Gentechnik II

Question 1

VL 4: Gentechnologie II Inhalt

Answer 1

• Screening einer Genbank: Hybridisierung
• Markierung von DNA
• cDNA
• Southern Blotting; Northern, Western
• Herstellung eines Antikörpers
• Epitope tagging
• DNA-Sequenzierung

Question 2

Screening einer Genbank mit einer markierten Sonde

Answer 2

• Bakterien infiziert mit Bakteriophagen
• Plaques
• Plaque = Klon mit Sequenz einer Geenbank
• Abdruck auf fester Unterlage
  
  • Nylonfilter
  • Abziehen
  • Phagen kleben auf Filter
• Phage mit DNA
• Behandlung DNA denaturierung
• Inkubation mit einer radioaktiv markierten Sonde und Autoradiographie
• Dignal über der Phagen-DNA, die mit der one hybridisiert hat

Question 3

Prinzip der Hybridisierung

Answer 3

Question 4

Markierung von DNA

Answer 4

• Anwendung:Markierung von DNA für Hybridisierungsexperimente
• Methode: Einbau markierter Basenanaloga in die DNA
  
  • radioaktive Isotope (³²P, ³H, ¹⁴C)
  • Nukleotide, die modifiziert sind und über spezifische Antikörper erkannt werden (Thymidin-Analog Bromodesoxyuridin)
• Nukleotide, deren Basen mit Makromolekülen gekoppelt sind und die immunologisch nachgewiesen werden (Digoxigenin = DIG mit anti-DIG-AK)
• Nukleotide, die über eine Komplexbildung mit anderen Makromoleküleen den Nachweiss erlauben (Biotin mit Avidin oder Streptavidin)

Question 5

Markierung vo DNA -Nick Translation

Answer 5

• leichte Behandlung DNA mit DNAse
• Nicks in Rückgrat
• kleine Stücke weg
• Polymerase füllt stellen auf mit modifizierten Nukleotiden

Question 6

Markierung von DNA - Randon Priming

Answer 6

• DNA aufschmelzen
• Primer-Zugabe
• Random-Oligonukleotide
  
  • universell einsetzbar
• Hybridisierung
• DNA Polymerase mit markierten nt

Question 7

Genomische vs. cDNA-Genbank

Answer 7

• Genomische Genbank
  
  • gesamte DNA des Organismus
  • Subklonierung
  • viele versch. Klone
  • repräsentieren DNA Stücke des gesamten Genoms
  • nur 1,5% der Klone sind Proteinkodierende Gene
• cDNA Genbank
  
  • DNA Sequenz komplementär zu einer mRNA
  • keine Introns, rausgespleißt
  • aus mRNA wird DNA gemacht und kloniert
  • reverse Transkription

Question 8

cDNA

Answer 8

DNA, die komplementär zu einer mRNA ist

Reverse Transkription

• OligodT wird an mRNA hybridisiert
• Polymerase setzt an 3’OH-Ende des oligodT
• reverse Transkriptase

Question 9

Southern-Blot–Technik

Answer 9

• Ziel: ein best. DNA-Fragment in DNA-Gemisch nachweisen
• Anwendungsbeispiele
  
  • Gen auf Sonde, Gen in ORganismus wiederfinden
  • Restriktionsscnittstellen des Gens
  • KO eines Gens detektieren
• Funktionsweise
  
  • DNA gemisch
  • Restriktionsenzyme zerschneiden
  • DNA Trennung mit Gelelektrophorese
  • Transfer auf feste Unterlage –> Southerntransfer
    
    • Stapel
    • filter über Gel
    • Tücher draauf
    • unten Pufferlösung
    • Kapillarkraft Flüssigkeit durch Gel, durch Filter in Papierstapel
    • Behandlung Gel und Filter, so dass DNA aus Gel hinauswandert
    • DNA bleibt auf nitrocellulose Papier hängen
  • DNA jetzt auf Filter transferiert, mit gleichem Muster
  • Abdruck des Elektrophorese gels auf nitrocellulose Membran
  • kovalente Verbindungen
  • radioaktiv-markierte sonde des zu suchenden Gens, DNA
  • Sonde mit Hybridisierungsflüssigkeit in Tasche mit Blot
  • Anheftung an komplementären Sequenzen
  • Waschen der Membran
  • Exponieren Röntgenfilm
    *

Question 10

Northern Blotting

Answer 10

• Nachweis von RNA mit DNA Sonde/RNA Sonde
• RNA durch RNA-Gel
• Tranfer auf Gel
• Hybridisierung mit markierten Sonde

Question 11

Western Blotting

Answer 11

• Nachweis von Proteinen mithilfe von Antikörpern
• Vorgehensweise
  
  • SDSPAGE Gel mit Proteinen
  • Transfer auf Membran
  • Inkubation mit primärem Antikörper
  • Inkbation mit sekundärem Antikörper
    
    • trägt Markierung
  • Detektion (Chemilumineszent o.ä.)

Question 12

Herstellung eines polyklonalen Antikörpers

Answer 12

Question 13

Epitope tagging

Answer 13

• Tag in Protein deiner Wahl
• Abfolge von AS
• Antikörper gegen dieses Epitop
• Epitope-getaggtes Protein kann markiert werden
• Rekombinant Gen fusionieren mit DNA-Seq des Epitops
• gesamtes gen + Tag seq wird transkribiert und transkribiert zum Protein
• mit Antikörper kann Protein detektiert werden (Western Blot)
• Epitop darf nicht Proteinfunktion zerstören
  *

Question 14

gebräcuhliche Epitope Tags

Answer 14

• c-myc (EQKLISEEDL)
• HA (YPYDVPDYA)
• 6 x Histidin
• Flag (DYKDDDDK)
• V5 (GKPIPNPLLGLDST)
• GFP (green fliprescent protein)

Question 15

DNA-Sequenzierung - Kettenabbruchmethode

Answer 15

• Sanger-Sequenzierung
• 1977
• DNA-Sequenz
• Basenabfolge eines Stückes möchte man wissen
• Oligonukleotid Primes vor der zu lesenden Sequenz
• Second-Strand-Synthese mit DNA-Polymerase
• dNTP als Substrat
• Sanger: Nukleotid ohne 3’-OH sondern 3’-H -> Didesoxynukleotid ddNTP
• Einbau davon –> Kette kann nicht weiter verlängert werden
• Abbruch der Kette
• Kettenabbruchmethode
• Vermischen DNA Sequenz mit dNTPs und ddNTPs (z.B. ddATP)
• Abbrüche können willkürlich an Sequenz geschehen
• Auftrennung mit Gel
• einzelne Unterschiede können gesehen werden
• Auftrennung nach Größe
  *

Question 16

Sanger-Sequenzierung Moderne Methode

Answer 16

• peaks unterschiedliche Farbe
• peaks nukleotid
• gerät macht interpretation der Sequenz
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