Wykłd 5 Flashcards
Jakie są cechy charakterystyczne tratw błonowych?
Są małe (10-200 nm), heterogenne i wysoce dynamiczne, trudne do bezpośredniego obserwowania.
Czym są DRMy?
DRMy (detergent-resistant membranes) to błony komórkowe lub ich fragmenty, które są nierozpuszczalne w określonych detergentach w danych warunkach i mogą być używane jako przybliżenie biochemiczne tratw błonowych.
Jak izoluje się DRMy z komórek?
Lizuje się komórki, inkubuje z detergentami, a następnie frakcjonuje na gradiencie gęstości sacharozy poprzez wirowanie izopektyczne; DRMy flotują ze względu na niższą gęstość.
Czy izolacja DRM jest bezpośrednią metodą obserwacji tratw błonowych?
Nie, izolacja DRM jest jedynie biochemicznym przybliżeniem tratw błonowych, a nie ich bezpośrednią obserwacją.
Jaki wpływ na tratwy błonowe ma obniżenie poziomu cholesterolu?
Obniżenie poziomu cholesterolu powoduje zmiany w parametrach fizykochemicznych tratw lipidowych, wpływając na ich formowanie i stabilność.
Jakie są problemy w interpretacji wyników izolacji DRM?
Różne detergenty (np. Triton X-100, CHAPS, Tween) powodują izolację różnych frakcji DRM, co utrudnia jednoznaczną interpretację wyników badań.
Jakie techniki mogą być dodatkowo stosowane do analizy tratw błonowych oprócz izolacji DRM?
Można stosować techniki mikroskopowe wysokiej rozdzielczości (np. mikroskopię fluorescencyjną wysokiej rozdzielczości), FRAP, FRET czy techniki spektroskopowe.
Dlaczego tratwy błonowe trudno badać bezpośrednio?
Ze względu na ich niewielki rozmiar (10-200 nm), dużą dynamikę oraz potrzebę bardzo wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej.
Jakie detergenty są typowo wykorzystywane do izolacji DRM?
Najczęściej stosowane detergenty to Triton X-100, Brij 96V, CHAPS, Tween 20, Pluronic F-127 oraz cholan sodu.
Co jest ważnym czynnikiem decydującym o izolacji określonych frakcji DRM?
Ważne są warunki inkubacji (np. temperatura, stężenie detergentu), które wpływają na selektywność izolowanych frakcji.
Jakie fazy lipidowe wyróżnia się w badaniach tratw błonowych?
Wyróżnia się fazę uporządkowaną (Lo – lipid ordered) oraz fazę nieuporządkowaną (Ld – lipid disordered), obie te fazy są ciekłe.
Jakie modele błonowe są używane do badania tratw lipidowych?
Używa się GUV (giant unilamellar vesicles), GPMV (giant plasma membrane vesicles) oraz SLB (supported lipid bilayers).
Jakie fluorofory są stosowane do obserwacji faz Ld i Lo?
Fluorescencyjne analogi lipidów takie jak DiO, DiI, DiD mają wysoki współczynnik podziału między fazami Ld i Lo, lokalizując się głównie w fazie nieuporządkowanej (Ld).
Które składniki lokalizują się w fazie uporządkowanej (Lo)?
W fazie uporządkowanej lokalizują się białka z kotwicą GPI, cholesterol oraz glikolipidy.
Co mierzy sonda fluorescencyjna typu flipper?
Sonda flipper mierzy stopień uporządkowania błony oraz naprężenie mechaniczne (zmiana ciśnienia), które powodują zmianę jej emisji (przesunięcie widma fluorescencji).
Do czego używane są sondy Laurdan oraz di-4 ANEPPDHQ?
Sondy Laurdan oraz di-4 ANEPPDHQ używane są do mierzenia GP (generalised polarisation), co pozwala ocenić stopień uporządkowania błony lipidowej.
Co oznacza parametr GP mierzony sondą Laurdan?
Parametr GP (generalised polarisation) wskazuje różnice w środowisku lipidowym między fazą uporządkowaną (Lo) i nieuporządkowaną (Ld), bazując na zmianach intensywności emisji fluorescencji przy różnych długościach fal.
Jakie informacje daje technika FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)?
Technika FLIM umożliwia pomiar czasów życia fluorescencji sond (np. di-4 ANEPP), co pozwala na precyzyjne wykrywanie domen lipidowych, w tym tratw lipidowych.
Jak wpływa usunięcie cholesterolu na obraz FLIM sondy di-4 ANEPP?
Usunięcie cholesterolu znacząco zmniejsza czasy życia fluorescencji sondy, co powoduje zanik uporządkowanych domen (tratw lipidowych) i zwiększa niejednorodność błony.
Czym się różni technika FLIM od klasycznej mikroskopii konfokalnej (LSM) w analizie tratw błonowych?
Technika FLIM pozwala na precyzyjniejsze odróżnienie domen błonowych na podstawie różnic w czasach życia fluorescencji, podczas gdy LSM bazuje na intensywności fluorescencji, dając mniej szczegółowy obraz.
Co oznacza dyfuzja rotacyjna lipidów i w jakim zachodzi czasie?
Obrót cząsteczek wokół własnej osi, zachodzi w nanosekundach (10⁻⁸ s).
W jakim czasie zachodzi dyfuzja lateralna lipidów?
Od nanosekund do mikrosekund (10⁻⁷ s).
Co oznacza flip-flop w błonach lipidowych i jak długo trwa?
Dyfuzja transwersalna lipidów między warstwami błony, trwa od milisekund do godzin (10⁻³ - 10⁴ s).
Jak definiujemy parametr uporządkowania (S)?
Jako miarę orientacji cząsteczki względem płaszczyzny błony.
