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Molekularbiologie und Gentechnik > VL 3: Gentechnik I > Flashcards

VL 3: Gentechnik I Flashcards

1
Q

Gentechnik

A

Isolierung von DNA

DNA-Gelelektrophorese

Polymerase-Kettenreaktion

DNA-Klonierung (Restriktionsenzyme, Vektoren)

DNA-Bibliotheken (Genbank)

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2
Q

Nutzung von Gentechnologie gegen SARS-CoV2

A
  • Identifizierung/Sequenz
  • Moleekulare Analyse
  • PCR-Detektion
  • Effekt auf Zellen/Organismus
  • Wirtsppezifität
  • Impfstoff, Medikament
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3
Q

Rekombinante DNA

A
  • Neues DNA-Molekül, das durch Kombination von zwei nichthomologen DNA-Fragmenten entstanden ist
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4
Q

Gentechnisch veränderter Organismus

A
  • Organismus, der DNA-Squenz eines anderen Organismus enthält und nicht durch Kreuzung hergestellt wurde
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5
Q

Gentechnikgesetz

A
  • Seit 1990
  • Rechtlicher Rahmen für die Forschung, Entwicklung und Nutzuung der Gentechnik, dient dem Schutz vor schädlichen Auswirkungen, regelt den Umgang mit GVOs
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6
Q

Isolierung genomischer DNA

A
  • Vorbereitung der Probe
    • DNA physikalisch labil
      • zu pH-Änerungen
      • Temperatur
      • Scherkräfte
    • wichtig unter shcwachen Bedingungen zu arbeiten
    • wässrige Lösuung, Puffer, Detergenzien
  • Zell-Lyse
    • Auflösung der Zellbestandteile
    • Proteine…
      • DNAsen, DNA-verdauuende Enzyme, benötigen Mg2+, Mn2+
        • EDTA verhindert Abbau der DNA
  • Entfernung der Proteine
    • Phenolchloroform extraktion
  • Ausfällung DNA
    • EtOH-Fällung
    • Wegkippen
  • DNA Rehydrierung
    • wässriger Puffer
    • EDTA-Puffer
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7
Q

Agarose-Gelelektrophorese

A
  • Auftrennung der DNA erfolgt über Agarose-Gele
  • Agarose = Polysaccharid aus Rotalgen
  • Agarose-Konzentration bestimmt die Maschenweite
  • ø150 nm bei 1%; ø500 nm bei 0,16%
  • Anfärbung der DNA mit einem fluoreszenten Farbstoff
    • Ethidiumbromid
    • GelGreen
  • gießen DNA
  • Stromanlegung, DNA tendenziell negativ geladen
  • Wanderung DNA zum Pluspol
  • DNA bleibt in Maschen hängen, je nach Größe des DNA-Fragments
  • Vergeeich der Migration eines unbekannten DNA Fragments mit Größenstandars (Marker)
  • Bei schlecht isolierter DNA wirds zum Geschmier, aufgrund Fragmentierung
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8
Q

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

A
  • Einzelfragment in großen Mengen darstellen
  • Erster Zyklus
    • Zielregion DNA zu amplifiezieren bestimmen
    • Erhitzen DNA -> Aufspaltung, Schmelzen des Doppelstranges
    • DNA Oligonukleotide komplementär zu DNA Sequenz
      • begrenzen Fragment, oberen und unteren Strang
    • Oligonukleotide (Primer) hybridisieren mit Sequnzen
    • Zugabe dntps
    • Synthese neuer DNA
  • Zweiter Zyklus
    • Repeat
  • Dritter Zyklus
    • usw
  • Fragment wird amplifiziert
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9
Q

Was braucht man für PCR?

A
  • Quelle für DNA
  • Primer
  • Nukleotide dNTPs
  • DNA-Polymerase
    • muss Hitzebeständig sein
    • Taq
  • Puffer
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10
Q

Anwendung PCR

A
  • Vaterschaftstest
  • Forensik
  • VNTR= Variable Number of Tandem Repeats
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11
Q

Vaterschaftstest

A
  • Amplifizierung Fragmente aus menschl. Genom
  • wo es Polymorphismen gibt
    • untersch. Persone, unt. repeats
  • Regionen von rep. Sequenzen werden amplifiziert
    • VNTR Loci
  • untersch. Individuen, haben unterschiedliche Anzahl von Repeats
  • für Vater, Mutter und Kind
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12
Q

Forensik

A
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13
Q

PCR für Klonierung

A
  • bei RNA-Viren (z.B Corona)
  • RNA muss zu DNA umgesetzt werden –> reverse Transkription
    • cDNA
  • genomische Seq. enthält Introns
  • mRNA ist gespleißt
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14
Q

DNAKlonierung

A

Ziel: Einführen eines DNA-Abschnitts in ein geeignetes Vehikel (Vektor)

Werkzeuge

  • Restriktionsenzyme = Enzyme, die DNA an einer definierten Sequenz schneiden
  • Vektoren = Vehikel, mit dessen Hilfe DNA in Wirtszellen eingebracht und vermehrt werden kann
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15
Q

Restriktionsenzyme

A
  • Schneiden an def. DNA-Sequenzen
  • Enzym, Protein
  • oft palindromische Erkennungssequenz
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16
Q

Eigenschaften von Vektoren

A
  • können fremde DNA aufnehmen
  • können sich in Wirtszellen autonom vermehren
  • Selektrion von Wirstzellen mit Vektor odt durch Antibiotikum-Resistenzgen (z.B. AmpicillinResistenzgen)
  • Bspi für Vektoren (Wirtszelle oft Bakterien
    • Plasmide = zirkuläre, selbst-replizierende DNA
    • Bakteriophagen = Viren, die Bakterien infizieren. Teile der Phagen-DNA können durch Fremd-DNA ersetzt werden
    • Hefen (Yeast Artificial Chromosom, YAC)
    • andere Viren
17
Q

Plasmid

A

Funktionelle Elemente eines Plasmids

  • Replikationsursprung
  • Antibiotikum-Resistenzgen
  • Multiple Cloning Siite
18
Q

Klonierung

19
Q

gerichtete vs. ungerichtete Klonierung

A

Gerichtete Klonierung

  • Vektor und Insert werden mit zwei unterschiedlichen Restriktionsenzymen behandelt bzw. linearisiert

Ungerichtete Klonierung

  • Vektor und Insert werden mit einem Restriktionsenzym behandelt, d.h. beide Enden des Inserts sind zu beiden Enden des Vektors kompatibel
20
Q

Genbank (DNA-Bibliothek)

A

Sammlung von DNA-Fragmenten, die das gesamte Genom (Transkriptom) eines Organismus repräsentieren, in einem geeigneten Vektor

  • Isolierung eines Gens (z.B. asejkfnwejkf)
  • cDNA –> genomische Sequenz
  • Protein Gen/sdjkfn
21
Q

Genomische vs cDNAGenbank

Molekularbiologie und Gentechnik (6 decks)

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