Western Blotting etapa 1 Flashcards
é um método em biologia molecular/bioquímica para detectar proteínas em um homogenato (células trituradas) ou em um extrato de um tecido biológico. Essa técnica utiliza eletroforese em gel para separar as proteínas desnaturadas por massa (comprimento do polipeptídeo). As proteínas são transferidas do gel para uma membrana (tipicamente de nitrocelulose ou de PVDF), onde serão utilizados como sonda, anticorpos específicos à proteína a ser estudada.
Etapa 1
Proteínas antigênicas em detergente para serem desnaturados e solubilizadas no detergente.
Etapa 2
Proteínas são inseridas no gel SDS em uma cuba para serem separadas por tamanho, em migração, eletroforética, após migração, o gel é retirado e colocado em outro equipamento
etapa 3
passa pra membrana nitrocelulose, que é mais fácil de trabalhar, é melhor de ser trabalhada, passar as proteínas pra lá, que será lavada, e colocamos ela com um tampão de bloqueio com proteínas inertes (por exemplo leite ou psa)
Etapa 4
O anticorpo vai ser marcado, irá se ligar aos antígenos específicos, e não com membrana bloqueada.
Etapa 5
fluocromo, queima, e vamos ver relação do antígeno com o anticorpo.
Ligação do anticorpo
A ligação do anticorpo será detectada por quimioluminescência
Pra quê serve essa técnica?
para a imunodetecção de proteínas após sua separação por eletroforese em gel e transferência de um extrato proteico para uma membrana adsorvente.
