Mouse Flashcards
Förklara hur man kan inaktivera en gen i en viss vävnad (tex nervceller) hos möss vid en viss tidpunkt genom att injicera läkemedlet Tamoxifen.
I tamoxifens frånvaro kommer protein komplexet CreER(ER=
muterad östrogenreceptor som kan binda till tamoxifen) interagera med HSP90 och finnas i cytoplasman, dvs ingenting kommer att hända.
När tamoxifen, som är ett syntetiskt östrogen, tillsätts till cellen kommer den bryta interaktionen mellan CreER och HSP90. Tamoxifen binder till komplexet och förflyttar sig till kärnan, där Cre kommer att känna igen LoxP sites på vår floxade allel och rekombinera den. Där kommer vår gen att inaktiveras om vi önskar det.
Hela systemet kan göras vävnadsspecifik genom att använda en promotor som endast driver expression av vårt muterade komplex. Och vi kan även bestämma när vi vill att genen ska bli knockad, då vi endast behöver tillsätta tamoxifen för att det ska ske.
Vad är en floxad allel?
En allel som är förberedd för deletion genom introduktion av två loxP-sites kallas för en “floxad allel” (flanked by loxP sites)
Vad menas med “positions effekter” när man talar om fenotypen hos transgena möss?
Positionseffekter innebär att beroende på vart vår transgen integreras i musgenomet, kan effekten av den ge upphov till olika uttryck/förändringar av andra gener som i sin tur också påverkar musens fenotyp.
En mus transgen kan ha aktiverat/knockat andra gener som också bidrar till hur dess fenotyp ser ut. Till exempel kan transgenen blivit integrerad mitt i en befintlig gen, eller så kan transgenens starka promotor bidra till att andra gener uttrycks mer frekvent, vilket också skulle ge upphov till att fenotypen förändras beroende på vart den integreras och vilka andra gener som påverkas av dess integrering.
Transgenkonstruktion
En transgen konstruktion baserat i allmänhet på cDNA (DNA-kopia av mRNA) istället för genomiskt DNA (reducerar storlek med i genomsnitt 90%). Konstruktionen är modulär dvs promotor och kodade sekvensen kan bytas ut oberoende av varandra. Kodande sekvenser bestämmer vad som uttrycks, promotor när, var och hur mycket.
Splicing av transkript förbättrar uttrycket av transgenen och därför inkluderas ofta ett litet intron. Intronet placeras uppströms (5’) om kodande sekvens för att undvika ”nonsense - mediated decay”. PCR- primers som flankerar ett splice - site möjliggör genotypering utan interferens från endogen genomisk gensekvens (om man uttrycker gen som redan finns genomet).
Nackdel med transgener
Eftersom integrering i musgenomet är slumpmässig finns det flera saker som kan gå fel.
Integrering av transgenen kan råka slå ut (”knocka”) en befintlig gen.
Integrering av transgenen kan råka aktivera en befintlig gen med sin starka promotor/ enhancer
Transgenen kan integreras i heterokromatin och därför inte uttryckas alls.
Transgenen kan råka hamna nära en stark enhancer och därför komma att uttryckas i fel vävnad,
eller vid fel tidpunkt.
Samtliga ovanstående är exempel på ” positionseffekter ”, alltså att fenotypen delvis bestäms av platsen
som transgenen integrerat.
Lösningen består i att analysera flera transgena linjer och förvissa sig om att fenotypen är
konsekvent, innan man väljer ut en linje att arbeta med.
Varför gör man transgener?
Grundforskning
Proteinproduktion (mus bara i utvecklingsstadiet)
Sjukdomsmodeller (t ex cancer eller metabolism)
Humanisering (skapa mer relevanta försöksdjur ur human synvinkel, eller t ex immunisering för att
ta fram humana monoklonala antikroppar)
Skapa verktyg för revers genetik (markörer, Cre - drivers, Flp - möss m m)
Inducerbara transgener
Om man vill kunna bestämma själv när transgenen ska uttryckas gör man en inducerba transgen.
Det finns flera inducerbara system. Alla bygger på samma princip: Två transgener - en som uttrycker en
konstgjord transkriptionsfaktor vars bindnings - site inte förekommer naturligt i musgenomet och
vars DNA - bindning kan slås av och på med en liten ligand , och en som uttrycker GOI under en syntetisk
promotor innehållande bindningsställen för denna transkriptionsfaktor. Genom att korsa dessa båda
transgena linjer får man möss där uttryck av GOI kan styras av liganden.
Tet- off
I Tet - Off har man lånat genen för repressorn i Tet - operonet från E coli och gjort en fusion med en
transkriptionell aktiverings domän från ett viralt protein (VP16). Detta kodar för en eukaryot
transkription aktivator som binder till Tet- operatorn och vars DNA - bindning inhiberas av tetracyklin
(eller doxycyklin). GOI placeras under kontroll av en promotor med multipla Tet - operatorer.
Expressionen av GOI kan nu stängas av genom att ge museet tetracyklin.
Tet -On
I Tet-On har repressorn från Tet-operonet muterats så att DNA-bindningen nu
reagerar tvärtom på bindning av tetracyklin, d v s proteinet binder operatorn
när tetracyklin finns närvarande, men släpper annars. I övrigt är allt samma som
i Tet-Off. Uttryck av GOI kan nu induceras genom att ge musen tetracyklin.
Vad är LoxP-Cre rekombination
Vid knockout kommer alla genkopior i alla celler i den nya individen vara utslagna.
Om man vill slå ut gener vid en viss tidpunkt under ett djurs utveckling eller i en viss typ av vävnad kan man använda sig av loxP-Cre rekombination.
Cre proteinet kommer rekombinera genren och dess funktion blir disturbed.
Vilket enzym katalyserar rekombination mellan loxP-sekvenser och till vad används detta rekombinationssystem huvudsakligen inom mus genetiken?
Sekvensen mellan de två loxP-siterna rekombineras bort mha ett rekombinant enzym Cre. Genom att uttrycka Cre från en transgen som är vävnadsspecifik kan vi snacka vår gen i en speciell celltyp, men låta den fortsätta fungera i alla andra. Eller knocka vid en tidpunkt som vi väljer genom att uttrycka Cre från en inducerbar transgen.
Vad avgör var i musgenomet en transgenkonstruktion integreras vid pronucleär injektion?
Det är slumpen som avgör var. Vi kan ej bestämma hur många kopior som integreras och inte heller kontrollera var det sker. Detta är en av nackdelarna med pronuklär injektion.
Oftast görs transgener genom pronukleär injektion, men kan också göras med samma teknik(homolog rekombination) som ”knock-ins”. Med pronukleär injektion kan vi ej avgöra var i musgenomet produkten integreras, eller hur många kopior(Två nyfödda transgener kan därför skilja sig åt fenotypiskt). Det är alltså slumpen som avgör. Men, vi kan även använda oss av CRISPR/Cas9 eller TALEN för att generera ett dubbelsträngsbrott som förenklar cellens förmåga att laga DNA:t med NHEJ, med vår introducerade transgen som mall, och då vet vi exakt vart det integreras.
Vad erbjuer CRISPR/Cas9?
CRISPR/Cas9 erbjuder möjligheter att inducera dubbelsträngsbrott på specifika platser i genomet.
CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) är bakteriernas motsvarighet till vårt adaptiva immunsystem. Från varje virus som bakterien stött på (och överlevt) sparar bakterien en ca 20 nt lång DNA sekvens (sk spacer), vilket stoppas in i bakterien genomet inför en CRISPR- repetition.
Vad är skillnaden mellan CRISPR/Cas9 och TALEN?
Det krävs mindre förarbete jämfört med TALEN.
Istället för att kräva konstruktion av en hemmasnickrad gen (Som kodar för en TALEN) som kan klonas i plasmid, sekvens verifieras etc räcker det med CRISPR beställa ett syntetisk guide-RNA (eller en oligonukleotid som agerar mall för gRNA-transkription).
CRISPR/Cas9 tekniken har på kort tid revolutionerat reversgenetiska experiment på möss. Om du redan gjort en CRISPR-modifiering av embryonala mus-stamceller, och således har alla reagens(celler etc som krävdes för detta), vad behöver du ändra på/konstruera/köpa om du bestämmer dig för att göra en annan modifiering av samma celler? Motivera och förklara!
När vi använder CRISPR/Cas9 metoden i laboratoriemiljö använder vi oss av gRNA som bildar ett komplex med Cas9-proteinet, gRNA är sekvens specifik och kommer ”leda vägen” åt Cas9. Vi behöver alltså köpa/konstruera ett nytt gRNA som är sekvens specifik till den nya genen vi vill modifiera. Förmodligen så finns det gRNA att beställa till de flesta gener i musgenomet.
