильной группой способна к свободным вращениям (хотя ограничена размером и характером радикалов), что позволяет полипептидной цепи принимать различные конфигурации.
Пептидные связи обычно расположены в транс-конфигурации, т.е. ?-углеродные атомы располагаются по разные стороны от пептидной связи. В результате боковые радикалы аминокислот
находятся на наиболее удалённом расстоянии друг от друга в пространстве.
Пептидные связи очень прочны и самопроизвольно не разрываются при нормальных условиях, существующих в клетках (нейтральная среда, температура тела). В лабораторных условиях гидролиз пептидных связей белков проводят в запаянной ампуле с концентрированной (6 моль/л) соляной кислотой, при температуре более 105 °С, причём полный гидролиз белка до свободных аминокислот проходит примерно за сутки.
Разрыв связи
В живых организмах пептидные связи в белках разрываются с помощью специальных протеолитических ферментов (от англ,protein -белок,lysis -разрушение), называемых также протеазами, или пептидгидролазами.
Для обнаружения в растворе белков и пептидов, а также для их количественного определения используют биуретовую реакцию
(положительный результат для веществ, содержащих в своём составе не менее двух пептидных связей).
Химическая природа
Химическая природа каждого белка уникальна и тесно связана с его биологической функцией. Способность белка выполнять присущую ему функцию определяется его первичной структурой. Даже небольшие изменения в последовательности аминокислот в белке могут привести к серьезному нарушению в его функционировании, возникновению тяжелого заболевания. Болезни, связанные с нарушениями первичной структуры белка, получили название молекулярных. К настоящему времени открыто несколько тысяч таких болезней. Одной из молекулярных болезней является серповидноклеточная анемия, причина которой кроется в нарушении первичной структуры гемоглобина. У людей с врожденной аномалией структуры гемоглобина в полипептидной цепочке, состоящей из 146 аминокислотных остатков, в
шестом положении находится валин, тогда как у здоровых людей на этом месте — глутаминовая кислота. Аномальный гемоглобин хуже транспортирует кислород, а эритроциты крови больных имеют серповидную форму. Заболевание проявляется в замедлении развития, общей слабости организма.
Вторичная структура
Вторичная структура- это пространственное расположение полипептидной цепочки в виде α-спирали или β-складчатости безотносительно к типам боковых радикалов и их конформации. Она стабилизирована водородными связями, которые замыкаются между пептидными, амидными (-N-H) и карбонидными (-C=O)группами, т.е. входят в пептидную единицу, и дисульфидными мостиками между
остатками цистеина
Полинг и Кори предложили модель вторичной структуры белка в виде левозакрученной α-спирали, в которой водородные связи замыкаются между каждой первой и четвертой аминокислотой, что позволяет сохранять нативную структуру белка, осуществление им простейших функций, защищать от разрушения. На один виток спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка, шаг спирали составляет 0,54 нм. В образовании водородных связей принимают участие все пептидные группы, что обеспечивает максимальную стабильность, снижает гидрофильность и увеличивает гидрофобность белковой молекулы. Альфа-спираль образуется самопроизвольно и является наиболее устойчивой конформацией, отвечающей минимуму свободной энергии .
Полинг и Кори предложили и другую упорядоченную структуру - складчатый β- слой. В отличие от конденсированной α-спирали β- слои почти полностью вытянуты и могут располагаться как параллельно, так и антипараллельно
В стабилизации данных структур также принимают участие дисульфидные мостики и водородные связи.
Супервторичная структура
Супервторичная структура- это более высокий уровень организации белковой молекулы, представленный ансамблем взаимодействующих между собой вторичных структур
Некоторый специфический порядок чередования вторичных структур наблюдается во многих разных по структуре и функциям белках и носит название супервторичной структуры.
структурные мотивы
Такиеупорядоченные структуры часто обозначают как структурные мотивы,которые имеют специфические названия: «а-спираль—поворот—а-спи-раль», «лейциновая застежка-молния», «цинковые пальцы», «структура Р-бочонка» и др.
По наличию а-спиралей и b-структур
b-структур глобулярные белки могут быть разделены на 4 категории:
1.В первую категорию включены белки, в которых имеются только а-спирали, например миоглобин и гемоглобин .
2. Во вторую категорию включены белки, в которых имеются а-спирали и b-структуры. ЛДГ.
3. В третью категорию включены белки, имеющие только вторичную b-структуру. Такие структуры обнаружены в иммуноглобулинах, в ферменте супероксиддисмутазе
4. В четвертую категорию включены белки, имеющие в своем составе лишь незначительное количество регулярных вторичных структур. К таким белкам можно отнести небольшие богатые цистином белки или металлопротеины.
общие виды супервторичных структур
В ДНК-связывающих белках имеются общие виды супервторичных структур:«спираль—поворот—спираль», «лейциновая застежка-молния», «цинковые пальцы».ДНК-связывающие белки
содержат центр связывания, комплементарный участку ДНК с определенной нуклеотидной последовательностью. Эти белки участвуют в регуляции действия генов.
«а-Спираль—поворот—а-спираль»
Двуспиральная структура ДНК
Двуспиральная структура ДНК имеет 2 бороздки: большую и малую.Большая бороздка хорошоприспособлена для связывания белков, имеющих небольшие спиральные участки.
В данный структурный мотив входят 2 ос-спирали: одна более короткая, другая более длинная, соединенные поворотом полипептидной цепи.
Более короткая а-спираль располагается поперек бороздки ДНК, а более длинная а-спираль находится в большой бороздке, образуя нековалентные специфические связи радикалов аминокислот с
нуклеотидами ДНК.
Цинковый палец
«Цинковый палец» — фрагмент белка, содержащий около 20 аминокислотных остатков.
Атом цинка связан с радикалами 4 аминокислот: 2 остатков цистеина и 2 — гистидина.
В некоторых случаях вместо остатков гистидина находятся остатки цистеина.
Этот участок белка образует а-спираль, которая может специфично связываться с регуляторными участками большой бороздки ДНК.
Специфичность связывания индивидуального регуляторного ДНК-связывающего белка зависит от последовательности аминокислотных остатков, расположенных в области «цинкового пальца».
Лейциновая застежка-молния
«Лейциновая застежка-молния»
Взаимодействующие белки имеют а-спиральный участок, содержащий по крайней мере 4 остатка лейцина.
Лейциновые остатки расположены через 6 аминокислот один от другого.
Так как каждый виток а-спирали содержит 3,6-аминокислотного остатка, радикалы лейцина находятся на поверхности каждого второго витка.
Лейциновые остатки а-спирали одного белка могут взаимодействовать с лейциновыми остатками другого белка (гидрофобные взаимодействия), соединяя их вместе .
Многие ДНК-связывающие белки взаимодействуют с ДНК в виде олигомерных структур, где субъединицы связываются друг с другом «лейциновыми застежками». Примером таких белков могут служить гистоны.
Гистоны
Гистоны— ядерные белки, в состав которых входит большое количество положительно заряженных аминокислот — аргинина и лизина (до 80%).
Молекулы гистонов объединяются в олигомерные комплексы,
содержащие 8 мономеров с помощью «лейциновых застежек», несмотря на сильный положительный заряд этих молекул.
Конформация петидных цепей в белках (третичная структура).
У большинства белков полипептидные цепи свернуты особым образом в компактную глобулу. Способ свертывания полипептидных цепей глобулярных белков называется третичной структурой. Третичная структура поддерживается уже обсуждавшимися выше связями трех типов — ионными, водородными и дисульфидными, а также гидрофобными взаимодействиями. В количественном отношении наиболее
важны именно гидрофобные взаимодействия; белок при этом свертывается таким образом, чтобы его гидрофобные боковые цепи были скрыты внутри молекулы, а гидрофильные, наоборот, выставлены наружу
Доменная структура и ее роль в функционировании белков.
ДОМЕННАЯ СТРУКТУРА И ЕЕ РОЛЬ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ БЕЛКОВ1. Длинные полипептидные цепи часто складываются в несколько компактных, относительно независимых областей. Они имеют самостоятельную третичную структуру, напоминающую таковую глобулярных белков, и называются доменами.Благодаря доменной структуре белков легче формируется их трехмерная структура.2. Центры связывания белка с лигандом часто располагаются между доменами (например, центр связывания трипсина с его лигандом - пищевым белком). Разные домены в белке могут перемещаться относительно друг друга при взаимодействии с лигандом (например, в молекуле гексокиназы).В некоторых белках
домены выполняют самостоятельные функции, связываясь с различными лигандами. Такие белки называются многофункциональными белками.
Шапероны
Правильное сворачивание (фолдинг) полипептидных цепей белков в клетках эукариот обеспечивается специфическими белками, называемыми шаперонами (chaperone). Шапероны необходимы для эффективного формирования третичной структуры полипептидных цепей других белков, но они не входят в состав конечной белковой структуры.
Новосинтезированные белки после выхода срибосом для правильного функционирования должны укладываться в стабильные трехмерные структуры и оставаться такими на протяжении всей функциональной жизни клетки. Поддержание контроля качества структуры белка и осуществляется шаперонами, катализирующими укладку полипептидов. Сборка полипротеинов и укладка
мультибелковых комплексов также осуществляется шаперонами. Шапероны связываются с гидрофобными участками неправильно уложенных белков, помогают им свернуться и достигнуть стабильной нативной структуры и, тем самым, предотвращают их включение в нерастворимые и нефункциональные агрегаты. В течение своей функциональной жизни белок может подвергаться различным стрессам и денатурации. Такие частично денатурированные белки могут стать, во-первых, мишенью протеаз, во-вторых, агрегировать и, в-третьих, укладываться в нативную структуру с помощью шаперонов. Баланс и эффективность, с которой происходят эти три процесса, определяются соотношением компонентов, участвующих в этих реакциях
Активный центр белков
Активный центр белков -определённый участок белковой молекулы, как правило, находящийся в её углублении (“кармане”), сформированный радикалами аминокислот, собранных на определённом пространственном участке при формировании третичной структуры и способный комплементарно связываться с лигандом. В линейной последовательности полипептидной цепи радикалы, формирующие активный центр, могут находиться на значительном расстоянии друг от друга.
Высокая специфичность связывания белка с лигандомобеспечивается комплементарностью структуры активного центра белка структуре лиганда
Под комплементарностью понимают пространственное и химическое соответствие
взаимодействующих молекул. Лиганд должен обладать способностью входить и пространственно совпадать с конформацией активного центра. Это совпадение может быть неполным, но благодаря конформационной лабильности белка активный центр способен к небольшим изменениям и “подгоняется” под лиганд. Кроме того, между функциональными группами лиганда и радикалами аминокислот, образующих активный центр, должны возникать связи, удерживающие лиганд в активном центре. Связи между лигандом и активным центром белка могут быть как нековалентными (ионными, водородными, гидрофобными), так и ковалентными.
Характеристика активного центра
Активный центр белка - относительно изолированный от окружающей белок среды участок, сформированный аминокислотными остатками. В этом участке каждый
остаток благодаря своему индивидуальному размеру и функциональным группам формирует “рельеф” активного центра.
Объединение таких аминокислот в единый функциональный комплекс изменяет реакционную способность их радикалов, подобно тому, как меняется звучание музыкального инструмента в ансамбле. Поэтому аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра, часто называют “ансамблем” аминокислот.
Уникальные свойства активного центра зависят не только от химических свойств формирующих его аминокислот, но и от их точной взаимной ориентации в пространстве. Поэтому даже незначительные нарушения общей конформации белка в результате точечных изменений его первичной структуры или условий окружающей среды могут привести к изменению химических и функциональных свойств радикалов, формирующих активный центр, нарушать связывание белка с
лигандом и его функцию. При денатурации активный центр белков разрушается, и происходит утрата их биологической активности.
Часто активный центр формируется таким образом, что доступ воды к функциональным группам его радикалов ограничен, т.е. создаются условия для связывания лиганда с радикалами аминокислот.
В некоторых случаях лиганд присоединяется только к одному из атомов, обладающему определённой реакционной способностью, например присоединение О2к железу миоглобина или гемоглобина. Однако свойства данного атома избирательно взаимодействовать с О2определяются свойствами радикалов, окружающих атом железа в составе тема. Гем содержится и в других белках, таких как цитохромы. Однако функция атома железа в цитохромах иная, он служит посредником для передачи электронов от одного вещества другому, при этом железо становится то двух-, то трёхвалентным.
Основное свойство белков, лежащее в основе их функций, - избирательность присоединения к определённым участкам белковой молекулы специфических лигандов.
Многообразие лигандов
Лигандами могут быть неорганические (часто ионы металлов) и органические вещества, низкомолекулярные и высокомолекулярные вещества;
существуют лиганды, которые изменяют свою химическую структуру при присоединении к активному центру белка (изменения субстрата в активном центре фермента);
существуют лиганды, присоединяющиеся к белку только в момент функционирования (например, О2, транспортируемый гемоглобином), и лиганды, постоянно связанные с белком, выполняющие вспомогательную роль при функционировании белков (например, железо, входящее в состав гемоглобина).
В тех случаях, когда аминокислотные остатки, формирующие активный центр, не могут обеспечить функционирование данного белка, к определённым участкам активного центра могут присоединяться небелковые молекулы. Так, в активном центре многих ферментов присутствует ион металла (кофактор) или органическая небелковая молекула (кофермент). Небелковую часть, прочно связанную с активным центром белка и необходимую для его функционирования, называют”простатическая группа”.Миоглобин, гемоглобин и цитохромы имеют в активном центре простетическую группу - гем, содержащий железо .
Соединение протомеров в олигомерном белке - пример взаимодействия высокомолекулярных лигандов. Каждый протомер, соединённый с другими протомерами, служит для них лигандом, так же как они для него.
Иногда присоединение какого-либо лиганда изменяет конформацию белка, в результате чего формируется центр связывания с другими лигандами. Например, белок кальмодулин после связывания с четырьмя ионами Са2+в специфических участках приобретает способность взаимодействовать с некоторыми ферментами, меняя их активность.
Четвертичная структура белков.
Под четвертичной структурой подразумевают способ укладки в пространстве отдельных полипептидных цепей, обладающих одинаковой (или разной) первичной, вторичной или третичной структурой,
и формирование единого в структурном и функциональном отношениях макромолекулярного образования. Многие функциональные белки состоят из нескольких полипептидных цепей, соединенных не ковалентными связями, а неко-валентными (аналогичными тем, которые обеспечивают стабильность третичной структуры). Каждая отдельно взятая полипептидная цепь, получившая название протомера, мономера или субъединицы, чаще всего не обладает биологической активностью. Эту способность белок приобретает при определенном способе пространственного объединения входящих в его состав протомеров, т.е. возникает новое качество, не свойственное мономерному белку. Образовавшуюся молекулу принято называть олигомером (или мультимером). Олигомерные белки чаще построены из четного числа протомеров (от 2 до 4, реже от 6 до 8) с одинаковыми или разными молекулярными массами -
от нескольких тысяч до сотен тысяч. В частности, молекула гемоглобина состоит из двух одинаковых α- и двух β-полипептидных цепей, т.е. представляет собой тетрамер.
Кооперативные изменения конформации протомеров.
Изменение конформации , а следовательно и функциональных свойств всех протомеров олигомерного белка при присоединение лиганда только к одному из них носит название-кооперативные изменения конформации протомеров.
Аллостерическая регуляция
. Фермент изменяет активность с помощью нековалентно связанного с ним эффектора. Связывание происходит в участке, пространственно удаленном от активного (каталитического) центра. Это связывание вызывает конформационные изменения в молекуле белка, приводящие к изменению определенной геометрии каталитического центра. Активность
может увеличиться - это активация фермента, или уменьшиться - это ингибирование «Сообщение» о присоединении аллостерического активатора передается посредством конформационных изменений каталитической субъединице, которая становится комплементарной субстрату, и фермент «включается». При удалении активатора фермент вновь переходит в неактивную форму и «выключается». Аллостерическая регуляция является основным способом регуляции метаболических путей.
Физико-химические свойства белков.
Индивидуальные белки различаются по своим физико-химическим свойствам: форме молекул, молекулярной массе, суммарному заряду молекулы, соотношению полярных и неполярных групп на поверхности нативной молекулы белка,
растворимости белков, а также степени устойчивости к воздействию денатурирующих агентов.
Различия белков по форме молекул
Как уже говорилось выше, по форме молекул белки делят на глобулярные и фибриллярные. Глобулярные белки имеют более компактную структуру, их гидрофобные радикалы в большинстве своём спрятаны в гидрофобное ядро, и они значительно лучше растворимы в жидкостях организма, чем фибриллярные белки (исключение составляют мембранные белки).
Различия белков по молекулярной массе
Белки - высокомолекулярные соединения, но могут сильно отличаться по молекулярной массе, которая колеблется от 6000 до 1 000 000 Д и выше. Молекулярная масса белка зависит от количества аминокислотных остатков в полипептидной цепи, а для
олигомерных белков - и от количества входящих в него протомеров (или субъединиц).
Суммарный заряд белков
Белки имеют в своём составе радикалы лизина, аргинина, гистидина, глутаминовой и аспарагиновой кислот, содержащие функциональные группы, способные к ионизации (ионогенные группы). Кроме того, на N- и С-концах полипептидных цепей имеются α-амино- и α-карбоксильная группы, также способные к ионизации. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от соотношения ионизированных анионных радикалов Глу и Асп и катионных радикалов Лиз, Apr и Гис.
Степень ионизации функциональных групп этих радикалов зависит от рН среды. При рН раствора около 7 все ионогенные группы белка находятся в ионизированном состоянии. В кислой среде увеличение концентрации протонов (Н+) приводит к
подавлению диссоциации карбоксильных групп и уменьшению отрицательного заряда белков: -СОО-+ Н+→ -СООН. В щелочной среде связывание избытка ОН” с протонами, образующимися при диссоциации NH3+с образованием воды, приводит к уменьшению положительного заряда белков:
—NH3++ОН-→ -NH2+ H2O.
Значение рН, при котором белок приобретает суммарный нулевой заряд, называют”изоэлектрическая точка”и обозначают как pI. В изоэлектрической точке количество положительно и отрицательно заряженных групп белка одинаково, т.е. белок находится в изоэлектрическом состоянии.
Так как большинство белков в клетке имеет в своём составе больше анионогенных групп (-СОО-), то изоэлектрическая точка этих белков лежит в слабокислой среде. Изоэлектрическая точка белков, в составе которых преобладают катионогенные группы, находится в
щелочной среде. Наиболее яркий пример таких внутриклеточных белков, содержащих много аргинина и лизина, - гистоны, входящие в состав хроматина.
Белки, имеющие суммарный положительный или отрицательный заряд, лучше растворимы, чем белки, находящиеся в изоэлектрической точке. Суммарный заряд увеличивает количество диполей воды, способных связываться с белковой молекулой, и препятствует контакту одноимённо заряженных молекул, в результате растворимость белков увеличивается. Заряженные белки могут двигаться в электрическом поле: анионные белки, имеющие отрицательный заряд, будут двигаться к положительно заряженному аноду (+), а катионные белки - к отрицательно заряженному катоду (- ). Белки, находящиеся в изоэлектрическом состоянии, не перемещаются в электрическом поле.
Соотношение полярных и неполярныхгрупп на поверхности нативных молекулбелков
На поверхности большинства внутриклеточных белков преобладают полярные радикалы, однако соотношение полярных и неполярных групп отлично для разных индивидуальных белков. Так, протомеры олигомерных белков в области контактов друг с другом часто содержат гидрофобные радикалы. Поверхности белков, функционирующих в составе мембран или прикрепляющиеся к ним в процессе функционирования, также обогащены гидрофобными радикалами. Такие белки лучше растворимы в липидах, чем в воде.
Растворимость белков
Растворимость белков в воде зависит от всех перечисленных выше свойств белков: формы, молекулярной массы, величины заряда, соотношения полярных и неполярных функциональных групп на поверхности белка. Кроме этого, растворимость белка определяется составом растворителя, т.е. наличием в растворе других растворённых
веществ. Например, некоторые белки легче растворяются в слабом солевом растворе, чем в дистиллированной воде. С другой стороны, увеличение концентрации нейтральных солей может способствовать выпадению определённых белков в осадок. Денатурирующие агенты, присутствующие в растворе, также снижают растворимость белков.
10.Методы выделения индивидуальных белков:
Получение индивидуальных белков из биологического материала (тканей, органов, клеточных культур) требует проведения последовательных операций, включающих:
дробление биологического материала и разрушение клеточных мембран;
фракционирование органелл,
содержащих те или иные белки;
экстракцию белков (перевод их в растворённое состояние);
разделение смеси белков на индивидуальные белки.
Методы разрушения тканейи экстракции белков
Для разрушения биологического материала используют методы: гомогенизации ткани, метод попеременного замораживания и оттаивания, а также обработку клеток ультразвуком.
Гомогенизация биологического материала
Ткань, находящуюся в буферном растворе с определённым значением рН и концентрацией солей, помещают в стеклянный сосуд (гомогенизатор) с пестиком. Вращающийся пестик измельчает и растирает ткань о притёртые стенки сосуда.
Метод замораживания и оттаивания ткани
В результате попеременного замораживания и оттаивания образующиеся кристаллы льда
разрушают оболочки клеток.
После разрушения ткани нерастворимые части осаждают центрифугированием. Последующее центрифугирование гомогената с разной скоростью позволяет получить отдельные фракции, содержащие клеточные ядра, митохондрии и другие органеллы, а также надосадочную жидкость, в которой находятся растворимые белки цитозоля клетки. Искомый белок будет содержаться в одной из этих фракций.
Экстракция белков, связанных с мембранами, и разрушение олигомерных белков на протомеры
Если искомый белок прочно связан с какими-либо структурами клетки, его необходимо перевести в раствор. Так, для разрушения гидрофобных взаимодействий между белками и липидами мембран в раствор добавляют детергенты; чаще всего используют тритон Х-100 или додецилсульфат натрия.
При действии детергентов обычно
разрушаются и гидрофобные взаимодействия между протомерами в олигомерных белках.
Удаление из раствора небелковых веществ
Нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые вещества можно удалить из раствора, используя их особенные физико-химические свойства. Так, липиды легко удаляются из раствора добавлением органических растворителей, например ацетона. Однако воздействие должно быть кратковременным, так как ацетон вызывает денатурацию некоторых белков. Нуклеиновые кислоты осаждают добавлением в раствор стрептомицина.
Методы очистки белков
Методы очистки белков
Наиболее трудоёмкий этап получения индивидуальных белков - их очистка от других белков, находящихся в растворе, полученном из данной ткани. Часто изучаемый белок присутствует в небольших количествах, составляющих доли
процента от всех белков раствора.
Так как белки обладают конформационной лабильностью, при работе с белками следует избегать денатурирующих воздействий, поэтому выделение и очистка белков происходят при низких температурах.
На первых стадиях очистки белков целесообразно использовать методы, учитывающие какую-либо характерную особенность данного белка, например термостабильность или устойчивость в кислых растворах. Первыми методами очистки необходимо удалить из раствора основную массу балластных белков, которые значительно отличаются от выделяемого белка физико-химическими свойствами. Впоследствии применяют всё более тонкие методы очистки белка.
Очистка белков избирательной денатурацией
Очистка белков избирательной денатурацией
Большинство белков денатурирует и выпадает в осадок уже при кратковременном нагревании раствора до 50-70 °С или
подкислении раствора до рН 5. Если выделяемый белок выдерживает эти условия, то с помощью избирательной денатурации можно удалить большую часть посторонних белков, отфильтровав выпавшие в осадок белки, или осадить их центрифугированием.
Высаливание
Высаливание
Метод очистки белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.
Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония - (NH4)2SO4. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.
Гель-фильтрация, или
метод
молекулярных сит
Для разделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства.
Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с “порами”, через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно
формировать гранулы с разной величиной “пор”.
Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы.
Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул .
Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными
размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии.
Ультрацентрифугирование
Ультрацентрифугирование
Метод разделения также основан на различии в молекулярных массах белков. Скорость седиментации веществ в процессе вращения в ультрацентрифуге, где центробежное ускорение достигает 100 000-500 000 g, пропорционально их молекулярной массе. На поверхность буферного раствора, помещённого в кювету, наносят тонкий слой смеси белков. Кювету помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора в течение 10-12 ч более крупные молекулы (с большей молекулярной массой) оседают в буферном растворе с большей скоростью. В результате в кювете происходит расслоение смеси белков на отдельные фракции с разной молекулярной массой . После расслоения белковых фракций дно кюветы прокаливают иглой и по каплям собирают содержимое
небольшими порциями в пробирки.
Электрофорез
Электрофорез белков
Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).
Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др.
Различают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу), содержащую анионные группы.
Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого
белка. Так, для выделения отрицательнозаряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок.
Аффинная хроматография,
Или хроматография по сродству
Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К ли-ганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом . Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом.
Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.
Очистка белков от низкомолекулярныхпримесей
Очистка белков от низкомолекулярныхпримесей
Для удаления низкомолекулярных соединений, в частности сульфата аммония после высаливания, применяют диализ. Метод основан на том, что через полупроницаемую мембрану,пропускающую низкомолекулярные вещества, не проходят белки, имеющие более высокую молекулярную массу. В стакан большой ёмкости (около 1 л) с буферным раствором помещают полупроницаемый мешочек, заполненный раствором белка с солью.
Скорость выхода соли из мешочка в буферный раствор пропорциональна градиенту его концентраций по обе стороны от мембраны. По мере выхода соли из мешочка буферный раствор в стакане меняют.
Для очистки белков от низкомолекулярных примесей используют также метод гель-фильтрации .
Для определения частоты (гомогенности) выделенного белка применяют методы с высокой разрешающей способностью, например электрофорез в полиакриламидном геле, высокоэффективная хроматография высокого давления. От чистоты лекарственного белкового препарата зависят его биологическая эффективность и аллергенность (т.е. способность вызывать аллергические реакции). Чем качественнее очищен препарат, тем меньше вероятность осложнений при его применении.
Конформационная лабильность белков
Гидрофобные взаимодействия, а также ионные и водородные связи
относят к числу слабых, так как их энергия лишь ненамного превышает энергию теплового движения атомов при комнатной температуре (т.е. уже при данной температуре возможен разрыв таких связей).
Поддержание характерной для белка конформации возможно благодаря возникновению множества слабых связей между различными участками полипептидной цепи.
Однако белки состоят из огромного числа атомов, находящихся в постоянном (броуновском) движении, что приводит к небольшим перемещениям отдельных участков полипептидной цепи, которые обычно не нарушают общую структуру белка и его функции. Следовательно, белки обладают конформационной лабильностью - склонностью к небольшим изменениям конформации за счёт разрыва одних и образования других слабых связей. Конформация белка может меняться при изменении химических и физических свойств среды, а также при взаимодействии
белка с другими молекулами. При этом происходит изменение пространственной структуры не только участка, контактирующего с другой молекулой, но и конформации белка в целом. Конформационные изменения играют огромную роль в функционировании белков в живой клетке.
Денатурация белков
Разрыв большого количества слабых связей в молекуле белка приводит к разрушению её нативной конформации. Так как разрыв связей под действием различных факторов носит случайный характер, то молекулы одного индивидуального белка приобретают в растворе форму случайно сформировавшихся беспорядочных клубков, отличающихся друг от друга трёхмерной структурой. Потеря нативной конформации сопровождается утратой специфической функции белков. Этот процесс носит название денатурации белков. При денатурации белков не
происходит разрыва пептидных связей, т.е. первичная структура белка не нарушается.
В денатурированном белке гидрофобные радикалы, которые в нативной структуре молекулы спрятаны внутри гидрофобного ядра, оказываются на поверхности. При достаточно высокой концентрации белка и отсутствии сильного отталкивающего заряда молекулы могут объединяться друг с другом гидрофобными взаимодействиями, при этом растворимость белка снижается и происходит образование осадка.
Компактная, плотная пространственная структура нативного белка при денатурации резко увеличивается в размерах и становится легко доступной для расщепления пептидных связей протеолитическими ферментами. Термическая обработка мясной пищи перед употреблением не только улучшает её вкусовые качества, но и облегчает её ферментативное
переваривание в пищеварительной системе. Кроме того, денатурирующим действием на пищевые белки обладает и кислая среда желудка, вызывающая денатурацию тех белков, которые не подвергались предварительной температурной обработке, а также оказывает денатурирующее действие на белки микроорганизмов, попавших в желудок с пищей.
Факторы, вызывающие денатурацию белков
Денатурацию белков вызывают факторы, способствующие разрыву гидрофобных, водородных и ионных связей, стабилизирующих кон-формацию белков:
высокая температура (более 50 °С), увеличивающая тепловое движение атомов в молекуле и приводящая к разрыву слабых связей;
интенсивное встряхивание раствора, приводящее к соприкосновению белковых молекул с воздушной средой на поверхности раздела фаз и изменению
конформации этих молекул;
органические вещества (например, этиловый спирт, фенол и его производные) способны взаимодействовать с функциональными группами белков, что приводит к их конформационным изменениям. Для денатурации белков в биохимических исследованиях часто используют мочевину или гуанидинхлорид, которые образуют водородные связи с амино- и карбонильными группами пептидного остова и некоторыми функциональными группами радикалов аминокислот. Происходит разрыв связей, участвующих в формировании вторичной и третичной структуры нативных белков, и образование новых связей с химическими реагентами;
кислоты и щелочи, изменяя рН среды, вызывают перераспределение связей в молекуле белка;
соли тяжёлых металлов (такие как медь, ртуть, серебро, свинец и др.) образуют прочные связи с важными
функциональными группами белков (чаще всего с -SH), изменяя их конформацию и активность;
детергенты - вещества, содержащие гидрофобный углеводородный радикал и гидрофильную функциональную группу (такие вещества называют амфифильными). Гидрофобные радикалы белков взаимодействуют с гидрофобными частями детергентов, что изменяет конформацию белков. Денатурированный под действием детергентов белок обычно остаётся в растворённом виде, так как гидрофильные части денатурирующего вещества удерживают его в растворе. К наиболее известным детергентам относят различные мыла.
Роль шаперонов в защите белков клеток от денатурирующих стрессовых воздействий
Шапероны, участвующие в защите клеточных белков от денатурирующих воздействий, как уже говорилось выше, относят к
белкам теплового шока (БТШ) и в литературе часто обозначают как HSP (от англ.heat shock protein).
При действии различных стрессовых факторов (высокая температура, гипоксия, инфекция, УФО, изменение рН среды, изменение молярности среды, действие токсичных химических веществ, тяжёлых металлов и т.д.) в клетках усиливается синтез БТШ. Имея высокое сродство к гидрофобным участкам частично денатурированных белков, они могут препятствовать их полной денатурации и восстанавливать нативную конформацию белков.
Принципы классификации белков.
Существует несколько классификаций белков. В основе их лежат разные принципы: по степени сложности (простые и сложные); по форме молекул (глобулярные и
фибриллярные белки); по растворимости в отдельных растворителях (водорастворимые, растворимые в слабых солевых растворах — альбумины, спирторастворимые — проламины, растворимые в щелочах — глютелины), по выполняемым ими функциям, например запасные белки, скелетные и т. д.
Остановимся несколько подробнее на классификации по степени сложности. По этому принципу белки делят на протеины (простые белки), состоящие только из остатков аминокислот, и протеиды (сложные белки), состоящие из белковой (апобелок) и небелковой частей (простетическая группа).
Протеины — запасные, скелетные, отдельные ферментные белки. По растворимости в отдельных растворителях выделим только главные:
альбумины — белки с относительно небольшой молекулярной массой, хорошо растворимые в воде и в
слабых солевых растворах
глобулины — растворяются в водных растворах солей.
проламины — растворяются в 60—80 %-ном растворе этилового, спирта.
глютелины — растворяются только в растворах щелочей.
Протеиды — из этой группы сложных белков отметим только следующие:
нуклеопротеиды — кроме белка включают нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты относятся к важнейшим биополимерам, которым принадлежит огромная роль в наследственности;
липопротеиды — содержат кроме белка липиды. Содержатся в протоплазме и мембранах. Принимают участие в формировании клейковинных белков;
фосфопротеиды — кроме белка присутствует фосфорная кислота. Им принадлежит важная роль в питании молодого организма. Пример: казеин — белок молока.
Иммуноглобулины,
В ответ на введение антигена иммунная система вырабатывает антитела — белки, способные специфически соединяться с антигеном, вызвавшим их образование, и таким образом участвовать в иммунологических реакциях. Относятся антитела к γ-глобулинам, т. е. наименее подвижной в электрическом поле фракции белков сыворотки крови. В организме γ-глобулины вырабатываются особыми клетками — плазмоцитами. γ-глобулины, несущие функции антител, получили название иммуноглобулинов и обозначаются символом Ig. Следовательно, антитела — этоиммуноглобулины, вырабатываемые в ответ на введение антигена и способные специфически взаимодействовать с этим же антигеном.
Функции.Первичная функция состоит во взаимодействии их
активных центров с комплементарными им детерминантами антигенов. Вторичная функция состоит в их способности:
•связывать антиген с целью его нейтрализации и элиминации из организма, т. е. принимать участие в формировании защиты от антигена;
•участвовать в распознавании «чужого» антигена;
•обеспечивать кооперацию иммунокомпетентных клеток (макрофагов, Т- и В-лимфоцитов);
•участвовать в различных формах иммунного ответа (фагоцитоз, киллерная функция, ГНТ, ГЗТ, иммунологическая толерантность, иммунологическая память).
Структура антител
.Белки иммуноглобулинов по химическому составу относятся к гликопротеидам, так как состоят из протеина и Сахаров; построены из 18 аминокислот. Имеют видовые отличия, связанные главным образом с набором аминокислот. Их молекулы
имеют цилиндрическую форму, они видны в электронном микроскопе. До 80%иммуноглобулинов имеют константу седиментации 7S; устойчивы к слабым кислотам, щелочам, нагреванию до 60 °С. Выделить иммуноглобулины из сыворотки крови можно физическими и химическими методами (электрофорез, изоэлектрическое осаждение спиртом и кислотами, высаливание, аффинная хроматография и др.). Эти методы используют в производстве при приготовлении иммунобиологических препаратов.
Природа иммуноглобулинов.
Иммуноглобулиныпо структуре, антигенным и иммунобиологическим свойствам разделяются на пять классов: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD. Иммуноглобулины М, G, А имеют подклассы. Например, IgG имеет четыре подкласса (IgG,, IgG2, IgG3, IgG4). Все классы и подклассы различаются по аминокислотной последовательности.
Молекулы иммуноглобулинов всех
пяти классов состоят из полипептидных цепей: двух одинаковых тяжелых цепей Н и двух одинаковых легких цепей — L, соединенных между собой дисульфидными мостиками. Соответственно каждому классу иммуноглобулинов, т.е. М, G, A, E, D, различают пять типов тяжелых цепей: μ (мю), γ (гамма), α (альфа), ε (эпсилон) и Δ (дельта), различающихся по антигенности. Легкие цепи всех пяти классов являются общими и бывают двух типов: κ (каппа) иλ(ламбда); L-цепи иммуноглобулинов различных классов могут вступать в соединение (рекомбинироваться) как с гомологичными, так и с гетерологичными Н-цепями. Однако в одной и той же молекуле могут быть только идентичные L-цепи (κ илиλ).Как в Н-, так и в L-цепях имеется вариабельная — V область, в которой последовательность аминокислот непостоянна, и константная — С область с постоянным набором аминокислот. В
легких и тяжелых цепях различают NH2- и СООН-концевые группы.
При обработке γ -глобулина меркаптоэтанолом разрушаются дисульфидные связи и молекула иммуноглобулина распадается на отдельные цепи полипептидов. При воздействии протеолитическим ферментом папаином иммуноглобулин расщепляется на три фрагмента: два не кристаллизующихся, содержащих детерминантные группы к антигену и названных Fab-фрагментами I и II и один кристаллизующий Fc-фрагмент. FabI- и FabII-фрагменты сходны по свойствам и аминокислотному составу и отличаются от Fc-фрагмента; Fab-и Fc-фрагменты являются компактными образованиями, соединенными между собой гибкими участками Н-цепи, благодаря чему молекулы иммуноглобулина имеют гибкую структуру.
Как Н-цепи, так и L-цепи имеют отдельные, линейно связанные
компактные участки, названные доменами; в Н-цепи их по 4, а в L-цепи — по 2.
Активные центры, или детерминанты, которые формируются в V-областях, занимают примерно 2 % поверхности молекулы иммуноглобулина. В каждой молекуле имеются две детерминанты, относящиеся к гипервариабельным участкам Н-и L-цепей, т. е. каждая молекула иммуноглобулина может связать две молекулы антигена. Поэтому антитела являются двухвалентными.
Типовой структурой молекулы иммуноглобулина является IgG. Остальные классы иммуноглобулинов отличаются от IgG дополнительными элементами организации их молекулы.
В ответ на введение любого антигена могут вырабатываться антитела всех пяти классов. Обычно вначале вырабатывается IgM, затем IgG, остальные — несколько позже.
Ферменты
Ферменты, или энзимы, представляют собой высокоспециализированный класс веществ белковой природы, используемый живыми организмами для осуществления с высокой скоростью многих тысяч взаимосвязанных химических реакций, включая синтез, распад и взаимопревращение огромного множества разнообразных химических соединений.
Ферменты обеспечивают осуществление таких важнейших процессов жизнедеятельности, как экспрессия (реализация) наследственной информации, биоэнергетика, синтез и распад биомолекул (обмен веществ).
От неорганических катализаторов ферменты отличаются рядом характерных особенностей. Прежде
всего ферменты чрезвычайно эффективны и проявляют в миллионы и миллиарды раз более высокую каталитическую активность в условиях умеренной температуры (температура тела), нормального давления и в области близких к нейтральным значениям рН среды. Ферменты отличаются высокой специфичностью действия в отношении как химической природы субстрата, так и типа реакции, т.е. каждый фермент катализирует в основном только определенную химическую реакцию. Для каждого фермента характерны специфическая последовательность расположения аминокислотных остатков и пространственная конформация. Существенной особенностью ферментов является также то, что их активность в клетках строго контролируется как на генетическом уровне,
Каждый фермент имеет 2 названия. Первое - короткое, так называемое рабочее, удобное для повседневного использования. Второе (более полное) - систематическое, применяемое для однозначной идентификации фермента.
Рабочее название ферментов
В названии большинства ферментов содержится суффикс “аза”, присоединённый к названию субстрата реакции, например уреаза, сахараза, липаза, нуклеаза или к названию химического превращения определённого субстрата, например лактатдегидрогеназа, аденилатциклаза, фосфоглюкомутаза, пируваткарбоксилаза. Согласно российской классификации ферментов (КФ), названия ферментов пишутся слитно. Однако в употреблении сохранился ряд тривиальных, исторически закреплённых названий ферментов, которые не дают представления ни о субстрате, ни о типе химического превращения, например трипсин, пепсин, ренин, тромбин.
Классы ферментов
Международный союз биохимии и молекулярной биологии в 1961 г.
разработал систематическую номенклатуру, согласно которой все ферменты разбиты на 6 основных классов в зависимости от типа катализируемой химической реакции. Каждый класс состоит из многочисленных подклассов и подподклассов с учётом преобразуемой химической группы субстрата, донора и акцептора преобразуемых группировок, наличия дополнительных молекул и т.д. Каждый из 6 классов имеет свой порядковый номер, строго закреплённый за ним.
Оксидоредукпшзы
Катализируют различные окислительно-восстановительные реакции с участием 2 субстратов (перенос е-или атомов водорода с одного субстрата на другой).
Систематическое наименование ферментов составляют по формуле “донор: акцептороксидоредуктаза”, рабочее - субстрат-подкласс оксидоредуктаз.
Дегидрогеназы.В этот подкласс
входят ферменты, катализирующие реакции дегидрирования (отщепления водорода). В качестве акцепторов электронов используются коферменты NAD+, NADP+, FAD, FMN . Все ферменты этой группы обладают высокой субстратной специфичностью.
Оксидазы.Акцептором электрона служит молекулярный кислород.
Оксигеназы (гидроксилазы) -атом кислорода из молекулы кислорода присоединяется к субстрату.
Трансферты
2.Трансферты
Катализируют перенос функциональных групп от одного соединения к другому. Подразделяют в зависимости от переносимой группы.
Название этих ферментов составляют по формуле “донор: акцептор экспортируемая группа трансфераза”. К классу трансфераз относят аминотрансферазы, ацилтрансферазы, метилтрансферазы,
гликозилтрансферазы, киназы (фосфо-трансферазы).
Гидролазы
3.Гидролазы
Катализируют реакции гидролиза (расщепления ковалентной связи с присоединением молекулы воды по месту разрыва). Подразделяют в зависимости от расщепляемой связи.
Наименование ферментов составляют по формуле “субстрат-гидролаза” или прямым присоединением к названию субстрата суффикса “аза”, например протеаза, липаза, фосфолипаза, рибонуклеаза.
Для отдельных классов гидролаз применимы специальные термины, характеризующие гидролиз определённой химической связи: эстеразы, фосфатазы и др.
Лиазы
Лиазы
К лиазам относят ферменты, отщепляющие от субстратов негидролитическим путём определённую группу (при этом могут отщепляться СО2, Н2О, NH2,SН2и др.) или присоединяющие чаще всего молекулу воды по двойной связи.
Наименование ферментов составляют по формуле “субстрат-отщепляемая или присоединяемая группировка”.
Изомеразы
Изомеразы
Катализируют различные внутримолекулярные превращения. Подразделяют в зависимости от типа реакции изомеризации.
Как общее название ферментов этого класса применяют термин “изомеразы”.
Изомеразы могут катализировать внутримолекулярные окислительно-восстановительные реакции, осуществляя взаимопревращения альдоз и кетоз, кетонных и енольных групп, перемещения двойных связей внутри молекулы .
Когда изомеризация состоит во внутримолекулярном переносе группы, фермент называют “мутазой”.
Лигазы
Лигазы (синтетазы)
Катализируют реакции присоединения друг к другу двух
молекул с образованием ковалентной связи. Этот процесс сопряжён с разрывом фосфоэфирной связи в молекуле АТФ (или других нуклеозидтрифосфатов) или с разрывом макроэргических связей других соединений. В первом случае (при использовании энергии гидролиза АТФ) такие ферменты называют лигазами, или синтетазами .
В случае, когда источником энергии служит любое другое макроэргическое соединение (не АТФ), ферменты называют синтазами
Систематическое название
В соответствии с классификацией каждый фермент получил систематическое название, однозначно характеризующее катализируемую им химическую реакцию. Например, D-глицеральдегид-3-фосфат: NAD-оксидоредуктаза (рабочее название - глицеральдегидфосфат дегидрогеназа). Из названия фермента следует, что субстратом этого фермента служит D-глицеральдегид-3-фосфат, тип катализируемой реакции - окислительно-восстановительная в присутствии кофермента NAD+.
В 1972 г. комиссией по номенклатуре биохимических соединений Международного союза теоретической и прикладной химии были предложены “Правила номенклатуры ферментов”, имеющие кодовое четырёхзначное цифровое обозначение, где первая цифра обозначает класс фермента, вторая цифра (подкласс) уточняет преобразуемую группировку, третья (подподкласс) - уточняет дополнительных участников реакции (например, донора и акцептора) и четвёртая - порядковый номер фермента в данной подгруппе. Так, фермент малатдегидрогеназа имеет систематическое название L-малат: NAD-оксидоредуктаза и кодовый шифр 1.1.1.38. Шифр означает, что этот фермент относят к первому классу ферментов - оксидоредуктаз, окисляемая группа - гидроксильная
группировка (1) в присутствии кофермента NAD+(1) и порядковый номер фермента в этой подгруппе - 38. Кодовую номенклатуру ферментов в основном используют в научной литературе.
Строение ферментов.
По строению ферменты делятся на простые (однокомпонентные) и сложные (двухкомпонентные). Простой фермент состоит только из белковой части; в состав сложного фермента входит белковая и небелковая составляющие. Иначе сложный фермент называют холоферментом. Белковую часть в его составе называютапоферментом, а небелковую -коферментом. Химическая природа коферментов была выяснена в 30-е гг. Оказалось,
что роль некоторых коферментов играют витамины или вещества, построенные с участием витаминов В1, В2, В5, В6, В12, Н, Q и др. Особенностью сложных ферментов является то, что отдельно апофермент и кофермент не обладают каталитической активностью.
В составе как простого, так и сложного фермента, выделяют субстратный, аллостерический и каталитический центры.
Каталитический центр
Каталитический центрпростого фермента представляет собой уникальное сочетание нескольких аминокислотных остатков, расположенных на разных участках полипептидной цепи. Образование каталитического центра происходит одновременно с формированием третичной структуры белковой молекулы фермента. Чаще всего в состав каталитического центра простого фермента входят остатки серина, цистеина, тирозина, гистидина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот.
Субстратный центр
Субстратный центрпростого фермента - это участок белковой молекулы фермента, который отвечает за связывание субстрата. Субстратный центр образно называют “якорной площадкой”, где субстрат прикрепляется к ферменту за счет различных взаимодействий между определенными боковыми радикалами аминокислотных остатков и соответствующими группами молекулы субстрата. Субстрат с ферментом связывается посредством ионных взаимодействий, водородных связей; иногда субстрат и фермент связываются ковалентно. Гидрофобные взаимодействия также играют определенную роль при связывании субстрата с ферментом. В простых ферментах субстратный центр может совпадать с каталитическим; тогда говорят обактивном центрефермента.
Аллостерический центр
Аллостерический центрпредставляет собой участок молекулы фермента, в результате присоединения к которому какого-то низкомолекулярного вещества
изменяется третичная структура белковой молекулы фермента, что влечет за собой изменение его активности. Аллостерический центр является регуляторным центром фермента.
Кофермент
В сложных ферментах роль каталитического центра выполняет кофермент, который связывается с апоферментом в определенном участке -кофермент связывающем домене. Понятия субстратного и аллостерического центров для сложного фермента и для простого аналогичны.
МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ
МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ
Механизм действия ферментов может быть рассмотрен с двух позиций: с точки зрения изменения энергетики химических реакций и с точки зрения событий в активном центре.
А. Энергетические изменения при химических реакциях
Любые химические реакции протекают, подчиняясь двум
основным законам термодинамики: закону сохранения энергии и закону энтропии. Согласно этим законам, общая энергия химической системы и её окружения остаётся постоянной, при этом химическая система стремится к снижению упорядоченности (увеличению энтропии). Для понимания энергетики химической реакции недостаточно знать энергетический баланс входящих и выходящих из реакции реагентов, необходимо учитывать изменения энергии в процессе данной химической реакции и роль ферментов в динамике этого процесса. Рассмотрим реакцию разложения угольной кислоты:
Н2СО3→ Н20 + С02.
Угольная кислота слабая; реакция её разложения пойдёт цри обычных условиях, если молекулы угольной кислоты имеют энергию, превышающую определённый уровень, называемый энергией активации Еа.
Энергией активации называют
дополнительное количество кинетической энергии, необходимое молекулам вещества, чтобы они вступили в реакцию.
При достижении этого энергетического барьера в молекуле происходят изменения, вызывающие перераспределение химических связей и образование новых соединений. Говорят, что молекулы, обладающие Еа, находятся в переходном состоянии. Разницу энергий между исходным реагентом Н2СО3и конечными соединениями Н2О и СО2называют изменением свободной энергии реакции DG. Молекулы Н2О и СО2- более стабильные вещества, чем Н2СО3, т.е. обладают меньшей энергией и при обычных условиях практически не реагируют. Выделившаяся энергия в результате этой реакции рассеивается в виде тепла в окружающую среду.
Чем больше молекул обладает энергией, превышающей уровень Еа, тем выше скорость химической реакции. Повысить скорость
химической реакции можно нагреванием. При этом увеличивается энергия реагирующих молекул. Однако для живых организмов высокие температуры губительны, поэтому в клетке для ускорения химических реакций используются ферменты. Ферменты обеспечивают высокую скорость реакций при оптимальных условиях, существующих в клетке, путём понижения уровня Еа. Таким образом, ферменты снижают высоту энергетического барьера, в результате возрастает количество реакционно-способных молекул, следовательно, увеличивается скорость реакции.
В механизме ферментативного катализа решающее значение имеет образование нестойких промежуточных соединений - фермент-субстратный комплекс ES, подвергающийся превращению в нестабильный переходный комплекс ЕР, который почти мгновенно распадается на свободный фермент и продукт реакции.
Таким образом, биологические катализаторы (ферменты) не изменяют свободную энергию
субстратов и продуктов и поэтому не меняют равновесие реакции.
Фермент, выполняя функцию катализатора химической реакции, подчиняется общим законам катализа и обладает всеми свойствами, характерными для небиологических катализаторов, однако имеет и отличительные свойства, связанные с особенностями строения ферментов.
Сходство ферментов с небиологическими катализаторами заключается в том, что:
ферменты катализируют энергетически возможные реакции;
энергия химической системы остаётся постоянной;
в ходе катализа направление реакции не изменяется;
ферменты не расходуются в процессе реакции.
Отличия ферментов от небиологических катализаторов заключаются в том, что: скорость ферментативных реакций выше, чем реакций, катализируемых небелковыми катализаторами;
ферменты обладают высокой специфичностью;
ферментативная реакция проходит в клетке, т.е. при температуре 37 °С, постоянном атмосферном давлении и физиологическом значении рН;
скорость ферментативной реакции может регулироваться.
Этапы ферментативного катализа
Этапы ферментативного катализа
1. Формирование фермент-субстратногокомплекса
Тот факт, что ферменты обладают высокой специфичностью, позволил в 1890 г. выдвинуть гипотезу, согласно которой активный центр фермента комплементарен субстрату, т.е. соответствует ему как “ключ замку”. После взаимодействия субстрата (“ключ”) с активным центром (“замок”) происходят химические превращения субстрата в продукт. Активный центр при этом рассматривался как стабильная,
жёстко детерминированная структура.
В 1959 г. был предложен другой вариант гипотезы “ключ-замок”, объясняющий события в активном центре фермента. По этой гипотезе активный центр является гибкой структурой по отношению к субстрату. Субстрат, взаимодействуя с активным центром фермента, вызывает изменение его конформации, приводя к формированию фермент-субстратного комплекса, благоприятного для химических модификаций субстрата. При этом молекула субстрата также изменяет свою конформацию, что обеспечивает более высокую эффективность ферментативной реакции. Эта “гипотеза индуцированного соответствия” впоследствии получила экспериментальное подтверждение.
3. Роль активного центра в ферментативномкатализе
В результате исследований было показано, что молекула фермента, как правило, во много раз больше
молекулы субстрата, подвергающегося химическому превращению этим ферментом. В контакт с субстратом вступает лишь небольшая часть молекулы фермента, обычно от 5 до 10 аминокислотных остатков, формирующих активный центр фермента. Роль остальных аминокислотных остатков состоит в обеспечении правильной конформации молекулы фермента для оптимального протекания химической реакции.
Активный центр на всех этапах ферментативного катализа нельзя рассматривать как пассивный участок для связывания субстрата. Это комплексная молекулярная “машина”, использующая разнообразные химические механизмы, способствующие превращению субстрата в продукт.
В активном центре фермента субстраты располагаются таким образом, чтобы участвующие в реакции функциональные группы субстратов находились в
непосредственной близости друг к другу. Это свойство активного центра называют эффектом сближения и ориентации реагентов. Такое упорядоченное расположение субстратов вызывает уменьшение энтропии и, как следствие, снижение энергии активации (Еа), что определяет каталитическую эффективность ферментов.
Активный центр фермента также способствует дестабилизации межатомных связей в молекуле субстрата, что облегчает протекание химической реакции и образование продуктов. Это свойство активного центра называют эффектом деформации субстрата .
Молекулярные механизмы ферментативного катализа
Молекулярные механизмы ферментативного катализа
Механизмы ферментативного катализа определяются ролью функциональных групп активного центра фермента в химической реакции превращения субстрата в продукт. Выделяют 2 основных механизма ферментативного катализа:
кислотно-основной катализ и ковалентный катализ.
1. Кислотно-основной катализ
Концепция кислотно-основного катализа объясняет ферментативную активность участием в химической реакции кислотных групп (доноры протонов) и/или основных групп (акцепторы протонов). Кислотно-основной катализ - часто встречающееся явление. Аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра, имеют функциональные группы, проявляющие свойства как кислот, так и оснований.
2. Ковалентный катализ
Ковалентный катализ основан на атаке нуклеофильных (отрицательно заряженных) или электрофильных (положительно заряженных) групп активного центра фермента молекулами субстрата с формированием ковалентной связи между субстратом и коферментом или функциональной группой аминокислотного остатка (как
правило, одной) активного центра фермента.
Кинетика ферментативных реакций
Кинетика ферментативных реакций - раздел энзимологии, изучающий зависимость скорости химических реакций, катализируемых ферментами, от химической природы реагирующих веществ, а также от факторов окружающей среды.
Для измерения каталитической активности ферментов используют такие показатели, как скорость реакции или активность фермента. Скорость ферментативной реакции определяется изменением количества молекул субстрата или продукта за единицу времени. Скорость ферментативной реакции - мера каталитической активности фермента, её обозначают как активность
фермента.
Математически скорость ферментативной реакции выражается в изменении концентрации субстрата (уменьшение) или продукта (увеличение) за единицу времени:
V= D[S]/t = D[P]/t.
На начальном этапе [0 - t0] скорость реакции прямо пропорциональна времени и имеет линейную зависимость. Графически изменение скорости ферментативной реакции определяется тангенсом угла наклона касательной к кривой профиля реакции. Чем больше угол наклона, тем больше изменение скорости реакции .
С течением времени изменение скорости ферментативной реакции в экспериментальных условиях уменьшается, об этом свидетельствует уменьшение угла наклона касательной в момент времени t. Снижение скорости ферментативной реакции может происходить за счёт ряда факторов: уменьшения концентрации субстрата,
увеличения концентрации продукта, который может оказывать ингибирующее действие, могут происходить изменения рН раствора, инактивация фермента и т.д.
На этапе [t1- tx] скорость реакции изменяется нелинейно в зависимости от времени. Поэтому для определения скорости ферментативной реакции чаще всего исследуют изменение скорости на начальном этапе [t0- t1], где наблюдают линейное изменение концентрации продукта (или субстрата).
Скорость ферментативной реакции зависит от ряда факторов, таких как количество и активность ферментов, концентрация субстрата, температура среды, рН раствора, присутствие регуляторных молекул (активаторов и ингибиторов). Рассмотрим влияние этих факторов на скорость ферментативной реакции.
Зависимость скорости ферментативной реакции от количества ферментов
При проведении ферментативной
реакции в условиях избытка субстрата скорость реакции будет зависеть от концентрации фермента. Графическая зависимость такой реакции имеет вид прямой линии. Однако количество фермента часто невозможно определить в абсолютных величинах, поэтому на практике пользуются условными величинами, характеризующими активность фермента: одна международная единица активности (ME) соответствует такому количеству фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин при оптимальных условиях проведения ферментативной реакции. Оптимальные условия индивидуальны для каждого фермента и зависят от температуры среды, рН раствора, при отсутствии активаторов и ингибиторов.
В медицинской и фармацевтической практике для оценки активности ферментов часто используют международные единицы активности - ME. Для оценки количества молекул фермента среди других белков данной ткани определяют удельную активность (уд. ак.) фермента, численно равную количеству единиц активности фермента (пМЕ) в образце ткани, делённому на массу (мг) белка в этой ткани:
По удельной активности судят об очистке фермента: чем меньше посторонних белков, тем выше удельная активность.
Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры среды
Повышение температуры до определённых пределов оказывает влияние на скорость ферментативной реакции, подобно влиянию температуры на любую химическую реакцию. С повышением температуры ускоряется движение молекул, что приводит к повышению вероятности взаимодействия реагирующих веществ. Кроме того, температура может повышать энергию реагирующих молекул, что также приводит к ускорению реакции.
Однако скорость химической реакции, катализируемая ферментами, имеет свой температурный оптимум, превышение которого сопровождается понижением ферментативной активности, возникающим из-за термической денатурации белковой молекулы .
Для большинства ферментов человека оптимальна температура 37-38 °С. Однако в природе существуют и термостабильные ферменты. Например, Taq-полимераза, выделенная из микроорганизмов, живущих в горячих источниках, не инактивируется при повышении температуры до 95 °С. Этот фермент используют в научно-практической медицине для молекулярной диагностики заболеваний с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды
Активность ферментов зависит от рН раствора, в котором протекает
ферментативная реакция. Для каждого фермента существует значение рН, при котором наблюдается его максимальная активность. Отклонение от оптимального значения рН приводит к понижению ферментативной активности.
Влияние рН на активность ферментов связано с ионизацией функциональных групп аминокислотных остатков данного белка, обеспечивающих оптимальную конформацию активного центра фермента. При изменении рН от оптимальных значений происходит изменение ионизации функциональных групп молекулы белка. Например, при закислении среды происходит протонирование свободных аминогрупп (NH3+), а при защелачивании происходит отщепление протона от карбоксильных групп (СОО-). Это приводит к изменению конформации молекулы фермента и конформации активного центра; следовательно, нарушается присоединение субстрата,
кофакторов и коферментов к активному центру. Кроме того, рН среды может влиять на степень ионизации или пространственную организацию субстрата, что также влияет на сродство субстрата к активному центру. При значительном отклонении от оптимального значения рН может происходить денатурация белковой молекулы с полной потерей ферментативной активности.
Оптимум значения рН у разных ферментов различный . Ферменты, работающие в кислых условиях среды (например, пепсин в желудке или лизосомальные ферменты), эволюционно приобретают конформацию, обеспечивающую работу фермента при кислых значениях рН. Однако большая часть ферментов организма человека имеет оптимум рН, близкий к нейтральному, совпадающий с физиологическим значением рН .
Зависимость скорости ферментативной реакции от количества субстрата
Если концентрацию ферментов оставить постоянной, изменяя только количество субстрата, то график скорости ферментативной реакции описывают гиперболой .
При увеличении количества субстрата начальная скорость возрастает. Когда фермент становится полностью насыщенным субстратом, т.е. происходит максимально возможное при данной концентрации фермента формирование фермент-субстратного комплекса, наблюдают наибольшую скорость образования продукта. Дальнейшее повышение концентрации субстрата не приводит к увеличению образования продукта, т.е. скорость реакции не возрастает. Данное состояние соответствует максимальной скорости реакции Vmax.
Таким образом, концентрация фермента - лимитирующий фактор в образовании продукта. Это наблюдение легло в основу ферментативной кинетики, разработанной учёными Л.
Михаэлисом и М. Ментен в 1913 г.
Ферментативный процесс можно выразить следующим уравнением:
*
где k1- константа скорости образования фермент-субстратного комплекса; k-1- константа скорости обратной реакции, распада фермент-субстратного комплекса; k2- константа скорости образования продукта реакции.
Следующее соотношение констант скоростей (k-1+ k2)/k1называют константой Михаэлиса и обозначают Кm.
Скорость реакции пропорциональна концентрации фермент-субстратного комплекса ES, a скорость образования ES зависит от концентрации субстрата и концентрации свободного фермента. На концентрацию ES влияет скорость формирования и распада ES.
Наибольшая скорость реакции наблюдается в том случае, когда все
молекулы фермента находятся в комплексе с субстратом, т.е. в фермент-субстратном комплексе ES, т.е. [Е] = [ES].
Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата выражается следующим уравнением
V =
Vmax[S]
Km+ [S]
Это уравнение получило название уравнения Михаэлиса-Ментен.
В случае, когда скорость реакции равна половине максимальной, Km= [S] (рис. 2-19). Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой достигается половина максимальной скорости.
Уравнение Михаэлиса-Ментен - основное уравнение ферментативной кинетики, описывающее зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.
Если концентрация субстрата значительно больше Km(S»_space; Km), to увеличение концентрации субстрата на величину Кmпрактически не влияет на сумму (Km+ S) и её можно считать равной концентрации субстрата. Следовательно, скорость реакции становится равной максимальной скорости: V = Vmax. В этих условиях реакция имеет нулевой порядок, т.е. не зависит от концентрации субстрата. Можно сделать вывод, что Vmax- величина постоянная для данной концентрации фермента, не зависящая от концентрации субстрата.
Если концентрация субстрата значительно меньше Km(S «_space;Km), то сумма (Km+ S) примерно равна Кm, следовательно, V = Vmax[S]/Km, т.е. в данном случае скорость реакции прямо пропорциональна
Кофакторы ферментов: ионы металлов их роль в ферментативном катализе.
Большинство ферментов для проявления ферментативной активности нуждается в низкомолекулярных органических соединениях небелковой природы (коферментах) и/или в ионах
металлов (кофакторах).
Термин “кофермент” был введён в начале XX века и обозначал часть некоторых ферментов, которая легко отделялась от белковой молекулы фермента и удалялась через полупроницаемую мембрану при диализе. Несколько позже было выяснено, что большинство ферментов состоит из термолабильной белковой части и термостабильного небелкового фактора - кофермента. Белковая часть получила название “апофермент”, который в отсутствие кофермента не обладает каталитической активностью. Кофермент с белковой молекулой (апоферментом) формируют молекулу холофермента, обладающую каталитической активностью.
Кофакторы
Кофакторы
Более 25% всех ферментов для проявления полной каталитической активности нуждается в ионах металлов. Рассмотрим роль кофакторов в ферментативном
катализе.
1. Роль металлов в присоединении субстратав активном центре фермента
Ионы металла выполняют функцию стабилизаторов молекулы субстрата, активного центра фермента и конформации белковой молекулы фермента, а именно третичной и четвертичной структур.
Ионы металлов - стабилизаторы молекулы субстрата
Для некоторых ферментов субстратом служит комплекс превращаемого вещества с ионом металла. Например, для большинства киназ в качестве одного из субстратов выступает не молекула АТФ, а комплекс Mg2+-ATФ. В этом случае ион Mg2+не взаимодействует непосредственно с ферментом, а участвует в стабилизации молекулы АТФ и нейтрализации отрицательного заряда субстрата, что облегчает его присоединение к активному центру фермента
Схематично роль кофактора при
взаимодействии фермента и субстрата можно представить как комплекс E-S-Me, где Е - фермент, S - субстрат, Me - ион металла.
Ионы металла - стабилизаторы активного центра фермента
В некоторых случаях ионы металла служат “мостиком” между ферментом и субстратом. Они выполняют функцию стабилизаторов активного центра, облегчая присоединение к нему субстрата и протекание химической реакции. В ряде случаев ион металла может способствовать присоединению кофермента. Перечисленные выше функции выполняют такие металлы, как Mg2+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Мо2+. В отсутствие металла эти ферменты активностью не обладают. Такие ферменты получили название “металлоэнзимы”. Схематично данный процесс взаимодействия фермента, субстрата и металла можно представить следующим образом:
E-Me-S
2. Роль металлов в
стабилизации третичнойи четвертичной структуры фермента
Ионы металлов обеспечивают сохранение вторичной, третичной, четвертичной структуры молекулы фермента. Такие ферменты в отсутствие ионов металлов способны к химическому катализу, однако они нестабильны. Их активность снижается и даже полностью исчезает при небольших изменениях рН, температуры и других незначительных изменениях внешнего окружения. Таким образом, ионы металлов выполняют функцию стабилизаторов оптимальной конформации белковой молекулы.
3. Роль металлов в ферментативномкатализе
Не менее важную роль отводят ионам металлов в осуществлении ферментативного катализа.
Участие в электрофильном катализе
Наиболее часто эту функцию выполняют ионы металлов с
переменной валентностью, имеющие свободную d-орбиталь и выступающие в качестве электрофилов. В ходе электрофильного катализа ионы металлов часто участвуют в стабилизации промежуточных соединений.
Участие в окислительно-восстановительных реакциях
Ионы металлов с переменной валентностью могут также участвовать в переносе электронов. Например, в цитохромах (гемсодержащих белках) ион железа способен присоединять и отдавать один электрон:
Благодаря этому свойству цитохромы участвуют в окислительно-восстановительных реакциях.
4. Роль металлов в регуляции активностиферментов
Иногда ионы металлов выступают в роли регуляторных молекул. Например, ионы Са2+служат активаторами фермента
протеинкиназы С, катализирующего реакции фосфорилирования белков . Ионы Са2+также изменяют активность ряда кальций-кальмодулинзависимых ферментов .
Коферменты
Коферменты
Как уже было сказано, для проявления каталитической активности большинству ферментов необходимо наличие кофермента. Исключение составляют гидролитические ферменты (например, протеазы, липазы, рибонуклеаза), выполняющие свою функцию в отсутствие кофермента.
Кофермент, локализуясь в каталитическом участке активного центра, принимает непосредственное участие в химической реакции, выступая в качестве акцептора и донора химических группировок, атомов, электронов. Кофермент может быть связан с белковой частью молекулы ковалентными и нековалентными связями. В первом случае он называется простетической группой (например, FAD, FMN, биотин, липоевая кислота). Вместе с тем известны примеры, когда кофермент присоединяется к ферменту нековалентными связями настолько прочно, что не диссоциирует от белковой молекулы, например тиаминдифосфат.
Во втором случае кофермент взаимодействует с ферментом только на время химической реакции и может рассматриваться в качестве второго субстрата. Примеры - NAD+, NADP+.
Апофермент обеспечивает специфичность действия и отвечает за выбор типа химического превращения субстрата. Один и тот же кофермент, взаимодействуя с различными апоферментами, может участвовать в разных химических превращениях субстрата. Например, пиридоксальфосфат в зависимости от того, с каким апоферментом взаимодействует, участвует в реакциях трансаминирования или декарбоксилирования аминокислот.
Химическая природа коферментов,
их функции в ферментативных реакциях чрезвычайно разнообразны. Традиционно к коферментам относят производные витаминов, хотя помимо них есть значительный класс небелковых соединений, принимающих участие в проявлении каталитической функции ферментов.
К коферментам относят следующие соединения:
производные витаминов;
гемы, входящие в состав цитохромов, каталазы, пероксидазы, гуанилатциклазы, NO-синтазы и являющиеся простетической группой ферментов;
нуклеотиды - доноры и акцепторы остатка фосфорной кислоты;
убихинон, или кофермент Q, участвующий в переносе электронов и протонов в ЦПЭ;
фосфоаденозилфосфосульфат, участвующий в переносе сульфата;
S-аденозилметионин (SAM) - донор метильной группы;
глутатион, участвующий в окислительно-восстановительных реакциях.
Мультисубстратные реакции
Большинство ферментов катализирует реакции, в которых участвует более чем один субстрат. В случае если кофермент не является простетической группой, его также можно рассматривать как ещё один субстрат. Следовательно, участников ферментативной реакции может быть несколько: непосредственно фермент, несколько субстратов и кофермент.
В этих случаях механизм ферментативной реакции, как правило, может идти по одному из двух путей: по механизму “пинг-понг” (механизму двойного замещения) или последовательному. Рассмотрим оба механизма.
1. Механизм “пинг-понг”
Схематично механизм “пинг-понг” может быть представлен следующим образом:
* Субстрат А, взаимодействуя с ферментом (Е), превращается в продукт (Р1). Фермент остаётся в результате этого преобразования не в нативной форме, а в изменённой (Е’) в результате модификации кофермента. Далее к активному центру Е’ присоединяется субстрат В, подвергающийся преобразованию в продукт (Р2) с высвобождением нативной формы фермента (Е).
2. Последовательный механизм
В случае последовательного механизма для протекания ферментной реакции требуется одновременно взаимодействие двух субстратов. В этом случае возможно присоединение субстратов двумя различными путями:
Механизм упорядоченного взаимодействия субстрата с активным центром фермента:
*
Первым в активный центр фермента присоединяется субстрат А, облегчая присоединение
субстрата В. После химической модификации также наблюдают определённый порядок высвобождения продуктов реакции.
Механизм случайного взаимодействия субстрата с активным центром фермента:
*
Приоритетности за взаимодействие субстратов А и В в активном центре фермента нет (каждый субстрат имеет свой центр связывания в активном центре). Также нет строгой закономерности высвобождения продуктов реакции.
Примером последовательного упорядоченного механизма может быть реакция дегидрирования с участием коферментов NAD+, NADP+.
Оба кофермента функционируют как посредники переноса двух электронов и одного протона от донора к акцептору, другого протона - в среду .
Донор и акцептор не обязательно участвуют в одном метаболическом
пути. Другими словами, восстановленная форма этих нуклеотидов действует как общий пул электронов, образованный в результате окислительных реакций, и может быть использована в различных восстановительных реакциях. Такие реакции называют сопряжёнными .
Ингибирование ферментов
Под термином “ингибирование ферментативной активности” понимают снижение каталитической активности в присутствии определённых веществ - ингибиторов. К ингибиторам следует относить вещества, вызывающие снижение активности фермента. Следует отметить, что все денатурирующие агенты также вызывают уменьшение скорости любой ферментативной
реакции, вследствие неспецифической денатурации белковой молекулы, поэтому денатурирующие агенты к ингибиторам не относят.
Ингибиторы вызывают большой интерес для выяснения механизмов ферментативного катализа, помогают установить роль отдельных ферментов в метаболических путях организма. В основе действия многих лекарственных препаратов и ядов лежит ингибирование активности ферментов, поэтому знание механизмов этого процесса крайне важно для молекулярной фармакологии и токсикологии.
Ингибиторы способны взаимодействовать с ферментами с разной степенью прочности. На основании этого различают обратимое и необратимое ингибирование. По механизму действия ингибиторы подразделяют на конкурентные и неконкурентные.
Обратимое ингибирование
Обратимые ингибиторы связываются с ферментом слабыми
нековалентными связями и при определённых условиях легко отделяются от фермента. Обратимые ингибиторы бывают конкурентными и неконкурентными.
1. Конкурентное ингибирование
К конкурентному ингибированию относят обратимое снижение скорости ферментативной реакции, вызванное ингибитором, связывающимся с активным центром фермента и препятствующим образованию фермент-субстратного комплекса. Такой тип ингибирования наблюдают, когда ингибитор - структурный аналог субстрата, в результате возникает конкуренция молекул субстрата и ингибитора за место в активном центре фермента. В этом случае с ферментом взаимодействует либо субстрат, либо ингибитор, образуя комплексы фермент-субстрат (ES) или фермент-ингибитор (EI). При формировании комплекса фермента и ингибитора (EI) продукт реакции не образуется
Для конкурентного типа
ингибирования справедливы следующие уравнения:
Е + S ⇔ ES → E + P,
E + I ⇔ EI.
Кинетические зависимости
Конкурентные ингибиторы уменьшают скорость химической реакции. Конкурентный ингибитор повышает Кmдля данного субстрата (уменьшает сродство субстрата к ферменту). Это означает, что в присутствии конкурентного ингибитора необходима большая концентрация субстрата для достижения 1/2 Vmax.
Увеличение соотношения концентрации субстрата и ингибитора снижает степень ингибирования. При значительно более высоких концентрациях субстрата ингибирование полностью
В качестве лекарственных препаратов используют следующие антиметаболиты: сульфаниламидные препараты (аналоги парааминобензойной кислоты), применяемые для лечения
инфекционных заболеваний , аналоги нуклеотидов для лечения онкологических заболеваний .
2. Неконкурентное ингибирование
Неконкурентным называют такое ингибирование ферментативной реакции, при котором ингибитор взаимодействует с ферментом в участке, отличном от активного центра. Неконкурентные ингибиторы не являются структурными аналогами субстрата.
Неконкурентный ингибитор может связываться либо с ферментом, либо с фермент-субстратным комплексом, образуя неактивный комплекс. Присоединение неконкурентного ингибитора вызывает изменение конформации молекулы фермента таким образом, что нарушается взаимодействие субстрата с активным центром фермента, что приводит к снижению скорости ферментативной реакции.
Кинетические зависимости
Этот тип ингибирования
характеризуется снижением Vmaxферментативной реакции и уменьшением сродства субстрата к ферменту, т.е. увеличением Кm.
Необратимое ингибирование
Необратимое ингибирование наблюдают в случае образования ковалентных стабильных связей между молекулой ингибитора и фермента. Чаще всего модификации подвергается активный центр фермента, В результате фермент не может выполнять каталитическую функцию.
К необратимым ингибиторам относят ионы тяжёлых металлов, например ртути (Hg2+), серебра (Ag+) и мышьяка (As3+), которые в малых концентрациях блокируют сульфгидрильные группы активного центра. Субстрат при этом не может подвергаться химическому превращению . При наличии реактиваторов ферментативная функция восстанавливается. В больших концентрациях ионы тяжёлых металлов вызывают
денатурацию белковой молекулы фермента, т.е. приводят к полной инактивации фермента.
1. Специфические и неспецифическиеингибиторы
Использование необратимых ингибиторов представляет большой интерес для выяснения механизма действия ферментов. С этой целью применяют вещества, блокирующие определённые группы активного центра ферментов. Такие ингибиторы называют специфическими. Ряд соединений легко вступает в реакции с определенными химическими группами. Если эти группы участвуют в катализе, то происходит полная инактивация фермента .
2. Необратимые ингибиторы ферментов каклекарственные препараты
Пример лекарственного препарата, действие которого основано на необратимом ингибировании ферментов, - широко используемый препарат аспирин. Противовоспалительный
нестероидный препарат аспирин обеспечивает фармакологическое действие за счёт ингибирования фермента циклооксигеназы, катализирующего реакцию образования простагландинов из арахидоновой кислоты. В результате химической реакции ацетильный остаток аспирина присоединяется к свободной концевой NH2-группе одной из субъединиц циклооксигеназы .
Это вызывает снижение образования продуктов реакции простагландинов , которые обладают широким спектром биологических функций, в том числе являются медиаторами воспаления.
Аллостерическая регуляция активности ферментов.
Наиболее тонким и широко распространенным способом регуляции активности ферментов являетсяаллостерическая регуляция. В этом случае регуляторный фактор связывается не с каталитическим центром фермента, а с другим его участком (регуляторным центром), что приводит к изменению активности фермента. Ферменты, регулируемые таким образом, называютсяаллостерическими ,они часто занимают ключевую позицию в метаболизме. Вещество, связывающееся с регуляторным центром называетсяэффектором, эффектор может бытьингибитором, а может бытьактиватором. Обычно эффекторами бывают либо конечные продукты биосинтетических путей (ингибирование по принципу обратной связи), либо вещества, концентрация которых отражает
состояние клеточного метаболизма (АТФ, АМФ, НАД+ и др.). Как правило, аллостерические ферменты катализируют одну из реакций, с которой начинается процесс образования какого-то метаболита. Обычно эта стадия лимитирует скорость всего процесса в целом. В катаболических процессах, сопровождающихся синтезом АТФ из АДФ, в роли аллостерического ингибитора одной из ранних стадий катаболизма часто выступает сам конечный продукт – АТФ. Аллостерическим ингибитором одной из ранних стадий анаболизма нередко служит конечный продукт биосинтеза, например какая-нибудь аминокислота.
Активность некоторых аллостерических ферментов стимулируется специфическими активаторами. Аллостерический фермент, регулирующий одну из катаболических последовательностей реакций, может, например, подчиняться стимулирующему влиянию положительных эффекторов
– АДР или АМР и ингибирующему действию отрицательного эффектора – АТР. Известны также случаи, когда аллостерический фермент какого-нибудь метаболического пути специфическим образом реагирует на промежуточные или конечные продукты других метаболических путей. Благодаря этому оказывается возможной координация скорости действия различных ферментных систем.
Регуляция каталитической активности ферментов ковалентной модификацией путем фосфорилирования и дефосфорилирования.
В биологических системах часто встречается механизм регуляции активности ферментов с помощью ковалентной модификации аминокислотных остатков. Быстрый и широко распространённый способ химической модификации ферментов - фосфорилирование/дефосфорилирование. Модификации подвергаются ОН-группы фермента.
Фосфорилирование осуществляется ферментами протеинкиназами, а дефосфорилирование - фосфопротеинфосфатазами. Присоединение остатка фосфорной кислоты приводит к изменению конформации активного центра и его каталитической активности. При этом результат может быть двояким: одни ферменты при фосфорилировании активируются, другие, напротив, становятся менее активными .
Изменение активности фермента, вызванное фосфорилированием, обратимо. Отщепление остатка фосфорной кислоты осуществляется ферментами фосфопротеинфосфатазами. Активность протеинкиназ и фосфопротеинфосфатаз регулируется гормонами, что позволяет быстро изменять активность ключевых ферментов метаболических путей в зависимости от условий внешней среды. Антагонистичные по функции гормоны
противоположным образом влияют на фосфорилирование/дефосфорилирование ферментов, вызывая противоположные эффекты изменения метаболизма клетки.
Ассоциация и диссоциация протомеров на примере протеинкиназы А и ограниченный протеолиз при активации протеолитических ферментов как способы регуляции каталитической активности ферментов.
В качестве примера регуляции каталитической активности ферментов ассоциацией или диссоциацией протомеров можно привести регуляцию активности фермента протеинкиназы А. Протеинкиназа А (цАМФ-зависимая) состоит из 4 субъединиц 2 типов: 2 регуля-торных (R) и 2 каталитических (С). Такой тетрамер не обладает каталитической активностью. Регуляторные субъединицы имеют участки связывания для циклического 3’,5’-АМФ (цАМФ), по 2 на каждую
субъединицу. Присоединение 4 молекул цАМФ к 2 регуляторным субъединицам приводит к изменению конформации регуляторных протомеров и к диссоциации тетрамерного комплекса, при этом высвобождаются 2 активные каталитические субъединицы . Такой механизм регуляции обратим. Отщепление молекул цАМФ от регуляторных
субъединиц приведёт к ассоциации регуляторных и каталитических субъединиц протеинкиназы А с образованием неактивного комплекса.
Некоторые ферменты, функционирующие вне клеток (в ЖКТ или в плазме крови), синтезируются в виде неактивных предшественников и активируются только в результате гидролиза одной или нескольких определённых пептидных связей, что приводит к отщеплению части белковой молекулы предшественника. В результате в оставшейся части белковой молекулы происходит
конформационная перестройка и формируется активный центр фермента.
Частичный протеолиз - пример регуляции, когда активность фермента изменяется необратимо. Такие ферменты функционируют, как правило, в течение короткого времени, определяемого временем жизни белковой молекулы. Частичный протеолиз лежит в основе активации протеолитических ферментов, белков свёртывающей системы крови и фибринолиза, белков системы комплемента, а также пептидных гормонов.
Изоферменты, их происхождение, биологическое значение, привести примеры. Определение ферментов и изоферментного спектра плазмы крови с целью диагностики болезней.
Изоферменты. Часть ферментов состоят не из одной белковой цепочки, а из нескольких субъединиц. Изоферменты – это семейство
ферментов, которые катализируют одну и ту же реакцию, но отличаются по строению и физико-химическим свойствам.
Например: лактатдегидрогеназа (ЛДГ) состоит их 4 субъединиц 2хтипов: субъединица Н, выделенная из сер дечной мышцы (heart – сердце), субъединица М, выделенная из скелетных мышц (musculus – мышца). Эти субъединицы кодируются разными генами. В разных органах имеются различные формы ЛДГ с различным набором субъединиц. Известно 5 изоферментов ЛДГ:ЛДГ1: ЛДГ2: ЛДГ3: ЛДГ4: ЛДГ5: (Н4) (Н3М) (Н2М2) (НМ3) (М4)ЛДГ1 экспрессируется в сердечной мышце и мозге, а ЛДГ5 – в скелетных мышцах и печени. Остальные формы в других органах. Появление ЛДГ в крови свидетельствует о повреждении органов (фермент из разрушенных клеток поступает в кровь – гиперферментемия) Повышение активности фракции ЛДГ1 в крови наблюдается при повреждении сердечной мышцы (инфаркт
миокарда), а повышение активности ЛДГ5 в крови наблюдается при гепатитах и повреждении скелетных мышц. То есть благодаря изоферментам можно определить локализацию поврежденного органа. Наиболее чувствительным тестом на инфаркт миокарда является повышение в крови сердечного изофермента креатинкиназы.
Энзимопатии наследственные (фенилкетонурия) и приобретенные (цинга). Применение ферментов для лечения болезней.
В основе многих заболеваний лежат нарушения функционирования ферментов в клетке - энзимопатии. Различают первичные (наследственные) и вторичные (приобретённые) энзимопатии. Приобретённые энзимопатии, как и вообще протеинопатии, по-видимому, наблюдают при всех болезнях.
При первичных энзимопатиях дефектные ферменты наследуются, в основном, по аутосомнорецессивному типу. Гетерозиготы, чаще всего, не
имеют фенотипических отклонений. Первичные энзимопатии обычно относят к метаболическим болезням, так как происходит нарушение определённых метаболических путей. При этом развитие заболевания может протекать по одному из ниже перечисленных “сценариев”. Рассмотрим условную схему метаболического пути:
Вещество А в результате последовательных ферментативных реакций превращается в продукт Р. При наследственной недостаточности какого-либо фермента, например фермента Е3, возможны разные нарушения метаболических путей:
Нарушение образования конечных продуктов.Недостаток конечного продукта этого метаболического пути (Р) (при отсутствии альтернативных путей синтеза) может приводить к развитию клинических симптомов, характерных для данного заболевания:
Накопление субстратов-предшественников.При
недостаточности фермента Е3будут накапливаться вещество С, а также во многих случаях и предшествующие соединения. Увеличение субстратов-предшественников дефектного фермента - ведущее звено развития многих заболеваний:
Нарушение образования конечных продуктов и накопление субстратов предшественников.Отмечают заболевания, когда одновременно недостаток продукта и накопление исходного субстрата вызывают клинические проявления.
Ферментные препараты широко используют в медицине. Ферменты в медицинской практике находят применение в качестве диагностических (энзимодиагностика) и терапевтических (энзимотерапия) средств. Кроме того, ферменты используют в качестве специфических реактивов для определения ряда веществ. Так, глюкозооксидазу применяют для количественного определения
глюкозы в моче и крови. Фермент уреазу используют для определения содержания количества мочевины в крови и моче. С помощью различных дегидрогеназ обнаруживают соответствующие субстраты, например пируват, лактат, этиловый спирт и др.
А. Энзимодиагностика
Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека. Принципы энзимодиагностики основаны на следующих позициях:
при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток;
количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения;
активность ферментов в биологических жидкостях,
обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени И отличается от нормальных значений;
ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность);
существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов.
Б. Применение ферментов в качестве лекарственных средств
Использование ферментов в качестве терапевтических средств имеет много ограничений вследствие их высокой иммуногениости. Тем не менее энзимотерапию активно развивают в следующих направлениях:
заместительная терапия - использование ферментов в случае их недостаточности;
элементы комплексной терапии - применение ферментов в
сочетании с другой терапией.
Заместительная энзимотерапия эффективна при желудочно-кишечных заболеваниях, связанных с недостаточностью секреции пищеварительных соков. Например, пепсин используют при ахилии, гипо- и анацидных гастритах. Дефицит панкреатических ферментов также в значительной степени может быть компенсирован приёмом внутрь препаратов, содержащих основные ферменты поджелудочной железы (фестал, энзистал, мезим-форте и др.).
В качестве дополнительных терапевтических средств ферменты используют при ряде заболеваний. Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин) применяют при местном воздействии для обработки гнойных ран с целью расщепления белков погибших клеток, для удаления сгустков крови или вязких секретов при воспалительных заболеваниях дыхательных путей. Ферментные препараты рибонуклеазу и
дезоксирибонуклеазу используют в качестве противовирусных препаратов при лечении аденовирусных конъюнктивитов, герпетических кератитов.
Общая схема синтеза и распада пиримидиновых нуклеотидов. Регуляция. Оротацидурия.
Оротацидурия
Это единственное нарушение синтеза пиримидиновde novo.Оно вызвано снижением активности
УМФ-синтазы, которая катализирует образование и декарбоксилирование ОМФ. Поскольку в эмбриогенезе от образования пиримидиновde novoзависит обеспечение синтеза ДНК субстратами, то жизнь плода невозможна при полном отсутствии активности этого фермента. Действительно, у всех пациентов с оротацидурией отмечают заметную, хотя и очень низкую активность УМФ-синтазы. Установлено, что содержание оротовои кислоты в моче пациентов (1 г/сут и более) значительно превосходит количество оротата, которое ежедневно синтезируется в норме (около 600 мг/сут). Снижение синтеза пиримидиновых нуклеотидов, наблюдающееся при этой патологии, нарушает регуляцию КАД-фермента по механизму ретроингибирования, из-за чего возникает гиперпродукция оротата.
Клинически наиболее характерное следствие оротацидурии - мегалобластная анемия, вызванная неспособностью организма
обеспечить нормальную скорость деления клеток эритроцитарного ряда. Её диагностируют у детей на том основании, что она не поддаётся лечению препаратами фолиевой кислоты.
Недостаточность синтеза пиримидиновых нуклеотидов сказывается на интеллектуальном развитии, двигательной способности и сопровождается нарушениями работы сердца и ЖКТ. Нарушается формирование иммунной системы, и наблюдается повышенная чувствительность к различным инфекциям.
Гиперэкскреция оротовои кислоты сопровождается нарушениями со стороны мочевыводящей системы и образованием камней. При отсутствии лечения больные обычно погибают в первые годы жизни. При этом оротовая кислота не оказывает токсического эффекта. Многочисленные нарушения в работе разных систем организма вызваны “пиримидиновым голодом”.
Для лечения этой болезни применяют уридин (от 0,5 до 1 г/сут), который по “запасному” пути превращается в УМФ.
Уридин + АТФ → УМФ + АДФ.
Нагрузка уридином устраняет “пиримидиновый голод”, а поскольку из УМФ могут синтезироваться все остальные нуклеотиды пиримидинового ряда, то снижается выделение оротовои кислоты из-за восстановления механизма ретроингибирования КАД-фермента. Для больных оротацидурией лечение уридином продолжается в течение всей жизни, и этот нуклеозид становится для них незаменимым пищевым фактором.
Кроме генетически обусловленных причин, оротацидурия может наблюдаться:
при гипераммониемии, вызванной дефектом любого из ферментов орнитинового цикла,
за исключением карбамоилфосфат- синтетазы I. В этом случае карбамоилфосфат, синтезированный в
митохондриях, выходит в цитозоль клеток и начинает использоваться на образование пиримидиновых нуклеотидов. Концентрация всех метаболитов, в том числе и оротовой кислоты, повышается. Наиболее значительная экскреция оротата отмечается при недостаточности орнитинкарбамоилтрансферазы (второго фермента орнитинового цикла);
в процессе лечения подагры аллопуринолом, который превращается в оксипуринолмононуклеотид и становится сильным ингибитором УМФ-синтазы. Это приводит к накоплению оротовой кислоты в тканях и крови.
Общая схема синтеза и распада пуриновых нуклеотидов.
Гиперурикемия подагры
Когда в плазме крови концентрация мочевой кислоты превышает норму, то возникает гиперурикемия. Вследствие гиперурикемии может развиться подагра - заболевание, при котором кристаллы мочевой кислоты и уратов откладываются в суставных хрящах, синовиальной оболочке, подкожной клетчатке с образованием подагрических узлов, или тофусов. К характерным признакам подагры
относят повторяющиеся приступы острого воспаления суставов (чаще всего мелких) - так называемого острого подагрического артрита. Заболевание может прогрессировать в хронический подагрический артрит.
Поскольку лейкоциты фагоцитируют кристаллы уратов, то причиной воспаления является разрушение лизосомальных мембран лейкоцитов кристаллами мочевой кислоты. Освободившиеся лизосомальные ферменты выходят в цитозоль и разрушают клетки, а продукты клеточного катаболизма вызывают воспаление.
Общий фонд сывороточных уратовв норме составляет ~ 1,2 г у мужчин и 0,6 г у женщин. При подагре без образования тофусов (т.е. подагрических узлов, в которых накапливаются ураты натрия и мочевая кислота) количество уратов возрастает до 2-4 г, а у пациентов с тяжёлой формой болезни, сопровождающейся ростом тофусов, может достигать 30 г.
Подагра - распространённое заболевание, в разных странах ею страдают от 0,3 до 1,7% населения. А поскольку сывороточный фонд уратов у мужчин в 2 раза больше, чем у женщин, то они и болеют в 20 раз чаще, чем женщины.
Как правило, подагра генетически детерминирована и носит семейный характер. Она вызвана нарушениями в работе ФРДФ синтетазы или ферментов “запасного” пути: гипоксантин-гуанин- или аденинфосфорибозилтрансфераз.
К другим характерным проявлениям подагры относят нефропатию, при которой наблюдают образование уратных камней в мочевыводящих путях.
Синтез дезоксирибонуклеотидов. Рибонуклеотидредуктазный комплекс. Биосинтез тимидиловых нуклеотидов, роль фолиевой кислоты и фолатредуктазы. Регуляция.
Реакцию восстановления НДФ в дезоксипроизводные катализирует рибонуклеотидредуктазный комплекс, в состав которого входят: собственно рибонуклеотидредуктаза (РНР), белок тиоредоксин и фермент тиоредоксинредуктаза, обеспечивающий регенерацию восстановленной формы тиоредоксина .
Рибонуклеотидредуктаза - олигомерный белок, состоящий из двух В1- и двух В2-субъединиц, и содержит негеминовое железо в качестве кофактора.
Непосредственным донором водорода в реакции восстановления рибозы служит низкомолекулярный
белок тиоредоксин. В рабочую часть этого белка входят 2 SH-группы, которые, отдавая водород, окисляются с образованием дисульфидного мостика. Второй фермент комплекса - тиоредоксинредуктаза - катализирует гидрирование окисленного тиоредоксина с использованием NADPH.
При участии комплекса РНР образуются: dАДФ, dГДФ, dУДФ и dЦДФ, которые с помощью НДФ-киназ превращаются в дНТФ, 3 из которых (кроме дУДФ) непосредственно используются в синтезе ДНК.
дНДФ + АТФ → дНТФ + АДФ.
Тимидин-5’-монофосфат (дТМФ) образуется из дУМФ в реакции, катализируемой тимидилатсинтазой. Донором метильной группы, появляющейся в 5-положении пиримидинового кольца в молекуле дТМФ, служит кофермент тимидилатсинтазы - N5,N10-метилен-Н4-фолат. С помощью этого кофермента в молекулу дУМФ включается метиленовая группа и восстанавливается в метальную, используя 2 атома водорода от Н4-фолата.
Образование субстрата тимидилатсинтазной реакции - дУМФ осуществляется двумя путями
дефосфорилированием дУДФ;
гидролитическим дезаминированием дЦМФ с помощью дЦМФ дезаминазы. дЦМФ получается при дефосфорилировании дЦДФ - одного из продуктов рибонуклеотидредуктазной реакции. В организме человека это основной путь образования дУМФ.
Скорость синтеза дТМФ зависит также от количества второго субстрата тимидилатсинтазной реакции - N5,N10-метилен-Н4-фолата, пополнение запасов которого осуществляется при участии 2
ферментов: дигидрофолатредуктазы, которая с участием NADPH восстанавливает Н2-фолат в Н4-фолат, и серии гидроксиметилтрансферазы, осуществляющей перенос β-гидроксиметиленовой группы серина на Н4-фолат. У человека дТМФ образуется, главным образом, из дЦДФ.
Регуляция синтеза дезоксирибонуклеотидов
Рибонуклеотидредуктаза, тимидилатсинтаза и тимидинкиназа - индуцируемые ферменты, их количество в клетке регулируется на генетическом уровне по механизму индукции и репрессии. Синтез этих белков начинает нарастать в G1-периоде, достигает максимума во время активного синтеза ДНК, снижаясь практически до нуля в G2- и М-периоды клеточного цикла.
В то же время активность РНР подвержена сложной аллостерической регуляции, с помощью которой достигается сбалансированное образование всех дНДФ.
РНР осуществляет последовательное восстановление всех рибонуклеозиддифосфатов. Первыми восстанавливаются пиримидиновые нуклеотиды, а последним - дАДФ. дАДФ фосфорилируется в дАТФ, накопление которого полностью прекращает восстановление всех остальных рибонуклеозиддифосфатов.
В терапии инфекционных и онкологических болезней, научных исследованиях в области медицины и биологии часто используют синтетические аналоги пуринов и пиримидинов. Введение в организм животного или человека аналога, имеющего изменения в структуре гетероциклического кольца или углеводной компоненты, угнетает активность ферментов, участвующих в метаболизме нуклеотидов, скорость синтеза РНК или ДНК из-за нарушения комплементарных взаимодействий азотистых оснований и роста полинуклеотидных цепей. Аналоги пуринов, пиримидинов и их
нуклеозиды нашли применение в качестве антибактериальных, противовирусных и химиотерапевтических средств.
А. Противоопухолевые препараты
Синтезировано очень много аналогов дНТФ, которые включаются ДНК полимеразами в ДНК и ингибируют репликацию. К числу мощных противоопухолевых препаратов принадлежит 5-фторурацил (5-FU) - аналог урацила.
Цитозинарабинозид (или цитарабин)представляет собой соединение, в котором остаток рибозы замещён на стериоизомер - арабинозу. Оно используется в химиотерапии рака, в частности, при острой миелоцитарной лейкемии.
В организме препарат может превращаться в дНТФ, ингибировать ДНК полимеразы и снижать скорость репликации.
Аналоги фолиевой кислоты.В обмене нуклеотидов производные Н4-фолата как доноры одноуглеродных групп участвуют в формировании пуринового гетероциклического кольца и в ключевой реакции синтеза дТМФ из дУМФ, катализируемой тимидилатсинтазой.
В последнем случае N5,N10-метилен-Н4-фолат служит донором метальной группы и в ходе реакции превращается в Н2-фолат. Для активного синтеза тимидиловых нуклеотидов Н2-фолат должен повторно использоваться, проходя стадию восстановления в Н4-фолат .
Метотрексат и аминоптерин - структурные аналоги фолиевой кислоты - ингибируют дигидрофолатредуктазу и таким образом нарушают синтез пуриновых нуклеотидов и превращение дУМФ в дТМФ, снижая внутриклеточную концентрацию субстратов синтеза ДНК и РНК. Препараты широко используют в химиотерапии опухолей.
Б. Антивирусные и антибактериальные препараты
Азидотимидин (AZT, или
зидовидин) представляет собой мощный противовирусный препарат, применяющийся в лечении инфекций, которые сопровождают приобретённые формы иммунодефицита. Будучи структурным аналогом тимид-на, препарат имеет в З’-положении дезоксирибозы азидогруппу .
AZT может фосфорилироваться и с помощью ДНК-полимераз включаться в растущую молекулу ДНК. Однако присутствие в 3’-положении дезоксирибозы азидогруппы делает синтезирующиеся молекулы ДНК не способными к последующему удлинению. В результате образование новых молекул ДНК прекращается.
Важно, что фосфорилированные производные AZT утилизируются более эффективно вирусной ДНК-полимеразой или так называемой обратной транскриптазой, чем ДНК-полимеразами эукариотов, поэтому препарат наиболее эффективно влияет на размножение вирусов и, в частности, ретровируса,
вызывающего ВИЧ-инфекцию.
5-йоддезоксиуридиниспользуют в терапии кератитов и поражений роговицы глаза вирусом герпеса.
Азатиопринв организме превращается в 6-меркаптопурин, который оказывает мощное иммуносупрессорное действие. Препарат широко используют в трансплантологии для предотвращения развития иммунологических реакций, вызывающих отторжение трансплантата.
Азотистые основания, входящие в структуру нуклеиновых кислот – пуриновые и пиримидиновые.
Первичная структура нуклеиновых кислот. ДНК и РНК–черты сходства и различия состава, локализации в клетке, функции.
Первичная структура ДНК -порядок чередования дезоксирибонуклеозидмонофосфатов (дНМФ) в полинукпеотидной цепи.
Каждая фосфатная группа в полинукпеотидной цепи, за исключением фосфорного остатка на 5’-конце молекулы, участвует в образовании двух эфирных связей с участием 3’- и 5’-углеродных атомов двух соседних дезоксирибоз, поэтому связь между мономерами обозначают 3’, 5’-фосфодиэфирной.
Концевые нуклеотиды ДНК различают по структуре: на 5’-конце находится фосфатная группа, а на 3’-конце цепи - свободная ОН-группа. Эти концы называют 5’- и 3’-концами. Линейная последовательность дезоксирибонуклеотидов в полимерной цепи ДНК обычно сокращённо записывают с помощью однобуквенного кода, например -A-G-C-T-T-A-C-A-
от 5’- к 3’-концу.
В каждом мономере нуклеиновой кислоты присутствует остаток фосфорной кислоты. При рН 7 фосфатная группа полностью ионизирована, поэтомуin vivoнуклеиновые кислоты существуют в виде полианионов (имеют множественный отрицательный заряд). Остатки пентоз тоже проявляют гидрофильные свойства. Азотистые основания почти нерастворимы в воде, но некоторые атомы пуринового и пиримидинового циклов способны образовыватьводородные связи.
Первичная структура РНК -порядок чередования рибонуклеозидмонофосфатов (НМФ) в полинуклеотидной
Концы полинуклеотидных цепей РНК неодинаковы. На одном конце находится фосфорилированная ОН-группа 5’-углеродного атома, на другом конце - ОН-группа 3’-углеродного атома рибозы, поэтому концы называют 5’- и 3’-концами цепи
РНК. Гидроксильная группа у 2’-углеродного атома рибозы делает молекулу РНК нестабильной. Так, в слабощелочной среде молекулы РНК гидролизуются даже при нормальной температуре, тогда как структура цепи ДНК не изменяется.
Признаки ДНК
Местонахождение в клетке
Ядро, митохондрии, хлоропласты
Местонахождение в ядре
Хромосомы
Строение макромолекулы
Двойной неразветвленный линейный полимер, свернутый правозакрученной спиралью
Мономеры
Рибонуклеотиды
Состав нуклеотид а
Азонистое основание (пуриновое-аденин, гуанин, пиримидиновое – тимин, цитозин); дезоксирибоза (углевод); остаток фосфорной кислоты
Типы нуклеидов
Адениловый (А), гуаниловый(Г), тимидиловый (Т), цитидиловый (Ц)
Свойства
Способная к самоудвоению по принципу комплементарности А=Т, Т=А, Г=Ц, Ц=Г Стабильна.
Функции
Химическая основа хромосомного генетического материала (гена); синтез ДНК, синтез РНК, информация о структуре белков.
Признаки РНК
Местонахождение в клетке
Ядро, рибосомы, цитоплазмы, митохондрии, хролопласты
Местонахождение в ядре
Ядрышко
Строение макромолекулы
Одинарная полинуклеотидная цепочка
Мономеры
Рибонуклеотиды
Состав нуклеотида
Азонистое основание (пуриновое-аденин, гуанин, пиримидиновое-урацил, цитозин);рибоза (углевод); остаток фосфорной кислоты
Типы нуклеидов
Адениловый (А), гуаниловый (Г), уридиловый (Т),цитидиловый (Ц)
Свойства
Не способна к самоудвоению. Лабильна.
Функции
Информационная (иРНК) – передает код наследственной информации о первичной структуре белковой молекулы, рибосомальная (рРНК) – входит в состав рибосом; транспортная (тРНК) – переносит аминокислоты к рибосомам; митохондриальная и платидная РНК – входят в состав рибосом этих органелл
Вторичная структура ДНК (модель Уотсона и Крика).
ДНК.В 1953 г. Дж. Уотсоном и Ф. Криком была предложена модель пространственной структуры ДНК. Согласно этой модели, молекула ДНК имеет форму спирали, образованную двумя полинуклеотидными цепями, закрученными относительно друг друга и вокруг общей оси. Двойная спиральправозакрученная,полинуклеотидньхе цепи в нейантипараллельны, т.е. если одна из них ориентирована в направлении 3’→5’, то вторая - в направлении 5’→3’. Поэтому на каждом из концов
Все основания цепей ДНК расположены внутри двойной спирали, а пентозофосфатный остов - снаружи. Полинуклеотидные цепи удерживаются относительно друг друга за счёт водородных связей между комплементарными пуриновыми и пиримидиновыми
азотистыми основаниями А и Т (две связи) и между G и С (три связи). При таком сочетании каждая пара содержит по три кольца, поэтому общий размер этих пар оснований одинаков по всей длине молекулы. Водородные связи при других сочетаниях оснований в паре возможны, но они значительно слабее. Последовательность нуклеотидов одной цепи полностью комплементарна последовательности нуклеотидов второй цепи. Поэтому, согласно правилу Чаргаффа (Эрвин Чаргафф в 1951 г. установил закономерности в соотношении пуриновых и пиримидиновых оснований в молекуле ДНК), число пуриновых оснований (А + G) равно числу пиримидиновых оснований (Т + С).
Комплементарые основания уложены в стопку в сердцевине спирали. Между основаниями двухцепочечной молекулы в стопке возникаютгидрофобные взаимодействия,стабилизирующие двойную спираль.
Такая структура исключает контакт азотистых остатков с водой, но стопка оснований не может быть абсолютно вертикальной. Пары оснований слегка смещены относительно друг друга. В образованной структуре различают две бороздки - большую, шириной 2,2 нм, и малую, шириной 1,2 нм. Азотистые основания в области большой и малой бороздок взаимодействуют со специфическими белками, участвующими в организации структуры хроматина.
Гибридизация нуклеиновых кислот. Денатурация и ренативация ДНК. Гибридизация (ДНК-ДНК, ДНК-РНК).
На явлении денатурации и ренативации основан метод, называемый”молекулярная гибридизация”.Процесс гибридизации может осуществляться между двумя любыми цепями нуклеиновых кислот (ДНК-ДНК,
ДНК-РНК) при условии, что они содержат комплементарные последовательности нуклеотидов. Такие гибридные структуры можно выделить центрифугированием в градиенте плотности сахарозы или наблюдать в электронном микроскопе .
Если раствор, содержащий образцы ДНК 1 и 2, выделенные из организмов разных видов, денатурировать, а затем провести ренатива-цию, то образуются двухспиральные структуры. Но наряду с исходными ДНК 1 и ДНК 2 образуются гибридные двойные спирали, содержащие цепь ДНК образца 1 и цепь ДНК образца 2, где присутствуют как спирализованные, так и неспирализованные участки. В неспирализованных участках фрагменты цепей ДНК не комплементарны, т.е. в ходе гибридизации получаются несовершенные гибриды. Методом молекулярной гибридизации можно установить:
сходство и различие первичной структуры разных образцов нуклеиновых кислот;
различие ДНК, выделенных из организмов разных видов;
идентичность ДНК всех органов и тканей одного организма.
При проведении гибридизации ДНК-РНК были выделены гибридные молекулы, содержащие одну цепь ДНК и одну цепь РНК. Если для эксперимента были взяты ДНК и РНК (первичный транскрипт), выделенные из одного организма, то образовывались совершенные гибриды, потому что молекула РНК комплементарна цепи ДНК. Гибридизацией ДНК-РНК было впервые установлено, что все виды РНК клетки имеют на молекуле ДНК комплементарные участки.
Третичная структура ДНК. Роль гистоновых и негистоновых белков в компакти-зации ДНК. Организация хроматина.
Каждая молекула ДНК упакована в отдельную хромосому. В диплоидных клетках человека содержится46 хромосом.Общая длина ДНК всех хромосом клетки составляет 1,74 м, но она упакована в ядре, диаметр которого в миллионы раз меньше. Чтобы расположить ДНК в ядре клетки, должна быть сформирована очень компактная структура. Компактизация и суперспирализация ДНК осуществляются с помощью разнообразных белков, взаимодействующих с определёнными последовательностями в структуре ДНК. Все связывающиеся с ДНК эукариотов белки можно разделить на 2 группы:гисгоновые и негистоновые белки.Комплекс белков с ядерной ДНК клеток называют хроматином.
Гистоны- белки с молекулярной
массой 11-21 кД, содержащие много остатков аргинина и лизина. Благодаря положительному заряду гистоны образуют ионные связи с отрицательно заряженными фосфатными группами, расположенными на внешней стороне двойной спирали ДНК.
Существует 5 типов гистонов. Четыре гистона Н2А, Н2В, НЗ и Н4 образуют октамерный белковый комплекс (Н2А, Н2В, НЗ, Н4)2, который называют”нуклеосомный кор”(от англ.nucleosome core). Молекула ДНК “накручивается” на поверхность гистонового октамера, совершая 1,75 оборота (около 146 пар нуклеоти-дов). Такой комплекс гистоновых белков с ДНК служит основной структурной единицей хроматина, её называют”нуклеосома”.ДНК, связывающую нуклеосомные частицы, называют линкерной ДНК. В среднем линкерная ДНК составляет 60 пар нуклеотидных остатков. Молекулы гистона H1 связываются с ДНК в межнуклеосомных участках
(линкерных последовательностях) и защищают эти участки от действия нуклеаз .
В ядре каждой клетки присутствует около 60 млн молекул каждого типа гистонов, а общая масса гистонов примерно равна содержанию ДНК. Аминокислотные остатки лизина, аргинина и концевые аминогруппы гистонов могут модифицироваться: ацетилироваться, фосфорилироваться, метилироваться или взаимодействовать с белком убиквитином (негистоновый белок). Модификации бывают обратимыми и необратимыми, они изменяют заряд и конформацию гистонов, а это влияет на взаимодействие гистонов между собой и с ДНК. Активность ферментов, ответственных за модификации, регулируется и зависит от стадии клеточного цикла. Модификации делают возможными конформационные перестройки хроматина.
Негистоновые белки хроматина
В ядре эукариотической клетки
присутствуют сотни самых разнообразных ДНК-связывающих негистоновых белков. Каждый белок комплементарен определённой последовательности нуклеотидов ДНК(сайт ДНК).К этой группе относят семейство сайт-специфических белков типа “цинковые пальцы”. Каждый “цинковый палец” узнаёт определённый сайт, состоящий из 5 нуклеотидных пар. Другое семейство сайт-специфических белков - гомодимеры. Фрагмент такого белка, контактирующий с ДНК, имеет структуру “спираль-поворот-спираль”. К группе структурных и регуляторных белков, которые постоянно ассоциированы с хроматином, относят белки высокой подвижности (HMG-белки- от англ,high mobility gel proteins). Они имеют молекулярную массу менее 30 кД и характеризуются высоким содержанием заряженных аминокислот. Благодаря небольшой молекулярной массе HMG-белки обладают высокой подвижностью при
электрофорезе в полиакриламидном геле. К негистоновым белкам принадлежат также ферменты репликации, транскрипции и репарации. При участии структурных, регуляторных белков и ферментов, участвующих в синтезе ДНК и РНК, нить нуклеосом преобразуется в высококонденсированный комплекс белков и ДНК. Образованная структура в 10 000 раз короче исходной молекулы ДНК.
Репликация. Принципы репликации ДНК. Стадии репликации. Инициация.
Живые организмы в течение S-фазы клеточного цикла, которая предшествует делению клетки, удваивают содержание ДНК таким образом, что каждая дочерняя клетка после деления получает набор хромосом, идентичный родительской клетке. Процесс удвоения хромосом называют репликацией
(редупликацией).
Хромосома содержит одну непрерывную двухцепочечную молекулу ДНК. При репликации каждая цепь родительской двухцепочечной ДНК служит матрицей для синтеза новой комплементарной цепи. Вновь образованная двойная спираль имеет одну исходную (родительскую) и одну вновь синтезированную (дочернюю) цепь. Такой механизм удвоения ДНК получил название”полуконсервативная репликация”(рис. 4-14). Первичная структура дочерней цепи определяется первичной структурой родительской цепи, потому что в основе её образования лежит принцип комплементарности оснований (G ≡ С и А = Т).
Ферменты и белки, участвующие в репликации, должны работать быстро и точно. Эти условия выполняются с помощью особого мультиферментного комплекса.
Репликацию можно разделить на 4
этапа: образование репликативной вилки (инициация), синтез новых цепей (элонгация), исключение праймеров, завершение синтеза двух дочерних цепей ДНК (терминация).
А. Инициация репликации
Синтез ДНК у эукариотов происходит в S-фазу клеточного цикла. Инициацию репликации регулируют специфические сигнальные белковые молекулы -факторы роста.Факторы роста связываются рецепторами мембран клеток, которые передают сигнал, побуждающий клетку к началу репликации .
Синтез новых одноцепочечных молекул ДНК может произойти только при расхождении родительских цепей. В определённом сайте(точка начала репликации)происходит локальная денатурация ДНК, цепи расходятся и образуются дверепликативные вилки,движущиеся в противоположных направлениях.
В образовании репликативной
вилки принимает участие ряд белков и ферментов. Так, семейство ДНК-топоизомераз (I, II и III), обладая нуклеазной активностью, участвует в регуляции суперспирализации ДНК. Например,ДНК-топоизомераза Iразрывает фосфоэфирную связь в одной из цепей двойной спирали и ковалентно присоединяется к 5’-концу в точке разрыва . По окончании формирования репликативной вилки фермент ликвидирует разрыв в цепи и отделяется от ДНК.
Разрыв водородных связей в двухцепочечной молекуле ДНК осуществляетДНК-хеликаза.Фермент ДНК-хеликаза использует энергию АТФ для расплетения двойной спирали ДНК.
В результате происходит раскручивание участка суперспирализованной молекулы ДНК. В поддержании этого участка ДНК в раскрученном состоянии участвуютSSB-белки(от англ,single strand binding proteins,т.е. белки, связывающиеся с одноцепочечными
нитями ДНК). SSB-белки, не закрывая азотистых оснований, связываются с одноцепочечной ДНК по всей длине разделившихся цепей и таким образом предотвращают их комплементарное скручивание и образование “шпилек”. Они обладают большим сродством к одноцепочечным участкам ДНК, независимо от первичной структуры цепей.
Элонгация и терминация репликации. Ферменты. Асимметричный синтез ДНК. Фрагменты Оказаки.
Репликация ДНК осуществляется ДНК-зависимыми ДНК-полимеразами .Субстратами и источниками энергии для синтеза продукта служат 4 макроэргических соединения - дезоксирибонуклеозидтрифосфаты дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ, для активации которых необходимы ионы магния. Нейтрализуя отрицательный заряд нуклеотидов, они повышают их
реакционную способность. Ферменты проявляют каталитическую активность только в присутствии предварительно раскрученной матричной двухцепочечной ДНК. Синтез цепей ДНК происходит в направлении 5’→3’ растущей цепи, т.е. очередной нуклеотид присоединяется к свободному 3’-ОН-концу предшествующего нуклеотидного остатка. Синтезируемая цепь всегда антипараллельна матричной цепи. В ходе репликации образуются 2 дочерние цепи, представляющие собой копии матричных цепей.
В синтезе эукариотических ДНК принимают участие 5 ДНК-полимераз (α, β, γ, δ, ε).ДНК-полимеразыразличают по числу субъединиц, молекулярной массе, ассоциации с разными вспомогательными белками, ускоряющими процесс биосинтеза ДНК, и функциональному назначению. ДНК-полимеразы α (альфа), β (бета), δ (дельта), ε (эпсилон) участвуют в синтезе ДНК в
ядре клеток, ДНК-полимераза γ (гамма) - в репликации митохондриальной ДНК.
ДНК-полимеразы β, δ, ε не могут инициировать образование дочерних цепей, так как не имеют сродства к одиночной нити ДНК. Инициирует репликацию ДНК-полимераза α, которая комплементарна определённому сайту одноцепочечной ДНК. Присоединяясь к нему, ДНК-полимераза а синтезирует небольшой фрагмент РНК - праймер, состоящий из 8-10 рибонуклеотидов. ДНК-полимераза а состоит из четырёх субъединиц. Каждая из субъединиц фермента выполняет определённую функцию: “узнавание” сайта репликации, синтез праймера (8-10 рибонуклеотидов), синтез фрагмента цепи ДНК, около 50 дезоксирибонуклеотидов. Таким образом, ДНК-полимераза α синтезирует олигонуклеотид, содержащий примерно 60 нуклеотидных остатков; первые 8-10 представлены рибонуклеотидами (праймер), а остальные -
дезоксирибонуклеотидами.
ДНК-полимераза δ
Олигонуклеотид, синтезированный ДНК-полимеразой α и образующий небольшой двухцепочечный фрагмент с матрицей, позволяет присоединиться ДНК-полимеразе δ и продолжить синтез новой цепи в направлении от 5’- к 3’-концу по ходу раскручивания репликативной вилки.
ДНК-полимераза δ последовательно наращивает цепь, шаг за шагом присоединяя к ней соответствующие дезоксинуклеотиды. Выбор ДНК-полимеразой δ очередного нуклеотида определяется матрицей. Включение дезоксирибонуклеозидмонофосфатов в растущую цепь ДНК сопровождается гидролизом макроэргических связей соответствующих нуклеозидтрифосфатов и отщеплением пирофосфата (Н4Р2О7). Энергия макроэргических связей расходуется на образование 3’,5’-фосфодиэфирной связи между последним нуклеотидом растущей
цепи ДНК и присоединяемым нуклеотидом. Включение нуклеотида в синтезируемую цепь ДНК невозможно без предварительного связывания азотистого основания водородными связями с комплементарным нуклеотидом матричной цепи. ДНК-полимеразы (α, β, γ, δ, ε) могут синтезировать нуклеотидную цепь только в направлении 5’→3’, матричная цепь всегда считывается в направлении 3’→5’.
В каждой репликативной вилке идёт одновременно синтез двух новых (дочерних) цепей. Направление синтеза цепи ДНК совпадает с направлением движения репликативной вилки лишь для одной из вновь синтезируемых цепей(лидирующая цепь).На второй матричной цепи синтез дочерней ДНК осуществляется двумя ферментами: ДНК-полимеразой α и ДНК-полимеразой ε в направлении 5’→3’, но против движения репликативной вилки. Поэтому вторая цепь синтезируется
прерывисто, короткими фрагментами, которые называют”фрагменты Оказаки”(по имени открывшего их исследователя). Дочерняя цепь ДНК, синтез которой происходит фрагментами, называют отстающей цепью. Каждый фрагмент Оказаки, примерно 100 нуклеотидных остатков, содержит праймер. Праймеры удаляет ДНК-полимераза β, постепенно отщепляя с 3’-конца фрагмента по одному рибонуклеотиду. К ОН-группе на 3’-конце предыдущего фрагмента ДНК-полимераза β присоединяет дезоксирибонуклеотиды в количестве, равном вырезанному праймеру и таким образом заполняет брешь, возникающую при удалении рибонуклеотидов.
Фермент ДНК-лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между 3’-ОН-группой дезоксирибозы одного фрагмента цепи ДНК и 5’-фосфатом следующего фрагмента. Реакция протекает с затратой энергии АТФ. Таким образом, из множества фрагментов Оказаки образуется
непрерывная цепь ДНК.
Повреждения и репарация ДНК. Виды повреждений.
Процесс, позволяющий живым организмам восстанавливать повреждения, возникающие в ДНК, называют репарацией. Все репарационные механизмы основаны на том, что ДНК - двухцепочечная молекула, т.е. в клетке есть 2 копии генетической информации. Если нуклеотидная последовательность одной из двух цепей оказывается повреждённой (изменённой), информацию можно восстановить, так как вторая (комплементарная) цепь сохранена.
Процесс репарации происходит в несколько этапов. На первом этапе выявляется нарушение комплементарности цепей ДНК. В ходе второго этапа
некомплементарный нуклеотид или только основание устраняется, на третьем и четвёртом этапах идёт восстановление целостности цепи по принципу комплементарности. Однако в зависимости от типа повреждения количество этапов и ферментов, участвующих в его устранении, может быть разным.
Очень редко происходят повреждения, затрагивающие обе цепи ДНК, т.е. нарушения структуры нуклеотидов комплементарной пары. Такие повреждения в половых клетках не репарируются, так как для осуществления сложной репарации с участием гомологичной рекомбинации требуется наличие диплоидного набора хромосом.
Спонтанные повреждения
Индуцируемые повреждения
Дефекты репарационных систем и наследственные болезни
Спонтанные повреждения
Нарушения комплементарности цепей ДНК могут происходить спонтанно, т.е. без участия каких-либо повреждающих факторов, например в результате ошибок репликации, дезаминирования нуклеотидов, депуринизации.
Ошибки репликации
Точность репликации ДНК очень велика, но примерно один раз на 105-106нуклеотидных остатков происходят ошибки спаривания, и тогда вместо пары нуклеотидов А-Т, G-С в дочернюю цепь ДНК оказываются включёнными нуклеотиды, некомплементарные нуклеотидам матричной цепи. Однако ДНК-полимеразы δ, ε способны после присоединения очередного нуклеотида в растущую цепь ДНК делать шаг назад (в направлении от 3’- к 5’- концу) и вырезать последний нуклеотид, если он некомплементарен нуклеотиду в матричной цепи ДНК. Этот процесс исправления ошибок спаривания (или коррекция) иногда не срабатывает, и тогда в ДНК по окончании репликации остаются некомплементарные пары, тем более, что ДНК-полимераза а лишена корректирующего механизма и “ошибается” чаще, чем другие полимеразы.
При неправильном спаривании в
первичной структуре дочерней цепи ДНК необычные основания не появляются, нарушена только комплементарность. Система репарации некомплементарных пар должна происходить только на дочерней цепи и производить замену некомплементарных оснований только в ней. Ферменты, участвующие в удалении неправильной пары нуклеотидов, распознают матричную цепь по наличию метилированных остатков аденина в последовательностях-GATC-.Пока основания нуклеотидных остатков в дочерней цепи неметилированы, ферменты должны успеть выявить ошибку репликации и устранить её.
Распознавание и удаление (первый этап) некомплементарного нуклеотида происходят при участии специальных белковmut S, mut L, mut H. Каждый из белков выполняет свою специфическую функцию. Mut S находит неправильную пару и связывается с этим фрагментом. Mut Н присоединяется к метилированному
(по аденину) участку -GATC-, расположенному вблизи некомплементарной пары. Связующим между mut S и mut Н служит белок mut L, его присоединение завершает образование активного фермента. Формирование комплекса mut S, mut L, mut Н на участке, содержащем ошибку, способствует проявлению у белка mut Н эндонуклеазной активности. Ферментативный комплекс гидролизует фосфоэфирную связь в неметилированной цепи .
К свободным концам цепи присоединяется экзонуклеаза (второй этап). Отщепляя по одному нуклеотиду в направлении от 3’- к 5’- концу дочерней цепи, она устраняет участок, содержащий некомплементарную пару. Брешь застраивает ДНК-полимераза β (третий этап), соединение основного и вновь синтезированного участков цепи катализирует фермент ДНК-лигаза (четвёртый этап). Для успешного функционирования экзонуклеазы, ДНК-полимеразы р и
ДНК-лигазы необходимо участие в репарации хеликазы и SSB-белков.
Депуринизация
Депуринизация (апуринизация)
ДНК каждой клетки человека теряет за сутки около 5000 пуриновых остатков вследствие разрыва N-гликозидной связи между пурином и дезоксирибозой .
Тогда в молекуле ДНК на месте этих оснований образуется участок, лишённый азотистых оснований, названный АП-сайтом (AP-site, или апуриновый сайт). Термин “АП-сайт” используют также в тех случаях, когда из ДНК выпадают пиримидиновые основания и образуются апиримидиновые сайты (от англ,apurinic-apyrimidinic site).
Этот тип повреждений устраняет ферментДНК-инсертаза(от англ,insert- вставлять), который может присоединять к дезоксирибозе основание в соответствии с правилом комплементарности. В этом случае нет необходимости разрезать цепь ДНК, вырезать неправильный нуклеотид и репарировать разрыв.
Дезаминирование
Дезаминирование
Реакции дезаминирования цитозина и превращение его в урацил , аденина в гипоксантин, гуанина в ксантин происходят значительно реже, чем депуринизация, и составляют 10 реакций на один геном в сутки.
Исправление этого вида спонтанного повреждения происходит в 5 этапов (рис. 4-24). В репарации принимает участиеДНК-N-гликозилаза,гидролизующая связи между аномальным основанием и дезоксирибозой (первый этап), в результате образуется АП-сайт, который распознаёт ферментАП-эндонуклеаза(второй этап). Как только в цепи ДНК возникает разрыв, в работу вступает ещё один фермент - АП-экзонуклеаза, который отщепляет от цепи дезоксирибозу, лишённую основания (третий этап). В цепи ДНК появляется брешь размером в один нуклеотид. Следующий фермент ДНК-полимераза b к З’-концу разорванной цепи присоединяет нуклеотид по принципу
комплементарности (четвёртый этап). Чтобы соединить два свободных конца (3’-конец встроенного нуклеотида и 5’-конец основной цепи), требуется ещё один фермент - ДНК-лигаза (пятый этап).
Нерепарируемо и поэтому опасно дезаминирование метилированного цитозина. Продукт его спонтанного дезаминирования - тимин
Индуцируемые повреждения
Индуцируемые повреждения возникают в ДНК в результате воздействия разнообразных мутагенных факторов как радиационной, так и химической природы.
Образование димеров пиримидиновых оснований
Под действием УФО двойная связь между С5и С6атомами углерода в составе пиримидиновых оснований (тимине и цитозине) может разрываться. Атомы углерода остаются связанными одной связью. Расстояние между параллельными плоскостями оснований
полинуклеотидной цепи, в которых произошёл разрыв., равно примерно 3,4*. Это расстояние позволяет освободившимся валентностям между С-С атомами пиримидиновых оснований, расположенных последовательно в цепи ДНК, сформировать циклобутановое кольцо . В зависимости от того, какие основания соединены в димер, их называют димерами тимина, цитозина или тимин-цитозиновыми димерами.
Удаление пиримидиновых димеров происходит под действиемфотолиазыФермент расщепляет вновь образовавшиеся связи между соседними пиримидиновыми основаниями и восстанавливает нативную структуру. В фотолиазе есть участок, либо сам поглощающий фотоны (в синей части спектра), либо связывающийся с кофакторами, адсорбирующими свет. Таким образом, свет активирует фотолиазу, которая распознаёт димеры в облучённой ДНК, присоединяется к ним и разрывает возникшие между пиримидиновыми
кольцами связи. После этого фермент отделяется от ДНК.
Повреждения оснований ДНК химическими мутагенами
Азотистые основания в ДНК могут подвергаться разнообразным повреждениям: алкилированию, окислению, восстановлению или связыванию основания с формамидными группировками. Репарация начинается с присоединения ДНК-N-гликозилазы к повреждённому основанию. Существует множество ДНК-М-гликозилаз, специфичных к разным модифицированным основаниям. Ферменты гидролитически расщепляют N-гликозидную связь между изменённым основанием и дезоксирибозой, это приводит к образованию АП-сайта в цепи ДНК (первый этап). Репарация АП-сайта может происходить или только при участии ДНК-инсертазы, которая присоединяет к дезоксирибозе основание в соответствии с правилом комплементарности, или при участии
всего комплекса ферментов, участвующих в репарации: АП-эндонуклеазы, АП-экзонуклеазы, ДНК-полимеразы β и ДНК-лигазы.
Дефекты репарационных систем и наследственные болезни
Репарация необходима для сохранения нативной структуры генетического материала на протяжении всей жизни организма. Снижение активности ферментов репарационных систем приводит к накоплению повреждений (мутаций) в ДНК.
Причиной многих наследственных болезней человека выступает нарушение отдельных этапов процесса репарации.
Пигментная ксеродерма
У больных в системе репарации снижена активность ферментов, ответственных за удаление неправильных оснований, “застройку” бреши и другие функции. Дефект репарационной системы проявляется в сверхчувствительности к УФ-свету, что приводит к появлению красных
пятен на коже, переходящих в незаживающие коросты и нередко в рак кожи.
Трихотиодистрофия
Трихотиодистрофия
Заболевание связано с повышенной фоточувствительностью ДНК, вызванной снижением активности фермента, участвующего в удалении димеров тимина. Симптомы заболевания: ломкость волос вследствие нехватки серы в белках волос и их луковиц; часто умственная д физическая отсталость; аномалии кожи и зубов.
Транскрипция
Транскрипция - первая стадия реализации генетической информации в клетке. В ходе процесса образуются молекулы мРНК, служащие матрицей для синтеза белков, а также транспортные, рибосомальные и
другие виды молекул РНК, выполняющие структурные, адапторные и каталитические функции .
Транскрипция у эукариотов происходит в ядре. В основе механизма транскрипции лежит тот же структурный .принцип комплементарного спаривания оснований в молекуле РНК (G ≡ C, A=U и Т=А). ДНК служит только матрицей и в ходе транскрипции не изменяется. Рибонуклеозидтрифосфаты (ЦТФ, ГТФ, АТФ, УТФ) -субстраты и источники энергии, необходимые для протекания полимеразной реакции, образования 3’,5’-фосфодиэфирной связи между рибонуклеозидмонофосфатами.
Синтез молекул РНК начинается в определённых последовательностях (сайтах) ДНК, которые называютпромоторы,и завершается в терминирующих участках(сайты терминации).Участок ДНК, ограниченный промотором и сайтом
терминации, представляет собой единицу транскрипции -транскриптон.У эукариотов в состав транскриптона, как правило, входит один ген, у прокариотов несколько. В каждом транскриптоне присутствует неинформативная зона; она содержит специфические последовательности нуклеотидов, с которыми взаимодействуют регуляторные транскрипционные факторы.
Транскрипционые факторы
Транскрипционые факторы -белки, взаимодействующие с определёнными регуляторными сайтами и ускоряющие или замедляющие процесс транскрипции. Соотношение информативной и неинформативной частей в транскриптонах эукариотов составляет в среднем 1:9 (у прокариотов 9:1).
Соседние транскриптоны могут быть отделены друг от друга нетранскрибируемыми участками ДНК. Разделение ДНК на множество транскриптонов позволяет
осуществлять с разной активностью индивидуальное считывание (транскрипцию) разных генов.
В каждом транскриптоне транскрибируется только одна из двух цепей ДНК, которая называется матричной,вторая, комплементарная ей цепь, называетсякодирующей.Синтез цепи РНК идёт от 5’- к З’-концу, при этом матричная цепь ДНК всегда антипараллельна синтезируемой нуклеиновой кислоте.
Транскрипция не связана с фазами клеточного цикла; она может ускоряться и замедляться в зависимости от потребности клетки или организма в определённом белке.
РНК-полимеразы
Биосинтез РНК осуществляется ДНК-зависимыми РНК-полимеразами. В ядрах эукариотов обнаружены 3 специализированные РНК-полимеразы:РНК-полимераза I,синтезирующая пре-рРНК;РНК-полимераза II,ответственная за синтез пре-мРНК;РНК-полимераза
III,синтезирующая пре-тРНК. РНК-полимеразы - олигомерные ферменты, состоящие из нескольких субъединиц - 2α, β, β’, σ. Субъединица о (сигма) выполняет регуляторную функцию, это один из факторов инициации транскрипции, РНК-полимеразы I, II, III, узнающие разные промоторы, содержат разные по строению субъединицы σ.
Стадии транскрипции
В процессе транскрипции различают 3 стадии: инициацию, элонгацию и терминацию.
Инициация
Активация промотора происходит с помощью большого белка -ТАТА-фактора,называемого так потому, что он взаимодействует со специфической последовательностью нуклеотидов промотора -ТАТААА- (ТАТА-бокс).Присоединение ТАТА-фактора облегчает взаимодействие промотора с РНК-полимеразой. Факторы инициации вызывают изменение конформации РНК-полимеразы и обеспечивают
раскручивание примерно одного витка спирали ДНК, т.е. образуетсятранскрипционная вилка, в которой матрица доступна для инициации синтеза цепи РНК .После того как синтезирован олигонуклеотид из 8-10 нуклеотидных остатков, σ-субъединица отделяется от РНК-полимеразы, а вместо неё к молекуле фермента присоединяются несколько факторов элонгации.
Элонгация
Факторы элонгации повышают активность РНК-полимеразы и облегчают расхождение цепей ДНК. Синтез молекулы РНК идёт от 5’- к З’-концу комплементарно матричной цепи ДНК. На стадии элонгации, в области транскрипционной вилки, одновременно разделены примерно 18 нуклеотидных пар ДНК. Растущий конец цепи РНК образует временную гибридную спираль, около 12 пар нуклеотидных остатков, с матричной цепью ДНК. По мере продвижения РНК-полимеразы по матрице в направлении от 3’- к 5’-концу впереди неё происходит расхождение, а позади - восстановление двойной спирали ДНК.
Терминация
Раскручивание двойной спирали ДНК в области сайта терминации делает его доступным для фактора терминации. Завершается синтез РНК в строго определенных участках матрицы - терминаторах(сайты терминации).Фактор терминации облегчает отделение первичного транскрипта(пре-мРНК),комплементарного матрице, и РНК-полимеразы от матрицы. РНК-полимераза может вступить в следующий цикл транскрипции после присоединения субъединицы σ.
Первичный транскрипт и его процессинг.
Первичные транскрипты мРНК, прежде чем будут использованы в ходе синтеза белка, подвергаются ряду ковалентных модификаций. Эти модификации необходимы для функционирования мРНК в качестве матрицы.
Модификация 5’-конца
Модификации пре-мРНК начинаются на стадии элонгации. Когда длина первичного транскрипта достигает примерно 30 нуклеотидных остатков, происходиткэпированиеего 5’-конца. Осуществляет кэпирование гуанилилтрансфераза. Фермент гидролизует макроэргическую связь в молекуле ГТФ и присоединяет нуклеотиддифосфатный остаток 5’-фосфатной группой к 5’-концу синтезированного фрагмента РНК с образованием 5’, 5’-фосфодиэфирной связи. Последующее метилирование остатка гуанина в составе ГТФ с образованием N7-метилгуанозина завершает формирование кэпа .
Модифицированный 5’-конец обеспечивает инициацию трансляции, удлиняет время жизни мРНК, защищая её от действия 5’-экзонуклеаз в цитоплазме.
Кэпирование необходимо для инициации синтеза белка, так как инициирующие триплеты AUG, GUG распознаются рибосомой только если присутствует кэп. Наличие кэпа также необходимо для работы сложной ферментной системы, обеспечивающей удаление нитронов.
Модификация 3’-конца
3’-Конец большинства транскриптов, синтезированных РНК-полимеразой II, также подвергается модификации, при которой специальным ферментом полиА-полимеразой формируется полиА-последовательность (полиА-“хвост”), состоящая из 100-200 остатков адениловой кислоты.
Сигналом к началу полиаденилирования является последовательность-AAUAAA-на растущей цепи РНК. Фермент полиА-полимераза, проявляя экзонуклеазную активность, разрывает 3’-фосфоэфирную связь после появления в цепи РНК специфической последовательности -AAUAAA-. К 3’-концу
3’-концу в точке разрыва полиА-полимераза наращивает полиА-“хвост”, Наличие полиА-последовательности на 3’-конце облегчает выход мРНК из ядра и замедляет её гидролиз в цитоплазме.
Ферменты, осуществляющие кэширование и полиаденилирование, избирательно связываются с РНК-полимеразой II, и в отсутствие полимеразы неактивны.
Сплайсинг первичных транскриптов мРНК
С появлением методов, позволяющих изучать первичную структуру молекул мРНК в цитоплазме и последовательность нуклеотидов кодирующей её геномной ДНК, было установлено, что они не комплементарны, а длина гена в несколько раз больше “зрелой” мРНК. Последовательности нуклеотидов, присутствующие в ДНК, но не входящие в состав зрелой мРНК, были названы некодирующими, илиинтроны,а последовательности, присутствующие
в мРНК, - кодирующими, илиэкзоны.Таким образом, первичный транскрипт - строго комплементарная матрице нуклеиновая кислота (пре-мРНК), содержащая как экзоны, так и интроны. Длина интронов варьирует от 80 до 1000 нуклеотидов. Последовательности интронов “вырезаются” из первичного транскрипта, концы экзонов соединяются друг с другом. Такую модификацию РНК называют”сплайсинг”(от англ,to splice -сращивать). Сплайсинг происходит в ядре, в цитоплазму поступает уже “зрелая” мРНК.
Гены эукариотов содержат больше интронов, чем экзонов, поэтому очень длинные молекулы пре-мРНК (около 5000 нуклеотидов) после сплайсинга превращаются в более короткие молекулы цитоплазматической мРНК (от 500 до 3000 нуклеотидов).
Процесс “вырезания” интронов протекает при участии малых ядерных рибонуклеопротеинов
(мяРНП). В состав мяРНП входит малая ядерная РНК (мяРНК), нуклеотидная цепь которой связана с белковым остовом, состоящим из нескольких протомеров. В сплайсинге принимают участие различные мяРНП.Нуклеотидные последовательности нитронов функционально неактивны. Но на 5’- и З’-концах они имеют высокоспецифические последовательности - AGGU- и GAGG- соответственно (сайты сплайсинга), которые обеспечивают их удаление из молекулы пре-мРНК. Изменение структуры этих последовательностей влияет на процесс сплайсинга.
На первой стадии процесса мяРНП связываются со специфическими последовательностями первичного транскрипта (сайты сплайсинга), далее к ним присоединяются другие мяРНП. При формировании структуры сплайсосомы 3’-конец одного экзона сближается с 5’-концом следующего экзона. Сплайсосома катализирует реакцию расщепления
3’,5’-фосфодиэфирной связи на границе экзона с интроном. Последовательность интрона удаляется, а два экзона соединяются. Образование 3’,5’-фосфодиэфирной связи между двумя экзонами катализируют мяРНК (малые ядерные РНК), входящие в структуру сплайсосомы. В результате сплайсинга из первичных транскриптов мРНК образуются молекулы “зрелой” мРНК.
Регуляция транскрипции у прокариот
- Теория оперона
- Индукция синтеза белков. Lac-оперон
- Репрессия синтеза белков. Триптофановыйи гистидиновый опероны
Теория оперона
Гены белков, функции которых в метаболических процессах тесно связаны, часто в геноме группируются вместе в структурные единицы(опероны).Согласно теории Жакоба и Моно, оперонами называют участки молекулы ДНК, которые содержат информацию о группе функционально взаимосвязанных структурных белков, и регуляторную
зону, контролирующую транскрипцию этих генов. Структурные гены оперона экспрессируются согласованно, либо все они транскрибируются, и тогда оперон активен, либо ни один из генов не “прочитывается”, и тогда оперон неактивен. Когда оперон активен и все его гены транскрибируются, то синтезируется полицистронная мРНК, служащая матрицей для синтеза всех белков этого оперона. Транскрипция структурных генов зависит от способности РНК-полимеразы присоединяться к промотору, расположенному на 5’-конце оперона перед структурными генами.
Связывание РНК-полимеразы с промотором зависит от присутствия белка-репрессора на смежном с промотором участке, который называют”оператор”.Белок-репрессор синтезируется в клетке с постоянной скоростью и имеет сродство к операторному участку. Структурно участки промотора и оператора частично перекрываются,
поэтому присоединение белка-репрессора к оператору создаёт стерическое препятствие для присоединения РНК-полимеразы.
Большинство механизмов регуляции синтеза белков направлено на изменение скорости связывания РНК-полимеразы с промотором, влияя таким образом на этап инициации транскрипции. Гены, осуществляющие синтез регуляторных белков, могут быть удалены от оперона, транскрипцию которого они контролируют.
Индукция синтеза белков. Lac-оперон
Теория оперона была предложена на основании данных, полученных при изучении свойств лактозного оперона (laс-оперона)Е. coli,т.е. оперона, в котором закодированы белки, участвующие в усвоении лактозы.
КлеткиЕ. coliобычно растут на среде, используя в качестве источника углерода глюкозу. Если в среде культивирования глюкозу заменить на
дисахарид лактозу, то по прошествии нескольких минут клетки адаптируются к изменившимся условиям. Они начинают продуцировать 3 белка, обеспечивающих утилизацию лактозы. Один из этих белков - фермент β-галактозидаза, катализирующий гидролитическое расщепление лактозы до глюкозы и галактозы.
В присутствии глюкозы клеткиЕ. coliсодержат менее 10 молекул этих ферментов на клетку. Перенос клеток на среду, содержащую лактозу, вызывает индукцию - увеличение количества молекул каждого из ферментов до 5000 .
Теория оперона объясняет это явление следующим образом. В отсутствие индуктора (лактозы) белок-репрессор связан с оператором. А поскольку участки оператора и промотора перекрываются, то присоединение репрессора к оператору препятствует связыванию РНК-полимеразы с промотором, и
транскрипция структурных генов оперона не идёт. Когда в среде появляется индуктор, т.е. лактоза, то он присоединяется к белку-репрессору, изменяет его конформацию и снижает сродство к оператору. РНК-полимераза связывается с промотором и транскрибирует структурные гены.
Репрессия синтеза белков. Триптофановыйи гистидиновый опероны
Снижение концентрации фермента в бактериальной клетке может осуществляться путём репрессии синтеза ферментов. Сущность этого механизма регуляции заключается в следующем: когда клеткиЕ. coliрастут на среде, содержащей в качестве единственного источника азота соль аммония, то им приходится синтезировать все азотсодержащие вещества. Такие клетки, в частности, должны содержать все ферменты, необходимые для синтеза 20 различных аминокислот. Однако если добавить в среду культивирования
одну из аминокислот, например триптофан или гистидин, то клетка перестанет вырабатывать весь набор ферментов, необходимых для синтеза этих аминокислот из аммиака и источника углерода. Репрессия синтеза ферментов, катализирующих последовательность реакции метаболического пути конечным продуктом, как это имеет место в случае ферментов синтеза гастидина или триптофана, называется репрессией конечным продуктом.
Это явление теория оперона объясняет следующим образом: при отсутствии в среде Гис или Три регуляторный белок-репрессор не имеет сродства к оператору и происходит синтез ферментов, осуществляющих образование этих аминокислот. Когда в среду добавляют, например, Гис, то эта небольшая молекула, получившая название”корепрессор”,присоединяется к белку-репрессору. В результате конформационных изменений в молекуле репрессора комплекс белка-репрессора и
корепрессора (Гис) приобретает сродство к оператору, присоединяется к нему, и транскрипция оперона прекращается, т.е. прекращается считывание информации о строении 10 ферментов, участвующих в синтезе этой аминокислоты .
Следует иметь в виду, что репрессия и индукция синтеза белков у прокариотов реализуют принципы адаптации к меняющимся условиям существования и клеточной экономии: ферменты появляются в клетках, когда в них существует потребность, и перестают вырабатываться, если потребность исчезает.
Биосинтез белков (трансляция). Генетический код
Перевод информации, заключённой
в полинуклеотидной последовательности мРНК, в аминокислотную последовательность белка требует определённого способа кодирования или шифрования, т.е. существования определённого закона, по которому чередование четырёх нуклеотидов в мРНК задаёт специфическую последовательность аминокислот в белке.
А. Генетический код и его свойства
Необходимость кодирования структуры белков в линейной последовательности нуклеотидов мРНК и ДНК продиктована тем, что в ходе трансляции:
нет соответствия между числом мономеров в матрице мРНК и продукте - синтезируемом белке;
отсутствует структурное сходство между мономерами РНК и белка.
Это исключает комплементарное взаимодействие между матрицей и продуктом - принцип, по которому осуществляется построение новых молекул ДНК и РНК в ходе
репликации и транскрипции.
Отсюда становится ясным, что должен существовать “словарь”, позволяющий выяснить, какая последовательность нуклеотидов мРНК обеспечивает включение в белок аминокислот в заданной последовательности. Этот “словарь” получил название генетического, биологического, нуклеотидного, или аминокислотного кода. Он позволяет шифровать аминокислоты, входящие в состав белков, с помощью определённой последовательности нуклеотидов в ДНК и мРНК. Для него характерны определённые свойства.
Триплетность.Смысл кодонов.Специфичность
Каждому кодону соответствует только одна определённая аминокислота. В этом смысле генетический код строго однозначен.
1 . Аминокислоты
Субстраты для синтеза белков
2. тРНК
тРНК выполняют функцию адаптеров. Они акцепторным концом взаимодействуют с аминокислотами, а антикодоном - с кодоном мРНК.
3. Аминоацил-тРНК синтетазы
Каждая аа-тРНК-синтетаза катализирует реакцию специфического связывания одной из 20 аминокислот с соответствующей тРНК
4.мРНК
Матрица содержит линейную последовательность кодонов, определяющих первичную структуру белков
5. Рибосомы
Рибонуклеопротеиновые субклеточные структуры, являющиеся местом синтеза белков
6. АТФ, ГТФ
Источники энергии
- Белковые факторы инициации, элонгации, терминации
Специфические внерибосомные белки, необходимые для процесса трансляции (12 факторов инициации: elF; 2 фактора элонгации: eEFl, eEF2, и факторы терминации: eRF) - Ионы магния
Кофактор, стабилизирующий структуру рибосом
Примечания:elF (eukaryotic initiation factors) - факторы инициации; eEF (eukaryotic elongation factors) - факторы элонгации; eRF (eukaryotic releasing factors) - факторы терминации.
Вырожденность
Линейность записи информации
Универсальность
Колинеарность гена и продукта
У прокариотов обнаружено линейное соответствие последовательности кодонов гена и последовательности аминокислот в белковом продукте, или, как говорят,
существует колинеарность гена и продукта.У эукариотов последовательности оснований в гене, колинеарные аминокислотной последовательности в белке, прерываются нитронами. Поэтому в эукариотических клетках аминокислотная последовательность белка колинеарна последовательности экзонов в гене или зрелой мРНК после посттранскригщионного удаления интронов.
Сборка полипептидной цепи
