Stocker Flashcards
Elektromagnetische Strahlung
Energieart
wird mit hoher Geschwindigkeit durch den Raum übertragen (auch im Vakuum)
Für uns leicht wahrnehmbar sind Licht und Strahlungswärme.
Für uns weniger einfach wahrnehmbar sind Mikrowellen, Radiowellen, UV-Licht, Gamma- und Röntgenstrahlen.
Viele Eigenschaften elektromagnetischer Strahlung lassen sich durch das klassische Wellenmodell beschreiben.
Anderes Modell zum erklären ist das Teilchenmodell.
Wellenmodell
versagt, wenn Phänomene wie Absorption oder Emission von Strahlungsenergie beschrieben werden sollen
Teilchenmodell
erklärt Elektromagnetische Strahlung als ein aus Energie bestehenden Strom diskreter Partikel
Polarisation des Lichts
Polarisierte ultraviolette und sichtbare Strahlung erhält man, wenn man Strahlung durch Medien passieren lässt, die selektiv in einer Ebene schwingende Strahlung absorbieren, reflektieren oder brechen.
Ausbreitungsgeschwindigkeit des Lichts
c = νλ c = 2.998 10<sup>8</sup> m/s (Vakuum)
Geschwindigkeit des Lichts in Materie ist abhängig von seiner Wellenlänge:
vi= νλi
vi = Ausbreitungsgeschwindigkeit
Die Frequenz ν ist Medium-unabhängig!
Brechungsindex eines Mediums
Mass für dessen Wechselwirkung mit Strahlung, und somit abhängig von der Wellenlänge:
ni = c/vi
c = 2.998 10<sup>8</sup> m/s (Vakuum) v<sub>i</sub> = Ausbreitungsgeschwindigkeit
photoelektrischer Effekt
„äusserer“ Photoeffekt: H. Hertz u. W. Hallwachs 1887
Sie beobachteten die Aufladung einer Metallplatte auf eine positive Spannung, wenn ihre Oberfläche mit kurzwelligem Licht bestrahlt wird.
Die elektrische Aufladung der Platte wurde richtigerweise zurückgeführt auf die Abgabe negativer Ladungen.
Auf Grund der klassischen Wellentheorie des Lichts ist dieser Effekt nicht verständlich.
Photonen
Max Planck (1900): Austausch von Energie zwischen Materie und Strahlung geschieht in Quanten oder Energiepacketen.
Einstein (1905): Elektromagnetische Strahlung besteht aus Partikeln-Photonen.
Energie eines Photons:
E = hν
h: 6.63 10-34 Js (Plancksches Wirkungsquantum)
ν: Frequenz der Strahlung
Licht
transversale elektromagnetische Welle
νλ = c = 2.998 108 m/s (Vakuum)
Energie E = mc2 = hν = hc/λ (Einstein)
h: 6.63 10-34 Js (Plancksches Wirkungsquantum)
Intensität I = const |E|2 (Amplitudenquadrat) = Anzahl Lichtquanten pro Fläche und Zeit
Spektroskopie
Die Interaktion von Materie mit Licht wird u.a. bestimmt durch die spezifischen physikochemischen Eigenschaften der untersuchten Materie
UV/VIS Spektroskopie
UV/VIS Spektroskopie
Zweistrahl Spektrometer
Wechselwirkung von elektromagnetischer Strahlung mit Materie:
Die Lichtabsorption ist das Ergebnis der Dipolwechselwirkung zwischen dem elektrischen Vektor des einfallenden Lichtes und der Elektronenhülle des Moleküls. Spektraler Bereich: 10 – 2000 nm
Energie E = hν = hc/λ = (1239.8/λnm) x eV (Einstein-Bohr-Gleichung)
Schema eines conventional single-beam spectrophotometer
Aufbau eines Zweistrahl - UV/VIS - Spektrometers
Schema eines Diode-Array Spectrophotometer
Lambert-Beerschen Gesetz
E = log(I0/I) = ε * c * d
E: Absorption (Extinktion)
I0: Lichtintensität
ε: dekadischer Extinktionskoeffizient [M-1 cm-1]
c: Konzentration [M]
d: Schichtdicke [cm]
Absorption
Wenn der Lichtstrahl den Chromophor eines (Bio)-Moleküls durchdringt, kann bei diesem Vorgang Licht absorbiert werden. Die Menge des absorbierten Lichts ist abhängig von der Wellenlänge.
Elektrisches Dipolmoment
Chromophore besitzen eine bestimmte räumliche Ladungsverteilung und damit ein permanentes elektrisches Dipolmoment:
allgemein gilt: μ = q * l
1 D = 3.33 · 10-30 C*m
Elektronischer Grundzustand und angeregter Zustand verfügen jeweils über ein elektrisches Dipolmoment, welche sich voneinander unterscheiden, wenn die Ladungsverteilung in beiden Zuständen unterschiedlich ist.
Spinauswahlregel
ΔS=0; M=2S+1
Erhaltung der Multiplizität:
Normalerweise ändert sich der Spin des Elektrons während des Übergangs nicht
Ueberlappungsregel
Δl = ±1
Änderung der Nebenquantenzahl l
l Kennzeichnet Bahndrehimpuls des Elektrons, gibt die Form des Orbitals in einem Molekül an. Übergänge sind nur erlaubt für Δl = ±1
Stehen die betreffenden Orbitale senkrecht zueinander ist ein Uebergang verboten, d.h. immer dann wenn keine räumliche Ueberlappung der Orbitale vorliegt.
Uebergang n <–> π* verboten!
Übergänge der Art s <–> p, p <–> d, d <–> f erlaubt
Paritätsregel
Verbot von Uebergängen gleicher Parität:
Bei Molekülen mit Symmetriezentren sind Übergänge zwischen Wellen funktionen gleicher Parität (d. h. gleicher Symmetrieeigenschaften der Wellenfunktionen bezüglich des Symmetriezentrums) unwahrscheinlich (Laporte-Regel). Erleichtert werden solche Übergänge dann, wenn die Molekülsymmetrie durch Schwingung des Moleküls etwas verringert wird d.h. durch unsymmetrische Gerüstschwingungen werden vibronische Übergänge beobachtbar.
Verboten: Übergänge zwischen d-Orbitalen bei Metallkomplexen
Oszillatorstärke
Ein Maß für die Wahrscheinlichkeit eines elektronischen Überganges (zwischen Grund- und Angeregtem Zustand) ist die zugehörige Oszillatorstärke fG,A (dimensionslos).
Elektronische Übergänge
Durch die Wechselwirkung des elektrischen Vektors des Lichtes mit
der Elektronenhülle des Moleküls kommt es zu einer Veränderung der
Wellenfunktion. Da ein solcher elektronischer Übergang (ca. 10-15 s) sehr viel schneller stattfindet als eine Kernschwingung (10-13 bis 10-11 s) liegt zunächst noch dieselbe Kernkonfiguration (r0) vor wie im Grundzustand.
Durch einen elektronischen Übergang liegen nun ungepaarte
Elektronen vor.
Jablonski-Thermschema zur Veranschaulichung der Elektronenübergänge
Franck-Condon-Prinzip
Gemäß dem Franck-Condon-Prinzip erfolgt ein senkrechter (vertikaler) elektronischer Übergang zu demjenigen Schwingungszustand der genau darüber liegt.
Intensität hängt von Überlappung der Schwingungsfunktionen ab (Phase).
Aus der Häufigkeit der Übergänge zwischen diskreten vibronischen Zuständen erklärt sich die Feinstruktur der Absorptionsbanden.
Chromophor
absorbierende Gruppe (nicht gesättigt)
Auxochrom
Saturierte Gruppe (OH, NH2), welche selbst nicht absorbiert, aber Absorptionsmaximum und Extinktionskoeffizienten ändert
Bathochrom
Rotverschiebung
Hypsochrom
Blauverschiebung
Hyperchrom
Erhöhung von ε
Intensität: ε (Uebergangswahrscheinlichkeit)
Hypochrom
Erniedrigung von ε
Intensität: ε (Uebergangswahrscheinlichkeit)
Isosbestischer Punkt
λi, bei der verschiedene Spezies denselben Extinktionkoeffizienten εi besitzen
Lage: λ (Energie)
Intensität: ε (Uebergangswahrscheinlichkeit)
Lumineszenz
Abgabe der Energie eines angeregten Zustandes als Licht beim Übergang in den Grundzustand. „kaltes Leuchten“
Biolumineszenz
chemische Reaktionen in lebenden Organismen bei denen Licht erzeugt wird
z.B. bei Glühwürmchen (Luciferase)
In Tiefseeorganismen und Quallen durch GFP, PYP (Fluoreszenz)
Fluoreszenz
Übergang zwischen Zuständen gleicher Spinmultiplizität
Im angeregten Zustand verliert das Molekül durch Energieübertragung auf
Kernschwingungen oder durch Kollisionen mit Lösungsmittelmolekülen Energie. Durch diese Strahlungslose Relaxation (SR) wird der jeweils energieärmste Schwingszustand eines Anregungsniveaus erreicht. Der Übergang in Niveaus anderer elektronischer Zustände erfolgt durch die ebenfalls strahlungslose Internal Conversion (IC). IC und SR laufen auf
einer Zeitskala von ca. 10-11 bis 10-13 s ab, während die Fluoreszenz im Bereich von ca. 10-8 s stattfindet. Die Emission selbst ist mit 10-15 s genauso schnell wie die Absorption.
Frank-Condon-Prinzip
(Singulett –> Singulett)
Frank-Condon-Prinzip
„vertikaler“ Uebergang auf vibronisch bevorzugte Banden des elektronischen Grundzustands.
Fluoreszenzemissionsspektrum
Erscheint (in der Regel) spiegelbildlich und bathochrom verschoben zum Absorptionsspektrum (Stoke‘scher Shift).
Falls die 00 Übergänge der Absorption und Fluoreszenz zusammenfallen, besitzt das Molekül im angeregten Zustand dieselbe Geometrie wie im Grundzustand.
Das Spektrum des emittierten Lichts ist unabhängig von der Anregungswellenlänge.
Fluoreszenz Umgebungseinflüsse
Erhöhung der Quantenausbeute durch Bindung = Immobilisierung (z.B. Ethidiumbromid)
Erniedrigung der Quantenausbeute durch Quenchen (O2, Jod, Acrylamid)
–> Faltungsstudien: Trp-Fluoreszenz, Anregung oft bei 295 nm
–> Ligand-Bindungsstudien
Singulett-Singulett Energietransfer (FRET)
Quenchen eines Donors durch Energietransfer (auf Deutsch „Förster Energietransfer)
Dipol-Dipol-Wechselwirkung
Proportional zu R-6
qualitative Messung: Emission konstant halten bei λ4, Anregung variieren von λ3 bis nach λ1 (im Fall eines Donors, zusätzlicher Peak bei λ1!)
Anwendungen:
• Abstandsmessung
• Quantitative real-time PCR (RT-PCR), Detektion und Quantifizierung kleinster Mengen von RNA/DNA
Tools for visualizing Gene Expression
GFP: green fluorescent protein (509 nm) problems: toxicity, fluorophore maturation, stability
DsRed, DsRed2: red fluorescent protein (590-620nm)
YFP: yellow fluorescent protein (530nm) - Thr203Aromat
CFP: cyan fluorescent protein (490 nm) – Tyr66Trp
Stimulated Emission Depletion (STED)
Im Jahr 1873 hatte Ernst Abbe entdeckt, dass Lichtmikroskope zwei Objekte nicht mehr voneinander unterscheiden können, sobald ihr Abstand kleiner ist als die halbe Lichtwellenlänge, also etwa 200 Nanometer.
Doch Stefan Hell, Eric Betzig und William Moerner fanden Wege Abbe‘s Gesetz zu umgehen, durch die Entwicklung der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie.
–> Methode heisst STED
Fluoreszenzpolarisation
Photoselektion von Molekülen durch selektive Absorption des polarisiert eingestrahlten Lichts.
Emittiertes Licht ist teilweise depolarisiert aufgrund der senkrechten Komponente von μfi in x,y-Ebene
Polarisation p und Anisotropie a
Depolarisation aufgrund von Rotationsbewegung (zeitabhängig) der Moleküle –> Abfall der Anisotropie/Polarisation
Anwendungen:
• Anthraniloyl-Chymotrypsin
• Calmodulin +/- Ca2+
• Ser/Thr-Kinase Assay
Chiroptische Methoden
Zirkulardichroismus
Optische Rotationsdispersion
Optische Rotationsdispersion
Folge der unterschiedlichen Brechungsindizes einer chiralen Substanz für linear polarisiertes Licht.
Messgröße: Drehwinkel αλ von linear polarisierten Licht.
Drehung der Schwingungsebene von planarpolarisiertem Licht abhängig von λ!
Brechungsindex n = c0/c >= 1
(c0 = Lichtgeschwindigkeit im Vakuum)
Drehung αλ = 1800 d/λ * (nL – nR)
Spezifische Drehung [α]λ = αλ/(cmd),
cm: g cm-3; d: dm
Molare Rotation [αM]λ = [α]λ Mr/100
Kurve der optischen Rotationsdispersion gibt den Drehwert einer Substanz in Abhängigkeit zur Wellenlänge des linear polarisierten Lichtes an.
Betrag des Drehwertes wird bei normaler ORD mit zunehmender Wellenlänge immer kleiner, d.h monotoner Verlauf der ORD-Kurve
bei Lichtabsorption resultiert eine anormale ORD – Kurve: positiver / negativer Cotton - Effekt (positiv zuerst minus, dann plus und negativ umgekehrt)
Zirkulardichroismus
Unterschiedliche Extinktionskoeffizienten einer optisch aktiven Substanz für links und rechts zirkular-polarisiertes Licht
Δε = εLinks - εRechts
Cotton-Effekt II (positiv & negativ, nur in eine Richtung Peak)
Messgrösse: Elliptizität Θλ von zircular polarisiertem Licht
Was ermöglichen Chiroptische Verfahren?
Unterscheidung von Enantiomeren und die Bestimmung der Helikalität
Methoden zur Bestimmung von KD
Gleichgewichtsdialyse
Spektroskopie
Gel Shift
Surface Plasmon Resonance (SPR)
Prinzipien Surface Plasmon Resonance (SPR)
Totalreflektion eines Lichtstrahls an der Grenzfläche Glas-Wasser (verschiedene Brechungsindizes). Wenn das Glas mit Gold beschichtet ist, ist die Reflektion nicht total.
Bei bestimmter Wellenlänge und bestimmtem Einfallswinkel kommt es zur Resonanz zwischen Photonen und Metallelektronen –> Energietransfer
–> Entstehung eines PLASMONS, einer Gruppe angeregter Elektronen. Diese Plasmonen kreieren ein „evanescent field“, eine elektrisches Feld welches 300 nm ins wässrige Medium reicht. Dieses Feld hängt von den Oberflächeneigenschaften ab.
–> Abschwächung des reflektierten Lichts
Der SPR-Winkel hängt vom Brechungsindex der Oberfläche ab –> Bindungsdetektion, da sich Oberflächeneigenschaften ändern.
Immobilisierung von Liganden
Chemisch, kovalent:
– CM-Dextran, Kopplung via Succinimid
– Thiole via S-S-Brücken
Nicht-kovalent:
– Biotin-Streptavidin/Avidin/Neutravidin
