Transcription chez les eubactéries Flashcards
ARN polymérase chez E.coli
− Une seule ARN polymérase chez E.coli
- Découverte en 1958 (Weiss & Hurwitz)
- Responsable de la synthèse des 3 types d’ARN
(ARNm, ARNr et ARNt)
- Enorme enzyme de 470 kDa, composée de 5 sous-unités
2α + ββ’ + ω
- Couvre environ 70-80 pb
- Environ 7000 molécules par cellule
- A tout moment, + de 5000 à 6000 enzymes engagées dans la
transcription
- Activité polymérase 5’−>3’ avec taux de synthèse ~ 25 à 75 nt / sec
- Taux d’erreur de 1/10000 ; activités correctrices intrinsèques
su α de ARN Pol de E. Coli
− 36 kDa
− 2 sous-unités
− Codées par le gène rpo-A
− Avec une extrémité C-terminale (CTD) qui reconnait l’élément « up » du promoteur et peut interagir avec activateur CAP
su β de ARN Pol de E. Coli
− 151 kDa
− codée par le gène rpo-B
− Site catalytique - Forme liaison phosphodiester
− L’extrémité C-terminale est essentielle à la fixation du facteur σ
su β’ de ARN Pol de E. Coli
− 155 kDa
− codée par le gène rpo-C
− Chargée positivement (AA basiques)
− Forte affinité à l’ADN – motif en doigt de zinc via l’extrémité C-ter
− Maintient le brin non transcrit à part du brin transcrit
su ω de ARN Pol de E. Coli
− 11 kDa
− Codée par le gène rpo-Z
− Maintien l’assemblage de l’ensemble
− Agit comme chaperone
facteur sigma σ
- Quand elle est seule l’ARN polymérase peut se lier à l’ADN, se déplacer sur l’ADN par diffusion et se dissocier
sans réaliser la transcription. - Seule, elle ne distingue pas les promoteurs….
− C’est le facteur σ qui permet une transcription efficace, à partir du +1 et dans la bonne direction.
− En association avec le core enzyme, formation de l’holoenzyme
− nombre de facteurs sigma variable selon les espèces
ex: E. Coli a 7 facteurs sigma, dont un le facteur σ 70 est le facteur primaire et s’occupe de tous les “housekeeping genes” = gènes en phase de croissance qui ne concernent pas un stress
−> existence de facteurs anti-σ :
comme le facteur anti-σ70 (Rsd chez E. coli) qui inhibe le σ70 en phase stationnaire pour permettre à σ38
de s’associer à l’ARN pol et diriger l’expression des gènes
de la phase stationnaire.
− le facteur σ n’intervient que lors de l’initiation de la transcription
régions du facteur σ
− Région σ4.2 possède un motif en Hélice-coude-hélice qui reconnaît la région -35 pour fixer l’ARN polymérase
=> Une hélice interagit avec les bases dans le grand sillon de l’ADN via des liaisons hydrogènes, et l’autre hélice interagit avec le squelette de l’ADN
− Région σ2.4 ne possède pas de motif en Hélice-coude-hélice mais des acides aminés aromatiques
qui reconnaissent la région -10 du promoteur
=> Elle initie la séparation des deux brins d’ADN par retournement des bases sur le brin non transcrit
=> Les AA aromatiques forment une poche hydrophobe, et favorisent des interactions plus
énergétiquement favorable avec les bases retournées
− σ 1.1 empêche les facteurs 2.4 et 4.2 de se fixer à l’ADN en absence du core enzyme
=> en présence du core enzyme fixation du facteur 1.1 sur la su ß
− σ 3.0 interagit avec la région EXTEND
− σ 1.2 interagit avec la région DISCRIMINANT
Cycle de la transcription
− Initiation
=> Fixation de L’ARN pol au promoteur
=> Dénaturation locale
=> Ouverture du promoteur
=> Formation de la bulle de transcription
=> Complexe d’initiation de la transcription
− Élongation
− Terminaison
=> La polymérase termine et libère l’ARN
Les étapes de la transcription : initiation
=> complexe RPc / RPo
− Complexe fermé RPc (RNA polymerase closed)
=> Fixation de l’ARN pol sur le promoteur pour former le complexe fermé.
=> Faibles interactions, complexe instable.
−> Isomérisation et passage à complexe ouvert
=> Fixation à l’ADN via σ 2.4 et σ 4.2
=> courbure de l’ADN
=> enveloppement de l’ARN pol
=> Ouverture de l’ADN par retournement des bases (+ la région zipper maintient le brin codant éloigné du brin transcrit)
=> Repliement de l’extrémité N-ter du
facteur σ
=> Assemblage des sous-unités
β et β’
=> Fermeture de la
mâchoire
− Complexe ouvert RPo (open)
=> Le complexe fermé subit une transition jusqu’au complexe ouvert, stable, dans lequel les 2 brins d’ADN sont séparés sur 14 pb autour du +1
Les étapes de la transcription : initiation
=> Pause de l’initiation et/ou initiation abortive
− la transcription peut avorter et libérer des ARN de ~6-9 nt
− tant que l’on a pas atteint 10 nt, l’initiation est instable car la boucle σ3.2 bloque la sortie de l’ARN par choc avec l’extrémité 5’ de l’ARN naissant
=>Pause ou initiation abortive…
− les essais continuent jusqu’à ce que transcrit soit > 16 nt
=> quand transcrit > 16 nt alors rupture des interactions : σ4 / domaine β et σ4 / boite − 35
=> Séparation de l’ARN pol / promoteur….départ vers l’élongation
− Après libération du promoteur, formation du TEC
=>Transcription Elongation Complex
=> Caractérisé par une haute stabilité
=> Doit assurer la processivité de la polymérase
Les étapes de la transcription : élongation
− Entrée des NTP via le canal IIre
− Les NTP se lient par complémentarité à l’ADN
=> L’ARN pol peut discriminer les NTP des dNTP
=> Le 2nd Mg2+ accompagne le NTP pour la catalyse
− La boucle Trigger se replie en réponse à l’arrivée du NTP refermant le canal IIre.
− Le centre catalytique étant proche, il y a catalyse :
=> attaque nucléophile entre le 3’OH de l’ARN
naissant et le phosphate α du NTP entrant, pour former la liaison phosphodiester.
− Libération du pyrophosphate associée au Mg2+.
Les étapes de la transcription : élongation
=> trigger boucle
- La « trigger » boucle est un élément
clé mobile de la polymérase. - Son changement de conformation
est nécessaire pour l’addition des
nucléotides - Étape de translocation via un
changement de conformation de β’
en particulier au niveau de la
« bridge » hélice (pour diriger l’ext.
3’OH de l’ARN) et de la boucle
« trigger » en hélice (pour ouvrir les
pinces de l’enzyme en aval
Les étapes de la transcription :
élongation
=> régulateurs de la transcription
− Durant l’élongation, plusieurs régulateurs de la transcription vont se lier à l’ARN polymérase pour
assurer un complexe d’élongation stable et processif :
- NusA, interagit à la polymérase après l’initiation.
Elle induit des temps de pause à la polymérase en
stabilisant des structures « tige-boucle », d’où une
diminution de la vitesse d’élongation.
De plus, elle stimule la terminaison intrinsèque. - NusG, entre en compétition avec le facteur σ ce
qui induit son relargage. Elle stabilise le complexe
d’élongation en maintenant les interactions entre
la polymérase et l’ADN, ce qui rend le complexe +
processif.
Plus tard, NusG interagira avec ρ pour induire la
terminaison. - L’hétérodimère NusB/NusE vient se lier à l’ARN
naissant. Etape cruciale pour une transcription
processive. - De plus, l’interaction NusE/NusG permet de
coupler les ribosomes au complexe d’élongation
(rem : la traduction chez procaryote peut
commencer sur un ARNm en cours de
transcription) - La protéine ρ (terminateur) est elle aussi associée
à la polymérase dès les étapes précoces de l’élongation.
Activités correctrices intrinsèques
- correction pyrophosphorolytique
=> réincorpore le pyrophosphate au nt qu’elle vient d’incorporer - correction hydrolytique
=> La polymérase « retourne en arrière » de 1 à plusieurs nucléotides
=> Clivage de ces derniers nucléotides
=> Ensuite la synthèse peut se poursuivre
=> Activité stimulée par les facteurs GreA/B
− Activité des topoisomérases pour réguler les torsades ene amont et en aval
Terminaison
− Chez la bactérie, 2 types de signale de terminaision
1/ séquence d’ADN intrinsèques (Rho indépendantes)
=> séquence palindromique suivie d’une poly A sur le brin transcrit
=> lors de la transcription −> formation d’une boucle + tige poly U
2/ séquences Rho dépendantes (20 % chez E. Coli)
=> Rho = protéines avec 6su = hexamère en forme d’anneau ouvert
=> activité ATPasa et hélicase
=> Entrée via séquence RUT (Rhho Utilisation Site)
régulation opéron lactose
− Régulation négative via le répresseur codé par le gène Lac I
=> le répresseur est produit en permanence
=> en absence de lactose il se fixe à l’ADN et est répresseur de l’opéron lactose
=> en présence d’allolactose (= isomère du lactose et produit de la ß galactosidase), il se fixe à cet allolactose et cesse de réprimer l’opéron lactose
− régulation positive
=> si pas de glucose présent, signal de carence libère AMPc qui s’associent avec protéine CAP (Catabolite activator protein)
=> fixation de CAP sur le CAP-site qui interagit fortement avec α CTD, ce qui augmente la transcription de l’opéron lactose
