Yeast Flashcards
Vad är Gene Ontology (GO)- termer? Förklara vilken användning man kan ha av dem då man analyserar innehållet i en grupp gener som man fått som resultatet av ett storskaligt försök.
GO är en databas med sammanställningar av information om gener och genprodukter. Det finns tre kategorier
Process (biological role) – cell division
Function (biochemical activity) – acetyl transferase
Component (physical location, cellular part, organelle) – mitochondrion
GO visar samband som finns mellan olika genprodukter. Ofta illustrerade i ”nät” som visar på interaktioner. T.ex. kan man få upp en lista med interaktioner där alla tillhör en viss pathway. Vi kan alltså få svar på frågor som hur gener är kopplade till varandra, varför de är det, vilken den gemensamma nämnaren är.
Du gör försök med S.cerevisiae för att hitta nya mutanter med defekter i protein lokalisering, och mutangeniserar därför en population. Bland dina mutanter hittar du förutom de önskade lokalisation mutanterna, två mutanter med röd färg. De två mutanterna är av var sin parningstid (den ena a den andra alpha) och du korsar dem. Den resulterade diploida har vit färg. Talar detta för att de två mutationerna sitter i samma gen eller olika gener?
Två olika gener. De båda parningstyperna är haploida. Eftersom de båda är röda fenotyper som haploida måste det betyda att generna kompletterar varandra som diploid, vilket leder till en vit koloni.
Schizosaccharomyces pombe är en utmärkt modellorganism om man vill studera fenomen som RNA-medierad interferens (RNAi), medan Saccharomyces cerevisiae inte fungerar bra i detta sammanhang. Varför?
A flavored laboratory model organism, the fission yeast S.pombe, is a unicellular eukaryote suitable for genetic analysis of this complex process, as its centromere structure and RNAi machinery resemble those in animals.
At centromeres, heterichromation formation is directed by RNA interference (RNAi) a natrually occurring process in the nucleus of eukaryotic cells that silences gene expression. RNAi during heterochromatin formation is an important step in the assembly of chromosome segregation machinery at mitosis.
Interaktion mellan två mutationer kan vara dels mellan två gener (intergenic), dels inom en och samma gen (intragenisk). Ge exempel på vilka relationer som kan finnas mellan de två mutationerna i de två olika fallen.
Tänker att detta är ex på funktioner. Med intragenic så gäller det inom samma gen, original mutationen kan alltså bli suppressad av en mutation i samma gen, medan intergenic är två gener men produkten av dessa gener interagerar och har direkt kontakt ex proteinkomplex. En mutation i annan gen Y kan därför suppressa originalmutationen i gen X
Ge exempel på en markör för vilken man kan selektera både för och emot uttryck. Förklara hur selektionsmekanismer fungerar i detta fall och ge ett exempel på varför det kan vara användbart att ha tillgång till både selektion och mot selektion för samma gen.
Ura3 (ceriviae)/Ura4 (promte)
En mutant gör cellen recessiv mot 5.FOA
Kan användas för selektion i syntetisk lethal screens → cellerna som är 5-FOA är de vi vill ha, eftersom de inte kunde göra sig av med plasmiden.
Kan emot selektera genom att odla transformerade celler för 5-FOA ifall plasmiden innehåller muterad gen för 5-FOA. Då är de celler som inte tagit upp plasmiden.
Ge två exempel på forskningsområden där schizosaccharomyces pombe har varit en framträdande modellorganism, och förklara vilka egenskaper hos denna organism som gör den mer lämplig än saccharomyces cerevisiae för just sådana studier.
SC har flera speciella anpassningar som inte gäller generellt för andra eukaryota celler. SP är mer lämplig modellorganism i det avseendet då den liknar andra eukaryota celler mer.
Studera cellcykeln. SP delar sig via klyvning, dvs delar sig symmetriskt medan SC delar sig via knoppning (budding yeast).
Största delen av cykeln består av G2/M fasen, medan hos SC är den större delen av cykeln G1/S.
Studera chromatin. SP har chromatin medan SC helt saknar detta.
Pombe är fördelaktig ifall man vill studera RNAi, eftersom SC inte använder av RNAi (DICER och RISC kodas inte alls i SC)
Vilken typ av information kan man få av det ”omvända” tvåhybridssystemet? Förklara hur det reguljära tvåhybridssystemet modifierats för att fungera som ”omvänt” system.
Tvåhybridssystemet är en genetisk metod att detektera protein-proteininteraktioner in vitro, som visar på under vilka betingelser som påverkar interaktionen. För att veta om det finns en interaktion används reporter genes. En plasmid transkriberar protein X, med DBD. En annan plasmid transkriberar protein Y, med AD. Om dessa protein interagerar med varandra kommer transkription av vår gen fortgå.
Reverse 2H-systemet används för att hitta ämnen som bryter interaktionerna mellan två proteiner. Om vi har en interaktion mellan protein X och Y, kan denna brytas m.h.a. t.ex. URA3/HIS3 som markör gen/reporter gene. (HIS3 gen= protein som katalyserar histidin produktion). Om vi har en interaktion mellan X och Y transkriberas URA3 och farlig produkt bildas -> ingen tillväxt.Om X ej interagerar med Y uttrycks ej genen, och tillväxt kan därför fortskrida.
Förklara vad som menas med den genetiska termen allelspecifik suppression. Om den ligger mellan två gener, vad säger det om vilken sorts interaktion som sker mellan de två generna? För en icke-allelspecifik suppression, ge exempel på vilken sorts mekanism som kan ligga bakom interaktionen.
Allel-specifik: Används för att studera interaktionen mellan två geners produkter som är relaterade till varandra, tex del av samma proteinkomplex/del av samma metabolic pathway.
Icke allel-specifik: Transkriptionsfaktorer sätter sig på en del av genomet och förhindrar transkription. Två gener som sitter på olika kromosomer påverkar varandra.
Förklara skillnaden mellan en genetisk suppressor som fungerar som a) allelspecifik och b) högkopiesuppressor. Ge ett exempel i vardera fallet på hur suppressionsmekanismen kan se ut.
Allelspecifik: Detta är en introgenisk suppression som påverkar proteinstrukturer, alltså är den känslig för mutationer.
Högkopiesuppressor: En mutation ger en försämrad ligandaffinitet för ett protein. Då kompenseras detta genom överuttryck av ett annat protein.
Förklara vad “forward genetics” resp. ”reverse genetics” innebär, och vilken typ av information man kan få ur det ena resp. det andra arbetssättet.
Forward genetics: Vi muterar organismer slumpvis, för vilka vi sedan vill hitta vilken gen som orsakar fenotypen vi får utav detta. Vi går från fenotyp till genotyp. Vi selekterar en viss fenotyp och isolerar den. Ourcross several times -> sequence genome compare to WT. Hitta gener ansvariga för specifika fenotypiska egenskaper.
Reverse genetics: Koppla en gen till en funktion/fenotyp. En specifik gen är modifierad för att se hur fenotypen/funktionen påverkas. Vi går från genotyp till genotyp. Här kan vi få reda på vad gener har för roll i organismen, t.ex resistens mot något, färg och utseende, nedbrytning av kolhydrater etc… Ofta använt med RNAi, CRISPR/Cas9, ZFN, TALEN…
Vilken egenskap hos S.C gör att det har varit en jämförelsevis snabb och effektiv process i denna organism att tillverka genomvida uppsättningar av mutanter som vardera har t.ex. en deletion eller en GFP-märkt kopia av en viss gen?
S.C har ett väldigt kompakt genom och få repeterade sekvenser. Det medför att den har effektivt kunnat byta ut gener sina gener med homolog rekombination (om vi tillsatt en transgen t.ex). De nya integrerade genernas funktioner har sedan kunnat studeras.
Vad är en “syntetisk fenotyp” och vilken slags information ger det om vi hittar en syntetisk fenotyp mellan två mutationer? Syntetisk fenotyp kan i jäst undersökas i stor (genomvid) skala. Hur går det till?
En syntetisk fenotyp refererar till en genetisk interaktion som innebär att en fenotyp som har en dödlig mutation kan räddas av en andra mutation och gör den livskraftig. Så när de två mutationerna kombineras överlever organismen. Mutation nummer 2 kan vara antingen loss eller gain of function. Om vi har hittat en sådan fenotyp vet vi att generna på något sätt interagerar med/påverkar varandra. Det är viktigt att börja med en mutation som ej är dödlig, men som ändrar fenotypen. Ibland görs detta m.h.a plasmider med olika gener som bildar olika fenotyper. Sedan får man kombinera plasmiden med olika kolonier genom att mutera dem. Beroende på vilka gener vi hade i plasmiden så kan vi selektera för de kombinationer där plasmiden var nödvändig för jästens överlevnad.
Två hybridsystemet i jäst används för att hitta protein-proteininteraktioner. I de fall det rör sig om membranprotein kan det konventionella två hybridsystemet ha problem och man kan då använda sk “SOS recruitment system” istället. Förklara hur “SOS recruit systemet” fungerar och varför det konventionella två hybridsystemet kan ha problem med membranbundna proteiner.
Så Ras-proteinet är ett signaleringsprotein, dvs det sätter igång en kedja av responser i cellen när det aktiveras. Och det aktiveras av ett GEF vilket sätter på en fosfatgrupp på det vilket gör att det blir GTP (=aktiverat) istället för GDP (=inaktiverat). CDC25 är ett sådant GEF, så vanligtvis i jäst så behövs både CDC25 och Ras-proteinet i cellmembranet för att en signal ska kunna skickas in i cellen. CDC25 kan dock ersättas av Sos, vilken är den mänskliga varianten, och processen kommer alltså att funka även när Sos och Ras-proteinet sitter i cellmembranet. Så det man gör är att man muterar CDC25 så att det inte fungerar vid höga temperaturer, men Sos kommer fortfarande fungera vid höga temperaturer. Det innebär att om signalen in i cellen sker vid hög temperatur så måste alltså Sos och Ras-proteinet sitta i cellmembranet. Det man vill ta reda på är om två olika protein interagerar i cellmembranet, så man sätter det ena proteinet på Sos och det andra på en signalmolekyl som alltid finns i membranet. Det är alltså endast om proteinet som sitter fast på Sos finns i cellmembranet som Sos kommer att föras till cellmembranet och därigenom aktivera Ras-proteinet vid en hög temperatur. Dvs, om signalen förs in i cellen (vilket man kan mäta) så visar det att proteinet som sitter fast på Sos finns i cellmembranet.
Vad är en essentiell gen? Förklara hur man kan använda ”plasmid shuffle” för att analysera funktionen hos essentiella gener.
En essentiell gen är en gen som är livsviktig för cellen och individens överlevnad.
Med plasmid shuffle kan man analysera hur essentiell en gen är samt hitta funktionella mutationer.
Hur man använder plasmid shuffle för att analysera funktionen hos essentiella gener:
Vi har en stam med ytg1, ode2, ura3, leu1 och tillsätter först en plasmid med wild type gener som räddar de icke-fungerade generna i genomet. Vi tillsätter därefter en plasmid med yfg** och leu1 som är muterade. Därefter odlar vi celler på 5-F0A samt låg halt adenin. Om cellen klarar sig utan wt-genen för YFG1 så kommer plasmiden med wt-gener att “shufflas” ut ur cellerna. Det blir då röda kolonierna eftersom de ej kan syntesera adenin. Vi har då en funktionell mutation. Om cellerna istället behöver YGF1 för att kunna överleva så kommer plasmiden med wt-gener att vara kvar. Dessa celler kommer att dö då de via URA3 kan producera enzymet odease som bryter ned 5-FOA till ett toxiskämne. Genen YFG1 är då essentiell för cellens överlevnad.
Vad innebär det genetiska begreppet syntetiska letalitet? Förklara översiktligt hur man kan studera syntetisk letalitet i stor skala. Vilken typ av information kan man få ur en storskalig studie av syntetisk letalitet?
Syntetisk letalitet (dödlighet) uppstår när en kombination av brister i två geners funktion leder till celldöd, vilket gör det möjligt att med läkemedel slå ut funktionen av den ena genen i celler där den andra redan är skadad.
Mutation in genes which lead to cell or organism death when occurring in combination with mutations in one or other genes.
