UNIDAD 7: Bio-Imágenes Flashcards
¿Cómo obtienen el contraste estas técnicas?
Técnicas de imágenes ópticas que utilizan un contraste óptico como ser la diferencia en la transmisión, reflexión y fluorescencia de la luz entre la región a capturar y la región que rodea a esta (background).
Como son las dispersiones que se dan en un medio turbio (como un sistema biológico) al interactuar con una fuente de iluminación? ¿Cuáles son los más útiles para formar las imágenes?
Fotones Balísticos (ballistic). Levemente dispersados. Fotones Serpiente (snake). Coherentemente dispersados Fotones Difusos (diffuse). Los más importantes para formar las imágenes son los fotones balísticos y los serpiente, el otro tipo de fotones debe ser filtrado.
A medida que la luz se propaga a través de un tejido, la luz transmitida se compone de tres componentes: no dispersa (o dispersión coherente), dispersión débil y dispersión múltiple de la luz. Estos diferentes componentes pueden visualizarse tomando un ejemplo de un pulso corto de luz láser A través de un tejido, como se ilustra en la Figura 7.1.
La luz dispersada coherentemente, llamada fotones balísticos, se propagan en la dirección del haz entrante. Viajan por el camino más corto y emergen primero del tejido. Los fotones balísticos llevan la máxima información sobre la estructura interna del tejido.
Las porciones de luz que se dispersan ligeramente más, pero todavía en dirección hacia adelante, se llaman fotones de serpiente debido a sus trayectorias onduladas en la dirección hacia adelante. Estos fotones se temporizan con respecto a los fotones balísticos pero todavía llevan información significativa sobre el medio de dispersión.
Sin embargo, la mayoría de las porciones del haz de luz se someten a dispersión múltiple y viajan largas distancias dentro del medio. Emergen aún más tarde y se llaman fotones difusos. Llevan poca información sobre la microestructura del tejido y tienen que ser discriminados para imagen usando técnicas balísticas y fotones de serpiente.
realice un daigrama en bloque de un diagrama en bloques de un microscopio de fluorescencia.
Realice un diagrama en bloques de un microscopio de fluorescencia laser confocal
Realice un diagrama en bloques de un microscopio multifotónico.
Realice un cuadro comparativo entre las distintas microscopias de los puntos 106, 107 y 108, donde relacione fuente de excitación, filtros, detectores, resolución, profundidad de penetración, etc.
Defina lo que se entiende por fluorescencia endógena y exógena.
La fluorescencia endógena es producida por fluoróforos endógenos, es decir propios del organismo. Estos fluoróforos endógenos, al recibir una excitación de determinada longitud de onda autofluorescen.
Hay muchas estructuras biológicas de las que no se pueden obtener imágenes fluorescentes. En estos casos, se necesita marcar esas estructuras con fluoróforos exógenos. De esta forma, se obtienen imágenes fluorescentes mediante fluorescencia exógena.
¿Qué es lo que identifica a una determinada sustancia fluorescente?
Lo que identifica a una sustancia fluorescente determinada son sus espectros de absorción y de emisión, de donde se obtienen las longitudes de onda de excitación y de emisión de la misma.
¿Qué es la técnica de FLIM? ¿Cómo se la puede calcular y qué información brinda?
FLIM: fluorescence lifetime imaging microscopy o Tiempo de vida de la fluorescencia.
-Método basado en la fluorescencia
-Análisis del tiempo de vida del estado excitado de una molécula fluorescente
-Combinación con el análisis espacial (x, y, τ)
Es un método sensible a los cambios del entorno de la molécula, concentración iónica, pH, temperatura, etc. pero no a la concentración del fluoróforo.
Provee un mapa espacial del tiempo de vida media de un fluróforo dentro de una célula o tejido. La resolución temporal obtenida provee la oportunidad de estudiar la organización dinámica de un sistema vivo..
La forma simple de cálculo es It=I0t e-t en dominio temporal, donde es el tiempo de vida media del fluoróforo.
En el método por dominio frecuencial, se utiliza luz modulada sinusoidalmente para excitar la fluorescencia.
Para la obtención de imágenes FRET descrita anteriormente, FLIM proporciona una ventaja para medir la transferencia de energía sólo midiendo la vida útil del fluoróforo donador, que es significativamente afectada (reducida) por la transferencia de energía a un aceptor. FLIM también tiene la ventaja de que las vidas de fluorescencia son independientes de la intensidad de la fluorescencia, la concentración y, en mayor medida, el fotoblanqueo del flúor. Además, puede haber casos en los que un fluoróforo pueda presentar espectros similares, pero significativamente diferentes en diferentes ambientes, ya que la vida útil es una sonda más sensible del medio ambiente. FLIM se ha utilizado para muchos tipos diferentes de experimentos de imágenes utilizando tanto una y dos fotones excitaciones. Éstos incluyen la formación de imágenes mediante el etiquetado con múltiples fluoróforos, la obtención de imágenes cuantitativas de concentraciones de iones, la obtención de imágenes cuantitativas de oxígeno y la eficiencia de transferencia de energía en FRET
FLIM no sólo es útil para la investigación celular, sino también es una herramienta informativa para las industrias farmacológica y médica (Bastiaens y Squire, 1999). FLIM proporciona una plataforma de detección para la detección de ultra alto rendimiento de los medicamentos en sus interacciones con las células vivas. Esta técnica también es adecuada para evaluar los estados funcionales tempranos de las proteínas implicadas en la patología de un tejido enfermo.
Explique el concepto de conteo de fotones simples correlacionados en el tiempo (TCSPC)
Se basa en la repetición de medidas de diferencia de tiempos entre el flash de excitación y la subsecuente detección del primer evento de emisión. De esta manera se obtienen los tiempos de vida media en cada pixel y luego son presentados con un color.
Se requiere un laser pulsado, detectores de alta resolución temporal, bajo ruido y buena eficacia cuántica y una computadora para el procesamiento de los datos.
¿Cuales son las dos condiciones necesarias para obtener un fenómeno no lineal en un material biológico? ¿Por qué se dice que estos fenómenos son intrínsecamente confocales?
Las dos condiciones que necesarias para obtener un fenómeno no lineal en un material biológico son:
La polarización inducida en la muestra no tenga una dependencia lineal del campo eléctrico aplicado.
Se utilice como fuente de excitación un laser de alta intensidad (un laser pulsado generalmente).
Se dice que esto fenómenos son intrínsecamente confocales por se necesita el uso de un pinhold para la obtención de la imagen.
La descripción de la interacción de la luz con la matero sólo es aplicable en respuesta lineal cuando la polarización de una molécula (o un medio) es linealmente proporcional al campo eléctrico aplicado. En la iluminación con una fuente de luz intensa tal como un rayo láser donde el campo eléctrico asociado es fuerte, se tiene que considerar la polarización (distorsión) de un electrón de una molécula y el correspondiente medio usando una expansión de la serie de potencia en la aplicación La fuerza del campo.
La técnica de Tomografía Óptica Coherente, ¿a cuál de las clasificaciones de Bioimágenes corresponde?
Según la clasificación de bioimágenes la tomografía óptica coherente (OCT) corresponde a una técnica por reflexión. Imagen óptica Transmision (Transiluminacion) Filtrado espacial: Microscopio confocal Polarizacion gating Tiempo gating Métodos del dominio de la frecuencia Reflexion (dispersión hacia atrás) Filtrado espacial: microscopio confocal Interferometría (OCT) Fluorescencia Filtro espacial: microscopio confocal Espectroscopia localizada resuelta espacialmente Polarizacion resuelta Tiempo resuelto: FLIM FRET
Técnica microscópica muy potente llamada tomografía de coherencia óptica (OCT) para la obtención de imágenes de tejidos altamente dispersos. Se trata de una técnica de imagen de reflexión similar a la imagen de ultrasonido, excepto que se utiliza para la imagen onda de luz (generalmente en el rango IR cercano a IR) dispersa desde un sitio de tejido específico. La sensibilidad de la luz dispersada, así como su selectividad desde un sitio específico de retrodispersión, se logra utilizando la interferencia entre la luz dispersada en retroceso y un haz de referencia. El método OCT de formación de imágenes es particularmente adecuado para un medio altamente dispersante, tal como un tejido duro. La interferencia entre los frentes de onda de propagación de dos fuentes de luz se produce cuando ambos frentes de onda tienen una coherencia bien definida (relación de fase) dentro de la región de superposición. Esta coherencia bien definida de un frente de onda de una fuente se mantiene dentro de una distancia llamada longitud de coherencia. Por lo tanto, si tanto el haz de referencia como el haz retro-reflejado de un sitio de dispersión se derivan de la misma fuente de luz, sólo se producirá un patrón de interferencia bien definido si su diferencia de longitud de trayecto está dentro de la longitud de coherencia.
¿Cómo se obtiene una imagen 2D con esta técnica?
Una imagen 2D con esta técnica se obtiene realizando una medición del tiempo de retardo del eco y la magnitud de la luz reflejada en diferentes posiciones transversales.
Realice un diagrama en bloques de un sistema de OCT.
Describa brevemente como es la técnica de detección en esta metodología. (oct)
En OCT, un rayo de luz es dirigido al tejido del cual se debe obtener la imagen y la estructura interna es medida de forma no invasiva, midiendo el retraso en el eco de la luz al ser reflejado por las microestructuras. Se consigue realizando medidas axiales sucesivas en diferentes posiciones transversales. La información final es mostrada como una imagen topográfica bidimensional.
OCT utiliza una detección interferométrica y métodos de correlación para medir el tiempo de retardo.
