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Int2 > Visualisation structure > Flashcards

Visualisation structure Flashcards

1
Q

Nomme les 4 grandes étapes de la préparation des tissus

A
  1. Fixation
  2. Dissection
  3. Enveloppement des tissus
  4. Coupe des sections
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Q

Vrai ou faux
Il est nécessaire de garder le tissu quasi in vitro pour l’observer / le préserver

A

Faux!
Quasi in vivo!
Tissu neural est délicat et dégradable

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3
Q

Explique c’est quoi la fixation en général et nomme une des effets sur l’échantillon

A

Utilisation de PRODUITS CHIMIQUES pour préserver, stabiliser, renforcer l’échantillon.

-PRÉSERVATION de la structure + la localisation des antigènes
-INACTIVATION des enzymes pouvant dégrader les protéines
-STABILISATION des interactions antigène-anticorps
-PRÉSERVATION de la morphologie cellulaire
-AMÉLIORATION de la durabilité des échantillons

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4
Q

Nomme les deux types d’agents pour fixer les tissus

A

1)Agents de cross-linking
2)Agents déshydratants

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Q

Si on veut faire de la microscopie électronique, on utilise quels agents de fixation?

A

Les aldéhydes (cross-linking)

*Formation des liaisons covalentes

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6
Q

Si on veut faire de la microscopie photonique, on utilise quels agents de fixation?

A

L’osmium tétroxyde (cross-linking)

*Réactions d’oxydation

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7
Q

Quels agents ont comme effet la perturbation des lipides et la réduction de la solubilité des protéines?

A

Les agents déshydratants

ex. Méthanol, acétone

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8
Q

Nomme les deux modes de fixation du tissu

A

1) IMMERSION
*tissu mis dans solution de fixation, temps requis selon sa grosseur
2)PERFUSION TRANSCARDIAQUE
Accès est établi au niv du systeme circulatoire (ex par pénétration du ventricule gauche). Évacuation du sang grâce à solution de nettoyage (ex PBS). Perfusion de l’agent fixateur. Anesthésie

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9
Q

Quel facteur pourrait influencer la difficulté de la dissection?

A

Tissu frais = facile à dissequer
Tissu fixé = difficile à dissequer

**Dissection = retirer le cerveau du crâne ou de la moelle ep. Aussi microdissections des régions d’intérêts si nécessaire.

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10
Q

Explique la cryopréservation.

A

Tissu est submergé dans solution de 30% sucrose pour min 48h-72h.
Sucrose remplace l’eau dans le tissu (qui va couler au fond)
BUT: Eau endommage tissus à la congélation !

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11
Q

Nomme les deux buts de l’enveloppement du tissu

A

1) Stabiliser la structure du tissu
2) Faciliter les coupes

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12
Q

Mettre en ordre selon épaisseur des tranches:
Microtome, Cryostat, Vibratome

A

Tranches minces : Cryostat
Tranches moyennes: Microtome
Tranches épaisses: Vibratome

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13
Q

Quelle machine permet de faire la coupe des tissus vivants?

A

Le vibratome!

Lame vibrante, non-congelé

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14
Q

Quelle machine permet de couper le tissu juste dans des conditions congelés?

A

Cryostat

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15
Q

Pourquoi on utilise des colorants sur les tissus?

A

Vu que masse du cerveau = 75% d’eau, les sections sont transparentes

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16
Q

Pour colorer le soma, on utilise des colorants basophiles ou acidiques?

A

On prend des colorants BASOPHILES pour colorer les molécules ACIDES

**colore ADN et ARN

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17
Q

Si on veut colorer les ribosomes, on prendrait quel colorant?

A

Nissl

*Préfère ARN (RER, ribosomes)

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18
Q

Ces colorants colorent quoi?

DAPI
Hoechst
Propidium iodide (PI)
TO-PRO-3

A

colorants FLUORESCENTS du SOMA

**Marqueurs des NOYAUX par INTERCALATION entre les spirales hélicoidales de l’ADN

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19
Q

Ces colorants colorent quoi?

Cresyl violet (Nissl)
Hematoxyline
Thionine

A

colorants NON-fluorescents du soma

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20
Q

À quoi servent les colorants non-fluorescents du soma?

A
  • Examen de l’architecture cellulaire
  • Visualisation des aspects microscopiques des régions distinctes du cerveau
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21
Q

Est-il possible d’identifier des fibres de myéline individuelles grâce au luxol fast blue ou à la coloration de Weil?

A

NON!

Impossible d’identifier des fibres individuelles

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22
Q

Que marque la coloration des fibres?

A

La myéline de la matière blanche

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23
Q

Quelle coloration est souvent utilisé en combinaison avec des colorants basophiles?

A

Les colorants des fibres de myéline

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24
Q

Décris la coloration de Golgi

A

Marque des neurones de manière aléatoires (5-10%)

–Marque le soma, les dendrites et la partie NON-myélinisé de l’axone (ou terminale)

**Idéale pour voir les champs dendritiques
**Utile pour études de neurodégénérescence

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25
Q

Quels types de marquage colore les neurones in vivo?

A

Les marquages intracellulaire et juxta-cellulaire

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26
Q

Quelle est la différence entre le marquage intracellulaire et juxtacellulaire?

A

L’endroit où on injecte le marqueur.

**Le marquage est juxta-cellulaire si on l’introduit à proximité des membranes et qu’il rentre après

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27
Q

Est-ce qu’il peut y avoir des relations 1:1 avec des marqueurs fluorescents?

A

Non
Donne possibilité d’amplification!

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28
Q

Nomme une manière d’avoir des marqueurs fluorescents dans une cellule?

A

On la modifie génétiquement pour qu’elle exprime des protéines fluorescentes (ex GFP)

29
Q

Qu’est-ce qu’ils sont

Alexa488, Rhodamine, Cy5

A

Des fluorophores!

30
Q

Comment les quantum dots résistent-ils au photobleaching?

A

C’est des nanocrystaux semiconducteurs
L’émission de couleur (longueur d’onde émise) est selon leur TAILLE!!! (tous mm longueur d’onde d’excitation bleu)

**Autre type de fluorophore

31
Q

Est-ce qu’un anticorps ou un brin ADN/ARN antisens est visible quand il se lie à une protéine d’intérêt?

A

NON

La sonde a besoin d’être conjugué à un marqueur
OU
peut être réactif avec d’autres produits chimiques

32
Q

Quel type de marquage vient d’une réaction enzymatique avec un substrat et qui produit le composé coloré?

A

Le marquage chromogénique

**méthode de marquage avec des sondes

33
Q

Vrai ou faux
Le marquage chromogénique est visible avec un microscope photonique

A

vrai

34
Q

Ils font partie de quelle catégorie

HRP et DAB
B-galactosidase et X-gal
Biotine et avidin/streptavidine

A

Marquage chromogénique

*dans les méthodes de marquage avec des sondes

35
Q

Qu’a de spécial l’intéraction biotine et avidin?

A

Ces sondes peuvent faire du marquage chromogénique et du marquage fluorescent

36
Q

Quelle sonde peut être visible par microscopie photonique, fluorescente et électronique?

A

La biotine!

*Cela dépend des marqueurs conjugués à avidine

37
Q

Décris la méthode de marquage par radioactivité

A
  • Réaction DIRECTE (marquage 1:1)
  • Surtout utilisé pour ISH

*Utile pour la localisation des recepteurs, la prolifération et le trafic des protéines
*Exposition prolongée = impacts sur la santé!

38
Q

Décris la méthode de marquage avec l’or colloidale

A

-C’est un matériel dense en ÉLECTRONS visible en MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE

-Possibilité d’être conjugué avec un anticorps

39
Q

Nomme une méthode pour visualiser les gènes

A

Hybridation in situ

**Méthode pour visualier JUSTE les ACIDES NUCLÉIQUES
** donc JUSTE ADN et ARN

40
Q

Vrai ou faux
Il est possible de voir où un gène spécifique est exprimé avec l’ISH

A

Vrai

On peut voir où est transcrit l’ARNm!

41
Q

Vrai ou faux
Il est possible de voir où la protéine fonctionnelle est exprimée dans la cellule avec l’ISH

A

Faux!

On sait où est transcrit le gène, mais on ne peut pas savoir où la protéine va être fabriquée/utilisée!

42
Q

Comment fonctionne la détection de l’expression d’un gène par l’hybridation in situ?

A

On utilise une SONDE d’acide nucléique simple brin COMPLÉMENTAIRE à la séquence de l’ARNm d’intérêt.

La sonde doit être MARQUÉE afin d’être visible.

On INCUBE la sonde avec le tissu; la sonde ira S’HYBRIDER avec l’ARNm d’intérêt.

43
Q

Explique le blocking DNA dans l’hybridation in situ.

(Blocking RNA si on fait ISH avec ARN)

A

Il y a des sites non spécifiques dans notre échantillon où les sondes pourraient se lier, ce qui engendrait un signal de fond indésirable.

Pour réduire cette liaison non spécifique, on ajoute du blocking DNA qui est une séquence d’ADN simple brin non complémentaire à la séquence cible. Le blocking DNA est en excès par rapport aux sondes spécifiques et occupe ainsi les sites non spécifiques potentiels dans l’échantillon.

44
Q

Nomme deux contrôles de l’hybridation in situ

A

1) Une sonde sens, donc qui est non-complémentaire au gène d’intérêt. – Pas de signal attendu

2) Autres sondes faites pour des régions différentes du même gène / transcrit
Permet d’avoir confiance dans ce qu’on voit
Permet de visualiser les off target effect

45
Q

Nomme une méthode pour faire la détection des protéines

A

Immunohistochimie

46
Q

Quel est un avantage de l’immunohistochimie?

A

Meilleure résolution spatiale

On peut visualiser des protéines dans les structures subcellulaires

47
Q

Vrai ou faux
On a absolument besoin d’anticorps pour faire de l’immunohistochimie

A

Vrai

48
Q

C’est quoi un épitope?

A

C’est une région de l’antigène reconnue par l’anticorps

49
Q

Vrai ou faux
Les anticorps polyclonaux sont produits grâce à des hybridomes

A

FAUX, Les anticorps polyclonaux sont produits dans des animaux vivants

**anticorps polyclonaux peuvent reconnaitre plusieurs épitopes d’un antigène

50
Q

Est-il plus difficile de faire de l’immunohistochimie sur un tissu ou sur des cellules?

A

Plus difficile sur des tissus - ont des agencements plus complexes

51
Q

Vrai ou faux
L’IHC indirecte, c’est quand on utilise un anticorps secondaire conjugué avec un fluorophore / enzyme chromogénique

A

Vrai

52
Q

C’est quoi NeuN?

A

Un anticorps associé aux neurones

53
Q

Nomme un contrôle négatif pour vérifier la spécificité d’un anticorps

A
  • Un spécimen qui ne contient pas l’antigène connu

-IHC indirecte: un spécimen incubé sans l’anticorps primaire, mais seulement avec l’anticorps secondaire

-Préincubation de l’anticorps avec un antigène avant mise en présence du spécimen

54
Q

Vrai ou faux
On rajoute des enzymes pour après visualiser les sous-produits colorés obtenus dans le cadre de l’histochimie enzymatique

A

Faux
On rajoute des CHROMOGÈNES.

55
Q

Quelle méthode utilise l’activité enzymatique endogène pour faire des observations?

A

Histochimie enzymatique

56
Q

Vrai ou faux
Les gènes rapporteurs endogènes sont exprimés pour examiner l’expression spatiale et temporelle d’un gène

A

Faux
Les gènes rapporteurs sont EXOGÈNES.
Ils sont exprimés par la cellule, sous le contrôle d’un promoteur ENDO ou EXO

57
Q

Quel est l’avantage de l’utilisation des gènes endogènes à la place de l’immunohistochimie?

A

Possibilité d’examiner l’expression SPATIALE et TEMPORELLE d’un gène en MESURANT le rapporteur.

58
Q

Explique le phénomène de photoactivation des protéines

A

Le rapporteur devient fluorescent après excitation avec un laser.
Les protéines sont photoactivées dans une zone restreinte (sélection spatiale)
Utilisé pour étudier la DYNAMIQUE et la LOCALISATION de protéines dans des cellules VIVANTES
**suivi en temps réel des processus biologiques, signalisation cellulaire,…,

59
Q

Explique le phénomène de photoconversion des protéines

A

Le rapporteur change son émission après conversion avec un laser (vert à rouge par ex)
Utile pour étudier la mobilité, les interactions, …, dans les cellules VIVANTES

60
Q

Comment se nomme les sondes chimiques qui marquent les voies axonales permettant de visualiser la connectivité du SN?

A

Les traceurs antérogrades et rétrogrades

61
Q

Vrai ou faux
Les traceurs antérogrades sont chromogéniques

A

Vrai
les traceurs RÉTROGRADES et ANTÉROGRADES sont CHROMOGÉNIQUES ou FLUORESCENTS

62
Q

Quel traceur indique les neurones qui ont des projections au site d’injection?

A

Rétrograde

63
Q

Vrai ou faux
Après l’injection des traceurs, on peut rapidement regarder les réseaux neuronaux

A

Faux!
On injecte dans un animal VIVANT. On attend 1-7 JOURS avant de faire fixation.

64
Q

Explique le fonctionnement de 3H-proline et 3H-leucine

A

C’est des acides aminés radioactifs qu’on injecte dans l’environnement local du neurone primaire. Certains vont être absorbés par des transporteurs. Dans la cellule, les acides aminés radioactifs vont être incorporés à des protéines. Ils vont alors traverser l’axone et être sécrétés dans la terminaison synaptique et reçues par le neurone de second-ordre.
La détection se fait par autoradiographie.
traceurs transsynaptiques antérogrades

65
Q

Explique les avantages des traceurs viraux transsynaptiques.

A

Ils font de l’auto-amplification (marquage progressif des neurones dans un circuit quand ils sont infectés)

66
Q

Explique les désavantages des traceurs viraux transsynaptiques

A

-Peut tuer les neurones
-Infection généralisée chez les animaux
-Plus la durée de l’infection est longue, plus le marquage est beau, mais les neurones primaires/secondaires vont mourir
-Biosécurité

67
Q

Le fluoro-gold est un exemple de quoi?

A

Traceurs rétrograde

68
Q

Nomme une particularité du signal avec l’immunohistochimie indirecte

A

Il y a amplification du signal: plus d’un anticorps secondaire peut reconnaitre l’anticorps primaire donc ce n’est pas une relation 1:1

Int2 (7 decks)

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