VL 3: Gentechnik I

Question 1

Gentechnik

Answer 1

Isolierung von DNA

DNA-Gelelektrophorese

Polymerase-Kettenreaktion

DNA-Klonierung (Restriktionsenzyme, Vektoren)

DNA-Bibliotheken (Genbank)

Question 2

Nutzung von Gentechnologie gegen SARS-CoV2

Answer 2

• Identifizierung/Sequenz
• Moleekulare Analyse
• PCR-Detektion
• Effekt auf Zellen/Organismus
• Wirtsppezifität
• Impfstoff, Medikament

Question 3

Rekombinante DNA

Answer 3

• Neues DNA-Molekül, das durch Kombination von zwei nichthomologen DNA-Fragmenten entstanden ist

Question 4

Gentechnisch veränderter Organismus

Answer 4

• Organismus, der DNA-Squenz eines anderen Organismus enthält und nicht durch Kreuzung hergestellt wurde

Question 5

Gentechnikgesetz

Answer 5

• Seit 1990
• Rechtlicher Rahmen für die Forschung, Entwicklung und Nutzuung der Gentechnik, dient dem Schutz vor schädlichen Auswirkungen, regelt den Umgang mit GVOs

Question 6

Isolierung genomischer DNA

Answer 6

• Vorbereitung der Probe
  
  • DNA physikalisch labil
    
    • zu pH-Änerungen
    • Temperatur
    • Scherkräfte
  • wichtig unter shcwachen Bedingungen zu arbeiten
  • wässrige Lösuung, Puffer, Detergenzien
• Zell-Lyse
  
  • Auflösung der Zellbestandteile
  • Proteine…
    
    • DNAsen, DNA-verdauuende Enzyme, benötigen Mg2+, Mn2+
      
      • EDTA verhindert Abbau der DNA
• Entfernung der Proteine
  
  • Phenolchloroform extraktion
• Ausfällung DNA
  
  • EtOH-Fällung
  • Wegkippen
• DNA Rehydrierung
  
  • wässriger Puffer
  • EDTA-Puffer

Question 7

Agarose-Gelelektrophorese

Answer 7

• Auftrennung der DNA erfolgt über Agarose-Gele
• Agarose = Polysaccharid aus Rotalgen
• Agarose-Konzentration bestimmt die Maschenweite
• ø150 nm bei 1%; ø500 nm bei 0,16%
• Anfärbung der DNA mit einem fluoreszenten Farbstoff
  
  • Ethidiumbromid
  • GelGreen
• gießen DNA
• Stromanlegung, DNA tendenziell negativ geladen
• Wanderung DNA zum Pluspol
• DNA bleibt in Maschen hängen, je nach Größe des DNA-Fragments
• Vergeeich der Migration eines unbekannten DNA Fragments mit Größenstandars (Marker)
• Bei schlecht isolierter DNA wirds zum Geschmier, aufgrund Fragmentierung

Question 8

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Answer 8

• Einzelfragment in großen Mengen darstellen
• Erster Zyklus
  
  • Zielregion DNA zu amplifiezieren bestimmen
  • Erhitzen DNA -> Aufspaltung, Schmelzen des Doppelstranges
  • DNA Oligonukleotide komplementär zu DNA Sequenz
    
    • begrenzen Fragment, oberen und unteren Strang
  • Oligonukleotide (Primer) hybridisieren mit Sequnzen
  • Zugabe dntps
  • Synthese neuer DNA
• Zweiter Zyklus
  
  • Repeat
• Dritter Zyklus
  
  • usw
• Fragment wird amplifiziert

Question 9

Was braucht man für PCR?

Answer 9

• Quelle für DNA
• Primer
• Nukleotide dNTPs
• DNA-Polymerase
  
  • muss Hitzebeständig sein
  • Taq
• Puffer

Question 10

Anwendung PCR

Answer 10

• Vaterschaftstest
• Forensik
• VNTR= Variable Number of Tandem Repeats

Question 11

Vaterschaftstest

Answer 11

• Amplifizierung Fragmente aus menschl. Genom
• wo es Polymorphismen gibt
  
  • untersch. Persone, unt. repeats
• Regionen von rep. Sequenzen werden amplifiziert
  
  • VNTR Loci
• untersch. Individuen, haben unterschiedliche Anzahl von Repeats
• für Vater, Mutter und Kind

Question 12

Forensik

Answer 12

Question 13

PCR für Klonierung

Answer 13

• bei RNA-Viren (z.B Corona)
• RNA muss zu DNA umgesetzt werden –> reverse Transkription
  
  • cDNA
• genomische Seq. enthält Introns
• mRNA ist gespleißt

Question 14

DNAKlonierung

Answer 14

Ziel: Einführen eines DNA-Abschnitts in ein geeignetes Vehikel (Vektor)

Werkzeuge

• Restriktionsenzyme = Enzyme, die DNA an einer definierten Sequenz schneiden
• Vektoren = Vehikel, mit dessen Hilfe DNA in Wirtszellen eingebracht und vermehrt werden kann

Question 15

Restriktionsenzyme

Answer 15

• Schneiden an def. DNA-Sequenzen
• Enzym, Protein
• oft palindromische Erkennungssequenz

Question 16

Eigenschaften von Vektoren

Answer 16

• können fremde DNA aufnehmen
• können sich in Wirtszellen autonom vermehren
• Selektrion von Wirstzellen mit Vektor odt durch Antibiotikum-Resistenzgen (z.B. AmpicillinResistenzgen)
• Bspi für Vektoren (Wirtszelle oft Bakterien
  
  • Plasmide = zirkuläre, selbst-replizierende DNA
  • Bakteriophagen = Viren, die Bakterien infizieren. Teile der Phagen-DNA können durch Fremd-DNA ersetzt werden
  • Hefen (Yeast Artificial Chromosom, YAC)
  • andere Viren

Question 17

Plasmid

Answer 17

Funktionelle Elemente eines Plasmids

• Replikationsursprung
• Antibiotikum-Resistenzgen
• Multiple Cloning Siite

Question 18

Klonierung

Answer 18

Question 19

gerichtete vs. ungerichtete Klonierung

Answer 19

Gerichtete Klonierung

• Vektor und Insert werden mit zwei unterschiedlichen Restriktionsenzymen behandelt bzw. linearisiert

Ungerichtete Klonierung

• Vektor und Insert werden mit einem Restriktionsenzym behandelt, d.h. beide Enden des Inserts sind zu beiden Enden des Vektors kompatibel

Question 20

Genbank (DNA-Bibliothek)

Answer 20

Sammlung von DNA-Fragmenten, die das gesamte Genom (Transkriptom) eines Organismus repräsentieren, in einem geeigneten Vektor

• Isolierung eines Gens (z.B. asejkfnwejkf)
• cDNA –> genomische Sequenz
• Protein Gen/sdjkfn

Question 21

Genomische vs cDNAGenbank

Answer 21