Vaja 2: Insercijska mutageneza kolicina in transformacija

Question 1

Zapis za kateri antibiotik ima RU4405?

Answer 1

Tc - tetraciklin

Question 2

Kaj vsebuje STET pufer in kje smo ga uporabili?

Answer 2

Izolacija DNA pKV10
STET:
- saharoza ->izotoničnost
- triton X-100 -> vpliv na LPS, ki ga imajo G- bakt. na površini -> dostop lizocima do peptidoglikana, nepolarni detergent razstaplja membrano
- EDTA -> veže dvovalentne katione (Ca 2+, Mg 2+), ki so ključne za delovanje RNaz, vpliva na dostop lizocima do peptidoglikana
- Tris HCl -> optimalen pH (8)

Question 3

Kako smo preverili izolacijo plazmidne DNA?

Answer 3

Z gelsko elektroforezo.

Question 4

Kaj potrebujemo za gelsko elektroforezo?

Answer 4

1. ) Stehtamo agarozo in jo stopimo v pufru 0,5x TBE (mikrovalovna) -> izhlapelo vodo nadomestimo. Agarozo ohladimo do 60C
2. ) Pripravimo nosilec
3. ) Ohlajeni agarozi dodamo EtBr in vlijemo v nosilec
4. ) Gelček damo v banjico in jo napolnimo z 0,5x TBE pufrom z EtBr.

Question 5

Kako deluje pufer CTAB in kje smo ga upotabili?

Answer 5

Pri izolaciji DNA pKV10
CTAB vsebuje:
-kationski detergent, ki veže neg. nabite molekule (prot.,DNA)
-konc. soli nizka -> obori DNA
-konc. soli visoka -> obori polisaharide

Question 6

Zakaj smo po CTAB uporabili NaCl in 96% etanol?

Answer 6

NaCl izpodrine CTAB, Na+ se veže na DNA in jo nevtralizira -> ni več topna v H2O.
Etanol odstrani H2O. => DNA se obori!

Question 7

Število celic v izhodni kulturi?

Answer 7

10^9

Question 8

Celice v kateri fazi rasti uporabimo za kompetenco?

Answer 8

Celice v elsponentni fazi rasti:

• razmerje med V in P
• živost
• okvarjeni geni za restrikcijsko-modifikacijske sisteme
• okvarjen gen za rekombinacijo

Question 9

Zakaj pri pripravi kompetentnih celic uporabimo led?

Answer 9

Zamrznejo lipidi membran.

Question 10

Zakaj pri pripravi kompetentnih celic uporabimo CaCl2?

Answer 10

Ca2+ prerazporedi lipopolisaharide in spere gojišče.