von Ballmoos Flashcards
Aromatische Aminosäuren
+ Absorption
Phenylalanine < Tyrosine < Tryptophan
Protein in nativer Form
Funktional
Korrekte Sekundärstruktur, korrekte Tertiärstruktur (Faltung), korrekter Einbau von Co-Faktoren, korrekter Ausbau von Disulfidbrücken
Dafür nötig korrekte Umgebungsbedingungen (Salz, pH, Lipide usw.), korrekte Temperatur, Zeit, Chaperone usw.
Protein in denaturierter Form
Funktion wieder herstellbar
Aggregiertes Protein
Nicht zwingend nicht funktionell, Gegenteil von löslich
Proteinquellen aus dem Labor
90% Bakterien
9% Hefe
1% Eukaryotische Zellkultur
Vor- und Nachteile Bakterienkultur als Proteinquelle
Vorteile:
- Wachsen schnell, grosse Mengen möglich (kg)
- Wachstumsmedium billig
- Starke Überexpression von Proteinen möglich
Nachteile:
- Eukaryotische Proteine exprimieren oft nicht
- Keine Glykosylierung möglich (Ausnahme C. jejuni)
Vor- und Nachteile Hefe als Proteinquelle
Vorteil:
• v.a. für eukaryotische Proteine
Nachteil:
• Sehr schwer aufzubrechen
Vor- und Nachteile Eukaryotische Zellkulturen als Proteinquelle
Vorteile:
- Grosse Proteinkomplexe können synthetisiert werden
- Glykosylierung möglich
Nachteile:
- Kleine Mengen (g) (heute nicht mehr ein solches Problem)
- Teuer
- langsam
Rekombinante Proteinexpression in E. coli
- Man generiert die DNA des Proteins via PCR
- Mittels molekularbiologischen Methoden wird das PCR Produkt (Gen) in einen Expressionsvektor gebracht
- Dieser Vektor wird dann in kompetente E.coliZellen transformiert
- Aufgrund Antibiotikaresistenz (auf dem Vektor) werden dann die Zellen selektiert, die das Plasmid aufgenommen haben.
- Diese Zellen werden im grossen Massstab vermehrt, und die Proteinsynthese u. U. durch Induktion noch gesteigert
- Danach werden die Zellen geerntet und daraus das Protein gewonnen
Reinigungsstrategie für intrazelluläre Proteine
- Zelldisruption
- Abtrennung von unlöslichem Material
- Resultat: Lipide, Proteasen, grosse Proteinmengen
- Chromatographische Techniken
Reinigungsstrategie für inclusion bodies
- Zelldisruption
- Abtrennung von unlöslichem Material
- Isolierung, Renaturierung
- Renaturierungsprobleme, niedrige Ionenstärke
- Chromatographische Techniken
–> Zelle merkt nicht, was sie exprimiert hat
Reinigungsstrategie für extrazelluläre Proteine
- Zellabtrennung
- Abtrennung von unlöslichem Material
- Resultat: verdünnt, geringe Proteinmengen
- Chromatographische Techniken
Verschiedene Arten des Zellaufschluss & was danach?
Mechanisch, Ultraschall, Osmolyse, Enzyme
Nach dem Zellaufschluss wird zentrifugiert (low spin, ca. 8000 x g)
–> Zellextrakt
Mechanischer Zellaufschluss
- schwache Scherkräfte (Sieb): empfindliche Zellen
- Hohe Scherkräfte Kugelmühlen (Bakterien, Hefen)
- French Press: Durchpressen durch enge Öffnung (< 1 mm)
- Hochdruckhomogenisator
- Zerreiben im Mörser: getrocknete Pflanzenzellen, Bakterien, Hefen (nur robuste Zellen, keine Eukaryotischen)
- Durch enges Loch gepresst, reissen sich Zellen gegenseitig auf
Ultraschall Zellaufschluss
- Starke Druckänderung bei 10 –40 kHz
- Nicht geeignet, wenn DNA benötigt
Osmolyse Zellaufschluss
Zerplatzen durch osmotischen Druck:
- Zellen ohne Zellwand
- einfliessen von Wasser (bei Blutzellen: Hämolyse)
- Zellen mit Zellwand: zuerst Lysozym
Enzyme Zellaufschluss
- Zellwandabbau: zB. Lysozym
- Lyse von Polysacchariden in Bakterienzellwänden
Differentielle Zentrifugation
in Wasser
Trennung von Partikeln verschiedener Grösse und Dichten
- Zellkerne (600 x g)
- Zellen (1’000 x g)
- Plasmamembran (1’500 x)
- Mitochondrien, inclusionbodies(10’000 x g)
- Bakterielle Membranen (100000-150000 x g)
- Viren, kleine Zellorganellen (Mikrosomen), Liposomen (100’000-300’000 x g)
–> Alles oder Nichts Technik (Trennvermögen 2)
Methoden zum Entfernen von Salz/kleinen Molekülen
Verdünnen mit Wasser/Puffer
Dialyse
Ultrafiltration (semipermeable Membran)
Chromatographie
Dialyse
- Volumen bleibt ungefähr gleich
- Dialysemembran (semipermeable Membran)
- MW-Ausschlussgrenze (MW-cut-off)
- Dialysemembrane bis 500 kDa möglich, aber sehr brüchig und langsam, am besten funktioniert es bis 50 kDa
Ultrafiltration (semipermeable Membran)
- Einengen
- Aufkonzentrieren
- unter Druck
- Zentrifugation
- Funktioniert recht gut bis 100 kDa
Chromatographische Trennmethoden
- Affinitätschromatographie
- Ionenaustauschchromatographie (IEC, IEX)
- Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)
- Ausschlusschromatographie / Gelfiltration (SEC)
- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
Membranproteine
- Sind Türen und Fenster der Zellen
- Ionenpumpen (Redox oder ATP getrieben, H+, Na+, Ca2+, K+)
- Kommunikation zwischen Zellen, Kompartimenten (Rezeptoren, Nährstoffaufnahme)
- Transport zwischen Kompartimenten (mitochondriale Carrier Proteine, z.B. ADP/ATP transporter)
- 20-30% aller sequenzierter ORFs sind für Membranproteine
- >50% aller modernen Medikamente zielen auf Membranproteine
- Nur ca. 900 einzigartige 3D Strukturen bekannt (>100’000 lösliche Proteine)
- Membranen sind dicht gepackt mit Membranproteinen, bis zu 25% in Fläche und > 50% Gewicht.
Detergenzien
z.B. Spülmittel
amphipatische/amphiphile Moleküle, haben einen polaren und einen apolaren Teil
löslich in Wasser, ab gewisser Konzentration (CMC) lagern sich zusammen zu Micelle
kationisch / anionisch: meistens denaturierend
nicht ionisch: weniger denaturierend
zwitterionisch: teilweise denaturierend
Proteinsolubilisierung
- Um ein Membranprotein zu solubilisieren (in Lösung zu halten), muss die Konzentration oberhalb der CMC liegen.
- Wichtig ist auch das Verhältnis zwischen Protein und Detergenz (es muss genügend Detergenzmoleküle pro Protein haben).
- Um ein Protein aus der nativen Membran zu holen, braucht es noch viel mehr Detergenz, um auch alle Lipide zu solubilisieren (Lipid/Detergenz Verhältnis).
Grunsätze im Umgang mit Detergenzien
- Kurzkettige Detergenzien solubilisieren die Membran besser, sind allerdings auch eher denaturierend –> hohe CMC
- Oft werden verschiedene Detergenzien eingesetzt, ein kurzkettiges zum Solubilisieren und ein langkettiges zum Aufbewahren
- Detergenzien müssen immer oberhalb der CMC gebraucht werden, um ein Protein in Lösung zu halten
- Jedes Protein hat sein bevorzugtes Detergenz, es ist unmöglich, das ideale Detergenz im Voraus zu bestimmen
Techniken um Detergenz zu entfernen/auszutauschen
- Verdünnen unter CMC
- Dialyse, wenn die Micelle < 30 kDa ist
- Protein an Säule binden, Detergenz wegwaschen
- Binden von Detergenz an adsorbierende Materialien (z.B. Bio Beads)
Weiter nach Zellextrakt/Membranextrakt
- Bestimmen der Totalproteinkonzentration (>99 % ist nicht das gesuchte Protein)
- Fällung/Dichtezentrifugation als erster Schritt
- Weitere Anreicherung des gesuchten Proteins mithilfe von chromatographischen Trennmethoden
- Reine Darstellung mittels Gelfiltration
- Enzymaktivität
Methoden zur Proteinbestimmung
Aminosäureanalyse
Kolorimetrisch (Färben)
Spektroskopisch
Radioaktive Markierung
Kolorimetrische Färbemethoden
- Biuret-Assay
- Lowry-Assay (1951)
- Bicinchoninsäure (BCA)-Assay / Smith-Assay (1985)
- Bradford-Assay (1976)
Spektroskopische Proteinbestimmungsmethoden
- UV-Detektion
- Fluoreszenz
BCA-Assay / Smith-Assay
Basis: Biuret-Reaktion
- Umsetzung mit Bicinchoninsäure (BCA)
- Bildung Cu+-BCA-Komplex
- In alkalischer Lösung reduzieren Proteine Cu2+ zu Cu+
- proportional zur Proteinmenge (Tyr, Trp, Cys beschleunigen)
- Detektion photometrisch: 562 nm
Lambert-Beer Gesetz
A = log (I0/I) = ε * c * d
A: Absorption
I0 / I: Intensität eintretendes Licht / Intensität austretendes Licht
d: Schichtdicke [mm]
ε: molarer Extinktionskoeffizient [L / mol · mm]
c: Konzentration [mol / L]
bei 280 nm (A280): Trp, Tyr, (Phe, bei A254)
Reinigungsstrategie Proteine
Kein allgemein gültiges Reinigungsschema für Proteine (im Gegensatz zu DNA / RNA)
verschiedene physikalisch/chemische Parameter berücksichtigen
–> oft grosse Konzentrationsunterschiede der Komponenten
Entfernung von Matrixkomponenten (Zellkomponenten)
–> Zentrifugation, Ultrafiltration, Fällung
Hauptreinigung / Fraktionierung
- Chromatographie
- Elektrophorese
- andere Methoden
- schnell: möglichst wenige Reinigungsschritte
- effizient: hohe Ausbeute
- selektiv: gesuchte Komponente möglichst rein
- schonend: im nativen Zustand, biologisch aktiv
- -> möglichst keine Aufarbeitungsartefakte
Chromatographie Begriffe:
Analyt
Substanzgemisch
Chromatographie Begriffe:
Mobile Phase
Laufmittel, oft Lösungsmittelgemisch
Chromatographie Begriffe:
Stationäre Phase
Füllmaterial der Trennsäule
Chromatographie Begriffe:
Trägermaterialien
Physikalische / chemische Stabilität
- Biopolymere: Cellulose, Dextran, Agarose
- Synthetische Polymere: Polyacrylamid, Polymethacrylate, Polystyrole
- Anorganische Polymere: Kieselsäure, Hydroxyapaptit, poröse Glaskügelchen
- Funktionelle Gruppe: chromatographischer Trennmodus
Chromatographie allgemein
Trennung gelöstes Substanzgemisch im Gas- oder Flüssigkeitsstrom über stationärer Phase
Analyt interagiert mit stationäre Phase
Chromatographie:
Bodenzahl n
Trennqualität der chromatographischen Säule
je höher die Bodenzahl n desto besser die Trennung bei gegebener Säulenlange L
Chromatographie:
Theoretische Bodenhöhe
h = L / n
Bei gegebener Säulenlänge L sollte die Bodenhöhe h minimal sein, um eine maximale Trennung (hohes n) zu erhalten.
In der Praxis bessere Trennung durch:
Änderung der mobilen Phase, Änderung der stationären Phase, Verwendung längere Säule
Chromatographie:
Einfluss der Flussrate
Die aufzutrennenden Moleküle interagieren mit der stationären Phase und diffundieren in der mobilen Phase. Dies kann zu Peakverbreiterung führen und damit zu einer Reduktion der Bodenzahl n und einer schlechteren Auflösung führen.
Chromatographie:
Faustregel zur Flussraten
Für kleinere Moleküle sollte die Flussrate maximal gewählt werden, damit die Diffusion minimal ist, eine Wechselwirkung mit der stationären Phase gibt es hingegen nicht.
Für Proteine (grosse Moleküle) ist die Diffusion in der mobilen Phase vernachlässigbar, aber die Wechselwirkung mit der stationären Phase nimmt mit zunehmender Flussrate zu.
–> Es gilt also eine ideale Flussrate zu finden
Affinitätschromatographie
- Biospezifität
- Metallchelat-Affinitätschromatographie
Prinzip: spezifische, reversible Adsorption an Matrix
Einige Säulen mit bestimmten Liganden sind kommerziell erhältlich. Andere müssen selbst an den Säulensupport gekoppelt werden.
- KD: 10-5 - 10-7: biospezifische Wechselwirkung
- KD: > 10-5: Bindung zu schwach
- KD: < 10-8: Bindung zu stark: Desorption nur denaturierend
Ionenaustauschchromatographie
• Ladung
pI: Isoelektrischer Punkt (IEP): pH-Wert Nettoladung Protein null
Coulomb-Gesetz
Kleine Partikel (~10 μm, mehr Oberfläche pro cm Säule) geben eine bessere Auflösung, verlangen aber höhere Drücke –> spezielle Apparatur
Kann zu jedem Zeitpunkt der Reinigung angewandt werden, entsprechend werden aber verschiedene Säulen mit verschiedenen Partikelgrössen verwendet
Man kann IEX auch so durchführen, dass das gewünschte Protein nicht bindet, dafür aber viele andere. Keine Aufkonzentrierung!
Hydrophobe Interaktionschromatographie
• Hydrophobizität
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
High Pressure/Performance Liquid Chromatography, HPLC
Umkehrphase (Reverse(d)-Phase, RP), RP-HPLC
- Trenn-Prinzip: vor allem Hydrophobe Wechselwirkung
- Ionenpaarreagens(z): z.B. Trifluoressigsäure(TFA)
- Zur Auftrennung von polaren/ionischen Molekülen, oft grösser als 500 Da. Mild und rasch, geeignet für thermisch instabile und leicht zersetzliche Substanzen.
Stationäre Phase: modifiziertes Kieselgel
Elutrope Reihe
Affinitätschromatographie:
Absorbent für: Lecitin
Glykoproteine
Affinitätschromatographie:
Absorbent für: Heparin
Proteine der Blutgerinnung
Affinitätschromatographie:
Absorbent für: Protein A / Protein G
Immunoblobuline G
Affinitätschromatographie:
Absorbent für: Calmodulin
Ca2+-bindende Proteine
Affinitätschromatographie:
Absorbent für: Nucleotide
Dehydrogenasen, Kinasen
Affinitätschromatographie:
Absorbent für: Cibacron Blue, andere Dyes (Farbstoffe)
Viele Enzmye, komplex
Affinitätschromatographie:
Absorbent für: Antikörper
Antigen
Affinitätschromatographie:
Absorbent für: Enzyminhibitoren
Enzym
Affinitätschromatographie:
Absorbent für: Hormon
Rezeptor
Affinitätschromatographie:
Absorbent für: Gluthation
GST-fusion protein
Affinitätschromatographie:
Absorbent für: Avidin/Streptavidin
Biotin/Streptag
Affinitätschromatographie:
Absorbent für: Maltose
MBP-fusion protein
Schritte der Affinitätschromatographie
Adsorption (Selektiv aus komplexem Gemisch)
Waschen (Entfernen unspezifisch gebundene Komponenten)
Desorption (Kompetitive Verdrängung gebundene Komponente(n))
Regeneration (Reinigung / Regeneration Matrix)
Metallchelat-Affinitätschromatographie
Ni2+-NTA-Agarose
Elution mit Histidin, Imidazol oder EDTA
6-10 Histidine werden auf DNA Ebene am N- oder C-terminus ans Protein angefügt (selten auch in Loop- Regionen) und das Protein danach exprimiert.
–> His-Tag
Der Extrakt nach dem Zellaufschluss (nach Zentrifugation) wird dann direkt auf die Säule gegeben, gewaschen und eluiert.
Statt NTA könne auch andere Säuren verwendet werden.
Statt Ni2+ wird auch Co2+ verwendet.
Vor- und Nachteile Affinitätschromatographie
Vorteile:
- Spezifische Interaktion, unter Umständen «One-step purification» möglich
- Einfacher Ablauf: Laden, waschen, eluieren!
- Bei rekombinanten Proteinen kann ein His-Tag hinzugefügt werden
Nachteile:
- Nicht für alle Proteine möglich
- Oft ist der Bindungspartner teuer oder kompliziert herzustellen –> keine kommerzielle Lösung
- Herstellen einer eigenen Affinitätsmatrix kann aufwändig sein
- Entfernen des Eluenten kann aufwändig sein
Coulomb-Gesetz
Ecoul = (q+ * q-) / (ε0 * εr * r)
q+, q-; Ladungen
r: Abstand der Ladungen
ε0: elektrische Feldkonstante
εr: Medium abhängige Konstante
Schritte der Ionenaustauschchromatographie
Adsorption: Bindung der geladenen Teilchen an Matrix
Elution (Verdrängung):
• Steigender Salzgehalt: Erhöhung der Ionenstärke
• Elution mittels pH-Gradient: Verschiebung pH-Wert
Regeneration: Reinigung / Regeneration Matrix
Vor- und Nachteile Ionenaustauschchromatographie
Vorteile
- Mit allen Proteinen möglich, auch Membranprotein, kein Affinitäts-Tag nötig.
- Bei jeder Reinigungsstufe möglich, kompatibel mit Detergenzien
- (Semi)-spezifische Bindung mittels Ladungen (vor allem schwache Tauscher)
- Ausgangsmaterial kann verdünnt sein, es wird an der Säule aufkonzentriert.
- Relativ billig
Nachteile
- Unter Umständen relativ geringe Trennung
- Grosse Säulen notwendig, wenn viel Ausgangsmaterial vorhanden ist
- Austesten für optimale Auflösung kann langwierig sein
Protein in Lösung interagieren mit:
- Wasser
- Salz
- Anderen Proteinen, DNA
- Ev. Detergenz
- Andere kleine Moleküle
Ausschlusschromatographie / Gelfiltration
Size Exclusion Chromatography, SEC
• Grösse, Form, hydrodynamisches Volumen
- *wässrig**: Gelfiltration
- *nicht-wässrig**: Gelpermeation
Moleküle >> Poren: Elution Ausschlussvolumen V0
Moleküle ≅ Poren: Elutionsvolumen VM (Summe internes Porenvolumen + Partikelzwischenraum)
Moleküle << Poren: längste Aufenthaltsdauer in Poren, in den Poren frei beweglich
Meist am Schluss einer Reinigung verwendet, wenn das Protein schon relativ rein ist.
Trennparameter von Ausschlusschromatographie / Gelfiltration
- Trenngel (Porengrösse)
- Lösungsmittel / Puffer
- pH-Wert
- Probenvolumen
- Säulendimension
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie:
Elutrope Reihe
Elutionskraft = Abnahme Polarität –>
Wasser –> Methanol –> Acetonitril –> n-Propanol –> Tetrahydrofuran
<– Zunahme Polarität
Aufbau einer HPLC
- Entgasen der Lösungsmittel ist wichtig, damit keine Luft in die Säule gelangt. Gerade bei hohen Drücken würde jegliches Gas freigesetzt.
- Pumpe sollte nicht pulsieren –> gleichmässiger Fluss, stabile Detektion
- Geringes Totvolumen des ganzen Systems –> schneller Gradientenaufbau
- Die Säule ist temperaturkontrolliert, weil das Bindeverhalten der Moleküle temperaturabhängig ist und dadurch die Trennleistung beeinflussen kann.
- Druckstabilität (bis 400 bar)
- Verschiedene Detektoren möglich: Absorption (UV, VIS, IR), Fluoreszenz, Brechungsindex, Lichtstreuung, Elektrochemie, Massenspektrometrie
Elektrophorese
Wanderung eines geladenen Teilchens im elektrischen Feld
Beschleunigende Kraft Fe und Bremsende Kraft, Reibungskraft Ffr im Gleichgewicht: keine Beschleunigung, konstante Geschwindigkeit!
Wanderungsgeschwindigkeit / Elektrophoretische Mobilität u
Beschleunigende Kraft Fe
Fe = q * E
mit q = z * e
E: elektrische Feldstärke
q: Ladung Teilchen
e: Elementarladung
z: Anzahl Ladungen
Bremsende Kraft, Reibungskraft Ffr
Ffr = f * v
f: Reibungskoeffizient
v: Wanderungsgeschwindigkeit geladenes Teilchen
Wanderungsgeschwindigkeit v / Elektrophoretische Mobilität u
v = q * E / f = u * E
mit u = q / f
v: Wanderungsgeschwindigkeit geladenes Teilchen
q: Ladung Teilchenf Reibungskoeffizient
E: elektrische Feldstärke
u: elektrophoretische Mobilität
Polyacrylamid Gel
- Für Proteine wird meist eine Mischung von 29:1 Acrylamid/Bis verwendet (3.3 % crosslinking).
- Für Peptide oder DNA Sequenzierung wird mit 19:1 (5% Crosslinking) gemacht
Gelelektrophoresesysteme
Puffer mit pH > 7. Dadurch sind die meisten Protein negativgeladen und wandern zur Anode.
Disk-Elektrophorese
• Sammelgel (weitporig):
Isotachophorese: pH 6.8 –> inhomogener Puffer
Leit-Ion: Chlorid Folge-Ion: Glycin (IEP: 5.97)
-Gleiche Mobilität aller Moleküle. Bildung von Stapeln von Proteinen:
–> Stacking-Effekt
• Trenngel (engporig):
Zonenelektrophorese: pH 8.8 –> homogener Puffer
- unterschiedliche Mobilitäten: Trennung nach Grösse
SDS-PAGE (Polyacrylamidgelelektrophorese)
Diskontinuierliche Elektrophorese
- SDS (Sodium Dodecyl / Lauryl Sulfate): anionisches Detergens
- denaturiert und linerarisiert Protein (erhitzen auf 95 °C)
- bildet lineare Micellen konstanter negativer Ladung
- bindet ca. 1.4 g SDS / g Protein
- CMCSDS: 8 mM
- Genauigkeit: ca. 5 –10 %
- Je länger das Protein, desto mehr SDS kann gebunden werden, dadurch ist die relative Ladung (m/z) oder Geschwindigkeit im elektrischen Feld etwa gleich und aufgetrennt wird nach Grösse, weil lange Stücke im Gel mehr zurückgehalten werden als kurze.
- SDS bindet vor allem hydrophobe Stellen –> Membranproteine haben daher mehr relatives SDS als lösliche Proteine –> wandern «zu schnell», bzw. zeigen ein zu kleines Molekulargewicht.
Blue Native Gel-elektrophorese
für Membranproteine
Statt SDS wird Coomassie verwendet, welches sich auch ans Protein anlagert, es dabei aber nicht denaturiert
Auftrennung von Komplexen in Mitochondrialen Membranen –> Komplex I
Isoelektrische Fokussierung (IEF)
D: Diffusionskoeffizient
E: Feldstärke
d(pH)/dx: pH-Gradient
ΔpI: Auflösungsvermögen
du/d(pH): Mobilitätssteigung Protein am pI
2D-Gelelektrophorese
Trennung nach Ladung und Grösse
Es können ganze Lysate aufgetrennt werden. Interessant auch für Viren und Bakterien und Zellen, welche verschieden behandelt wurden. Durch einfaches Vergleichen der Proteinpunkte (Spots) können Unterschiede in der Proteinexpression festgestellt werden.
Das volle Potential der 2D Elektrophorese wird dann zusammen mit massen-spektrometischer Analyse genutzt.
- *1. Dimension: Nach Ladung**
- isoelektrischeFokussierung
- immobilisierter pH-Gradient (pH-Gradient wählbar)
- Trennung auf IPG-Streifen
- *2. Dimension: Nach Grösse**
- SDS-PAGE
Elektroblotting
- DNA: Southern-Blotting (1975: E. Southern)
- RNA: Northern-Blotting
- Proteine: Western-Blotting (Immunodetektion, blot staining, Edman sequencing)
Membrane für Western Blots
Blotting-Membranen:
• Nitrocellulose (NC)
• Polyvinylidendifluorid (PVDF)
• Polypropylen (PP)
• Silikonisierte Glasfasern (SGF)
Detektionsysteme für Westernblots
Immunodetektion
Warum sollte/muss man Proteine modifizieren?
Klassisch: Aminosäuren haben funktionelle Gruppen, die häufig die Aktivität des Proteins beeinflussen. Durch Modifikation der funktionellen Gruppe wird die Aktivität geblockt und das aktive Zentrum kann identifiziert werden.
Proteinmodifikation / Proteinspaltung
- NMR Analyse, Einbau von 2H, 13C, 15N, durch Zugabe ins Medium
- Einführung von Reportergruppen zur späteren Analyse: Fluoreszenzmarker, Biotin, Spinlabel, orthogonale Gruppe (Click Chemistry), etc.
- Vernetzung von Proteinen, photocrosslinking
- Affinitätslabeling
Chemische Modifikationen von Aminosäureseitenketten
Proteine tragen funktionelle Gruppen
(selektiv) modifizierbar:
- basisch: Lys, Arg, His
- sauer: Asp, Glu
- aromatisch: Tyr, Trp, Phe
- S-haltig: Cys, Cys–Cys, Met
>90% aller Modifikationen werden an Lysinen und Cysteinen durchgeführt!!
Chemische Modifikationen von Lysin
Aminogruppe
Acylierung, Amidierung
- Reaktion benötigt ein primäres Amin (deprotoniert), also einen pH > pKa Lysine (~10.5). Ist nicht möglich, da denaturierend –> deshalb pH so hoch als möglich. Problem, die Reagenzien sind instabil bei hohem pH.
- –>Spezialfall: N-terminus (pKa ~8). Diese Aminogruppe kann spezifisch bei pH 7.5 gelabelt werden.
Acylierung
positive Ladung geht verloren
Amidierung
positive Ladung geht nicht verloren
Disulfidbrücken Oxidation
Disulfidbrücken Reduktion
Cystein-Modifikation
um Kanal zu identifizieren
- Reaktion benötigt ein reduziertes Cysteinzur Reaktion mit Alkylhalidenoder Maleimiden. Zur Reduktion können DTT oder Mercaptoethanol eingesetzt werden, die aber vor der Reaktion wieder entfernt werden müssen. Besser ist das TCEP!
- Das Thiolat-Anion (pK~8.3) ist reaktiver als die Thiolform, allerdings sind die Reagenzien bei hohem pH instabil. Kompromiss liegt bei ungefähr pH 7-7.5.
- Labeling von Cystein ist selektiv, bei gutem pH durchführbar und zeigt wenig Seitenreaktionen. Oftmals wurde das Cystein via ortsgerichteter Mutagenese eingeführt.
Vernetzung von Proteinen mittels bifunktionaler Linker
Koppeln zwischen Lysinen:
Dissulfidbrücke, Spaltbar mit DTT, Mercaptoethanol, TCEP
Koppeln zwischen Cystein und Lysinen:
Dissulfidbrücke, Spaltbar mit DTT, Mercaptoethanol, TCEP
Bioorthogonal ligation chemistry
Click chemistry
Refers to any chemical reaction that can occur in the presence of other rich chemical functionalities found in biological systems without interacting or interfering with native biochemical processes.
The bioorthogonally-activated components react specifically and spontaneously only with eacht other forming the desired conjugate.
Fluoreszenz
Es gibt Hunderte von Fluoreszenzfarbstoffen mit den verschiedensten Eigenschaften:
• Verschiedene Farben
• Reaktivität auf pH, Ionenstärke
• Reaktivität auf Umgebung (polar, apolar)
Detektion: Westernblot, Mikroskopie, Spektroskopie
Proteincharakterisierung: Proteinspaltung
Chemische Fragmentierung
Spaltung mit Cyanogenbromid (CNBr) nach Met
Allgemeine Bedingungen für Enzyme-Proteolyse
(vollständige und limitierte)
- *vollständige Proteolyse**: 4 – 16 h, 37°C
- Peptidmuster (finger prints, peptide maps)
- *limitierte Proteolyse**: kürzere Spaltzeiten (min → h)
- in der Regel native Proteine
- Generierung Domänen (funktionell aktiv)
- Generierung Cys-haltiger Fragmente: Disulfidbrückenmuster
- *Enzym / Substrat-Verhältnis:**
- Spaltung in Lösung: 1:20 bis 1:100
- Spaltung im Gel / auf Membran: 1:1 bis 1:10 (Autoproteolyse möglich)
- unspezifische Spaltungen möglich
Aminosäureanalyse (ASA):
Quantifizierung
- Gehalts- / Mengenbestimmung von Proteinen / Peptiden
⇒ Saure Hydrolyse erforderlich
⇒ Analyse ist probenunabhängig (fest, flüssig, gasförmig) - Quantitative Bestimmung freier Aminosäuren in Lösung
Aminosäureanalyse (ASA):
AS-Zusammensetzung
- Jedes Protein hat charakteristisches AS-Muster (Fingerabdruck)
- Identifizierung von Proteinen in Proteindatenbank mit AS-Muster
Aminosäureanalyse (ASA):
Klinik
AS-Muster freier AS: Erkennung von Krankheiten
Aminosäureanalyse (ASA):
Saure Hydrolyse
Bedingungen: 6 M HCl, 110°C, 24h, N2 (Vakuum)
Hydrolyse: Flüssig oder gasförmig
- Ser, Thr, Met: 10 – 20% Verlust
- Cys, Trp: 50 – 100% zerstört
- Cys: Alkylierung zur Quantifizierung, z.B. Iodacetamid
- Asn, Gln, CAM-Cys: Deaminierung zu Asp, Glu, CM-Cys
- Ile – Val, Val – Val, Ile – Ile: Bindungen hydrophobe AS
⇒ in 24 h unvollständig hydrolysiert
Aminosäuren sichtbar machen
- Ninhydrin (klassisch)
- Absorption / Fluoreszenz (modern)
- Aminogruppe wird gelabelt
Methode nach Sanger
Identifikation N-terminale AS in Proteinen / Peptiden
- Markierung N-terminale AS mit Sangers Reagens DNFB (Dinitrofluorobenzol)
- Anschliessend saure Hydrolyse des Proteins
- Identifikationder N-terminalen AS UND der Aminosäuren-zusammensetzung.
- Immer nur die N-terminale Aminosäure kann detektiert werden. –> Vorgängige partielle Spaltung.
- Kompliziert, braucht extrem viel Protein, muss mehrfach repetiert werden –> Nobelpreis 1958 für die Sequenzierung von Insulin (~100 g).
Sequenzanalyse nach Edman 1
Kupplung
Abtrennen von überschüssigem Reagens und Nebenprodukten durch Extraktion in org. Lösungsmittel. Protein bleibt gefällt.
Sequenzanalyse nach Edman 2
Spaltung
Extraktion der ATZ-Aminosäure durch org. Lösungsmittel. Restpeptid wird getrocknet und vorbereite für nächste Spaltung.
Kein O2 erlaubt, N2 Atmosphäre
Sequenzanalyse nach Edman 3
Konversion
z.B. ATZ-Aminosäure + Wasser zu PCT-Aminosäure + H+ zu PTH-Aminosäure + Wasser
Proteinsequenator
(Schema + Probleme)
- Probe muss einheitlichen N-terminus haben –> Gelbande –> Blot
- N-terminus darf nicht blockiert sein
- Ultra reine Lösungsmittel nötig
- Gewisse AS werden während der Konversion zerstört
- Schlechte Zyklen Ausbeute macht Interpretation schwierig. Nur im ersten Run gibt es nur eine Aminosäure.
- Max. 30-60 Aminosäuren möglich
Bioanalytik:
ESI-MS, MALDI-MS
Genaue MassevonBiopolymeren: > ±0.01%
Reinheitsprüfung von Biopolymeren
Sequenz von Peptiden, Oligonukleotiden, Oligosacchariden
Analyse von posttranslationalen Modifikationen (PTMs)
- Disulfidbrücken: in den meisten Proteinen vorhanden
- Glykosylierungen: viele Proteine sind glykosyliert
- Phosphorylierungen: Signalübertragung, Aktivierung
- N-terminale Modifikationen: ca. 10% aller Proteine
Komponenten Massenspektrometer
Matrix-unterstützte Laserdesorptions / Ionisations-MS
MALDI-MS
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation
- *UV-Laser:**
- Stickstoff-Laser (337 nm)
- Nd-YAG-Laser (355, 266 nm)
IR-Laser:
- Er-YAG-Laser (2,94μm)
YAG: Yttrium-Aluminium-Granat-Kristalle
MALDI-Prozess: Prinzip
Mehrere Teilprozesse
- Desorption der Analytmoleküle aus einer Matrix mittels Laserpuls
- intensiver, kurzwelliger Laserpuls (normalerweise nur einige ns)
- Einkopplung der Energie, oft über ein π-Elektronensystem
- Explosionsartiger Phasenübergang
- Matrix- und Analytmoleküle in die Gasphase
- Übertragung der Ladung (H+/Na+/K+) von der Matrix auf den Analyten
- ohne Zerstörung thermisch labiler Moleküle
- z.B. Proteine, Peptide, Oligonukleotide, DNA, RNA, Polysaccharide
Matrix im grossen molaren Überschuss (1’000–10‘000 fach)
Massenanalysator MALDI
Flugzeitanalysator: TOF-Analysator (Time of Flight)
⇒ MALDI-TOF
Beschleunigungsstrecke:
Ionen im elektrischen Feld auf einige keV beschleunigt
Feldfreie Driftstrecke (Flugrohr): 1–4 m
Ionen gleicher kinetischer Energie nach m/z Verhältnis getrennt
Flugzeit: einige μs – einige 100 μs
Flugzeitmassenspektrometer
Lineares Flugrohr:
Ionen haben Unschärfe bezüglich Energie, Ort, Zeit –> Delayed extraction
Reflektor-Flugrohr:
Reflektor (“Ionenspiegel”), m1 = m2, E1 < E2
Isotopenverteilung
- *Durchschnittsmasse (averag emass):**
- Berücksichtigung der prozentualen Verteilung aller Isotope
- *monoisotopische Masse (monoisotopic mass):**
- exakte Masse des jeweils häufigsten Isotops
- *nominelle Masse (nominal mass):**
- ganzzahlige Masse des jeweils häufigsten Isotops
Elektrospray-Ionisation (ESI)
- *Elektrospray**:
- Dispersion einer Flüssigkeit in viele kleine, geladene Tröpfchen mit Hilfe eines elektrischen Feldes
- *Desolvatisierung**:
- Transfer von Ionen aus der Lösung in die Gasphase
Elektrospray-Ionisation (ESI):
Sprayprozess
1) Bildung kleiner geladener Teilchen eines Elektrolyten
2) Lösungsmittelverlust durch Verdampfen
⇒ Ladungsdichte an der Tröpfchenoberfläche nimmt zu
3) Mehrfacher spontaner Zerfall der Tröpfchen in Mikrotröpfchen
⇒ Coulomb-Explosion
4) Desolvatisierung der Analytmoleküle beim Transfer ins MS
⇒ Entzug thermischer Energie beim Verdampfen
Elektrospray-Ionisation (ESI):
Rayleigh Limit
Stabilitätsgrenze der Tröpfchen
Gleichgewicht von:
Coulomb-Abstossung gleicher Ladungen im Tröpfchen Oberflächenspannung des Lösungsmittels im Tröpfchen
Quadrupolmassenfilter
Kombination von Wechselspannung und Gleichspannung an den Stäben
- Gleichspannung: U
- Wechselspannung: V * cos 2π * f * t
- Frequenz: f
- Radius: r
U und V werden so gewählt, dass nur ein einziges m/z durch den Massenfilter fliegt, alle anderen werden von den Stäben so abgelenkt, dass sie kollidieren und abgebremst werden.
–> Es muss ein Scan durchgeführt werden.
Proteinidentifikation druch tryptischen Verdau
Proteom-Analyse
Tandem MS oder MS/MS
Membrangradienten
dienen als Energiespeicher
The chemical equilibrium between two compartments is the preferred state (lowest energy).
After work is performed, the system is in a non-equilibrium state. Hereby, the membrane prevents re-equilibration and the energy (of the work) is stored in form of a chemical and/or electrical gradient.
When the system returns to the equilibrium, the stored energy can be used to perform (a different type of) work.
Acht grosse Kategorien von Biologischen Lipiden
Extraktion von Lipiden
Phospholipide
Membranproteine
- Ionen Pumpen (Redox or ATP getrieben, H+, Na+, Ca2+, K+) –> primäre Transporter
- Kommunikationen zwischen Kompartimenten (Rezeptoren, Nährstoffaufnahme, sekundäre Transporter)
- Transport zwischen Kompartimenten (z.B. mitochondriale Carrier Proteine, e.g. ADP/ATP Exchanger)
- Membran-Verankerungsproteine
Untersuchen eines Membranproteins
Um Transport Prozesse zu untersuchen, braucht es ein abgeschlossenes Kompartiment, welches durch eine Membran abgetrennt ist.
Milde Tour: ROS-Membranvesikel
Grobe Tour: ISO-Membranvesikel
ISO-Membranvesikel
Inside out (Inverted vesicles)
- Zellen werden in Aufschlusspuffer gewaschen und mittels French Press aufgeschlossen (Auch Ultraschall)
- Membranen werden aufgebrochen und schliessen sich wieder, dabei ändert sich die Orientierung.
- Äussere Membran kann entfernt werden (Dichtegradient)
- Zellinneres wurde ausgetauscht durch Aufschlusspuffer
Liposomen
Liposomen formen sich spontan, wenn eine getrocknete Lipidschicht (gelöst in organischen Lösungsmitteln) mit Puffer hydratisiert wird
- -> Minuten bis Stunden, eventuell erwärmen
- -> Wird das einigermassen mild gemacht, entstehen sogenannte Multilamellare Vesikel (MLV) –> Drug Transport
Von MLV (Multilamellare Vesikel) zu SUV (unilamellare, kleine Vesikel) und LUV (grosse unilamellare Vesikel)
• Ultraschallbehandlung: Dadurch werden aus MLV SUV, ca. 30 –80 nm.
• Wiederholtes Gefrieren in flüssigen Stickstoff und Auftauen bei 25°C
–> es entstehen LUV, >400 nm
• Die LUV können dann durch Pressen durch eine Membran (Extrusion) auf die gewünschte Grösse gebracht werden, z.B. 100, 200 nm.
Rekonstitution (Inkorporation) von gereinigtem Protein in Liposomen
3 Methoden
JEDES PROTEIN BRAUCHT EIGENES PROTOKOLL !!
Methode 1: Solubilisierte Lipide werden mit dem solubilisiertenProtein gemischt. Beim Entfernen des Detergenz entstehen Liposomen, die (hoffentlich) Protein enthalten.
• Verdünnen –> Die Suspension wird rasch soweit verdünnt, bis die Konzentration des Detergenz deutlich unter der CMC liegt. (~min. 20-fache Verdünnung). –> Detergenzien mit hoher CMC: Octylglucoside, CHAPS, Na-Cholate
• Dialyse –> Die Protein/Lipid Suspension wird in einen Dialyse Schlauch gegeben, und dieser wird gegen einen Puffer ohne Detergenz dialysiert. Porenweite der Membrane >> als Micellengrösse. –> Detergenzien mit hoher CMC: Octylglucoside, CHAPS, Na-cholate
• Adsorption der Detergenzmolekülean feste Matrix (Bio-Beads), dauert Stunden, aber funktioniert auch mit Detergenzien mit tiefer CMC: DDM, Triton X-100, aber auch Octylglucoside, CHAPS, cholate
Methode 2: Vorgefertigte Liposomen werden nur «destabilisiert» mit Detergenz, welches anschliessend entfernt wird. Gelfiltration, Bio-Beads, Dialyse.
Methode 3: Ohne Detergenz, klappt erstaunlich oft. Vorgefertigte Liposomen werden mit Protein in Detergenz gemischt –> Beim Mischen muss die Konzentration des Detergenz unter die CMC fallen. Danach wird die Suspension in flüssigem Stickstoff gefroren und langsam aufgetaut (1 –3 x) und kurz sonifiziert. Beim Auftauen werden die Liposomen destabilisiert und erlauben die Aufnahme des Membranproteins.
Proteoliposomen
ATP Synthasein Liposomen
ATP Hydrolyse wird gemessen
Vor- und Nachteile Liposomen
Vorteile:
• Definiertes System
• Keine anderen Enzyme
• Lipidmischung kann gewählt werden
• Nur ein Enzym pro Liposom möglich
• Mutanten mit geringer Aktivität können untersucht werden (kein Background)
Nachteile:
• Tiefes Protein/Lipid Verhältnis
• Mögliche falsche Orientierung des Proteins im Liposom.
• Co-Rekonstitution von mehreren Proteinen ist schwierig, da individuelle Protokolle nötig
• Oft verliert das Protein seine Aktivität während des Handlings (Detergenz, etc)
Drei Transportmöglichkeiten für Proteine
Natürlicher Mechanismus: Die Aufnahme muss energetisiert/angetrieben werden (deshalb sekundärer Transport)
Influx: Kann passieren, wenn die Zelle in ein laktosereichesMedium gelangt –> dauert aber nicht lange
Efflux: Kann passieren, wenn die mit Lactoseangereicherte Zelle in ein Medium ohne Lactose gelangt.
Valinomycin
selektiver K+-Ionophor
Makrolid-Antibiotika
wird von Streptomyceten (Bakterien) produziert
Es lagert sich in den hydrophoben Teil der Membran an und katalysiert dort den Austausch von K+-Ionen.
Generation einesMembranpotentialsin Liposomen
durch K+/Valinomycin Diffusionspotential
