Réplication de l'ADN chez les eucaryotes Flashcards
Spécificités génome eucaryote
− Les règles générales de la réplication sont globalement les mêmes chez les eucaryotes et les
bactéries.
- Mécanisme semi-conservatif et bidirectionnel
- Utilise des dNTP comme substrats activés
- Nécessite une matrice d’ADN monocaténaire et une amorce dont l’extrémité est avec 3’-OH
- Les deux brins de la double hélice sont répliqués par des mécanismes distincts au niveau de la fourche de réplication
− Spécificités liées aux génomes eucaryotes:
- Taille des génomes : mise en place de mécanismes plus complexes et très régulés
- Structure chromatinienne
- Existence ADN linéaire (protection des télomères)
Mécanisme semi-conservatif et bidirectionnel
- Chez la bactérie
- 1 OriC
- Vit. de réplication = 1000 b/sec
- Chez les Eucaryotes
- Plusieurs Réplicons (20 à 30 000 par cellule ~=~ 1 réplicon/ 100-200 kpb)
- Vit. de réplication = 200 b/sec
(à cause des histones)
ADN polymérases eukaryotes
−> Les Eucaryotes ont au moins 15 ADN polymérases distinctes:
5’->3’ ADN polymérases ADN dépendantes
- Pol α : agit comme une primase (ARN polymérase), puis comme une ADN polymérase allongeant l’amorce.
- Pol β : est impliquée dans la réparation de l’ADN et la translation de césure (fragments d’okasaki).= (équivalente à ADN pol I d’E. Coli)
- Pol γ : réplique l’ADN mitochondrial.
- Pol δ : polymérase principale du brin retardé, hautement processive.
- Pol ε : polymérase principale du brin avancé, hautement processive.
=> Pol δ et Pol ε réunies sont équivalentes à ADN pol III d’E. Coli
−> Seules les ADN polymérases γ, δ et ε ont une activité d’autocorrection (3’->5’ exonucléase).
−> Aucune ADN polymérases eucaryotes n’a la capacité d’enlever les amorces d’ARN
(pas d’activité 5’->3’ exonucléase),
Cette étape est assurée par d’autres enzymes (FEN1, RNAse H), associées avec la Pol β.
- Pol η, ι, κ, and Rev1 et ζ : impliquées dans la réplication des zones endommagées de l’ADN.
- autres ADN polymérases peu caractérisées : θ, λ, φ, σ, et μ.
Activité 3’->5’ d’autocorrection
− Les ADN polymérases γ, δ et ε ont une structure tridimensionnelle en “main mi-ouverte”.
− Les “doigts”
lient le brin matriciel et l’activité polymérase (Pol) se situe entre les doigts et la paume.
− L’incorporation d’une base incorrecte à l’extrémité 3’ provoque la fusion de l’extrémité du duplex.
− La polymérase fait une pause et l’extrémité 3’ du brin néo-synthétisé est transférée au niveau du site exonucléase 3’-5’ (Exo), où le segment contenant le dNMP incorrect est enlevé
Autres protéines impliquées dans la réplication de l’ADN
− Complexe MCM (Mini Chromosome Maintenance) :
complexe hélicase qui permet la séparation des 2 brins de
la double hélice avant le passage des ADN polymérases.
− Complexe RPA (Replication Protein A) : les déroulases se
fixent sur l’ADN simple brin et le maintiennent sous forme monocaténaire; empêchent la formation d’”épingles à cheveux” (hairpins).
− Complexe RFC (Replication Factor C – clamp loader) : le
chargeur de pince permet l’ouverture et la mise en place de
PCNA.
− PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) : pince associée
aux ADN polymérases δ et ε ; assure la processivité des
deux enzymes.
− Topoisomérases : permettent d’éliminer les torsades qui
s’accumulent en amont de la fourche de réplication.
− RNAse FEN1 et RNAse H : éliminent les amorces d’ARN.
− ADN ligase Lig1 : reforme les liaisons phosphodiesters
entre les fragments d’Okazaki après l’élimination des
amorces d’ARN.
complexe MCM (Mini Chromosome Maintenance)
− Le complexe MCM Hélicase permet séparation des 2 brins
d’ADN, consommation d’ATP par hydrolyse, et progression
d’~ 300 nucléotides/sec.
− Il est formé de :
- MCM2-7 : 6 sous-unités « hélicase ».
- cdc45 : interagit avec MCM2 et ADN pol-α (primase).
- GINS : permet le démarrage du complexe MCM et assure l’interaction avec cdc45
=> maintient l’hélicase fermée (2/5 gate).
déroulases RPA (replication protein A)
- Stabilisation des portions d’ADN simple brin
- Éviter formation de structures secondaires
- Protection contre la dégradation
- Capables d’activer les systèmes de réparation de
l’ADN
− Formé de 3 protéines
- RPA70 : 3 domaines de fixation à l’ADN
- RPA32 : 1 domaine
- RPA14 : protéine régulatrice
Les topoisomérases
Topo-isomérase I :
- Monomère
- ATP-indépendante (aucune consommation
d’énergie)
- Coupure d’un brin qui passe alors au-dessus de
l’autre.
- Soulage les contraintes de torsion dans l’ADN
− Topo-isomérase II :
- Homodimère
- ATP-dépendante (2 ATP/réaction)
- Coupure transitoire des 2 brins de l’ADN
- Soulage les contraintes de torsion + aussi de décaténer des molécules d’ADN liées
− Coupures par transestérification via un résidu actif de Tyrosine des Topoisomérases qui réalise une attaque nucléophyle de la liaison phosphodiester et ainsi former une liaison covalante Tyrosine-ADN à l’une des extrémités de la coupure.
Mécanisme de translation de césure (fragments d’Okazaki)
− Elimination des amorces
d’ARN par l’endonucléase
FEN1 et la RNAse H
− Réparation des césures
entre les fragments
d’Okazaki par l’ADN pol β
−Réunion des fragments
par l’ADN ligase
Initiation
1/ formation du pre-replication complex (pre-RC)
2/ formation des fourches de réplication
3/ Progression
Initiation : formation du pre-replication complex (pre-RC)
− Le complexe pre-RC est formé du complexe
ORC, de Cdc6, et du complexe MCM
(MCM2-7), associé à la protéine Cdt1. Les
séquences d’initiation de la réplication sont
mal connues chez les eucaryotes, sauf chez
la S. cerevisiae (TTTTTATG/ATTTA/T)
− La phosphorylation de Cdc6, Cdt1 et MCM
par des kinases CDK (cycline dependent
kinases) et DDK (DBF4-dependent kinases)
libère le complexe MCM.
− Le complexe ORC est ensuite phosphorylé
et éliminé de l’origine de réplication. Le
complexe MCM se met en marche par
association avec les protéines GINS et
cdc45 ( ce qui forme le le complexe CMG = Cdc45, Mcm2-7 and Gins complex), et fusionne l’ADN.
− Les polymérases sont alors recrutées => formation des fourches de réplication
− ORC = origin recognition complex
− Cdc6 = cell division cycle 6
− Cdt1 = Cdc10-dependent transcript 1 protein
− CDK = cycline dependent kinases
− DDK = DBF4-dependent kinases
Progression : Protection de la fourche de réplication
− Complexe de protection de la
fourche (FPC, fork protection
complex), incluant
- la claspine,
- And1 et
- Tim/Tipin,
régule et coordonne la synthèse
de l’ADN après la fusion des
brins matrices par l’hélicase et
stabilise la fourche de réplication.
- Claspine connectée à la Pol ε sur le brin avancé
- AND-1 joint entre la Pol α et le complexe CMG pour la
formation des fragments d’Okasaki sur le brin tardif - Tim/TIPIN, protéines stabilisatrices
fonctionnement du cycle cellulaire
− dépend des Complexes Cdk / cycline
- Cdk déjà présentes mais activées
par les cyclines.
- Cycline exprimée en fonction du
complexe Cdk/cycline précédent
=> Activation séquentielle ordonnée
− La cycline D est induite en phase G1 et lors du point de restriction, puis s’associe au complexe cdk 4/6
=> phosphoryle la protéine Rb et libère le facteur E2F (qui était séquestré par pRb)
− le facteur E2F active la transcription de la cycline E qui s’associe avec cdk2 qui fait passer le cycle en phase S
− la cdk2 interagit ensuite ave la cycline A pour surveiller la fin de la réplication
− la cycline A s’associe ensuite à cdk1 pour l’entrée en phase g2 puis en mitose
− Point de restriction : E2F active la transcription de nombreux
acteurs du cycle : cycline E, ORC1, Cdc6, MCM-3, -5 ,-6, RPA,
RFC, PCNA, DNA ligase, DNA pol α, topoisomérase II …
− Fin de la phase G1 : recrutement séquentiel et ordonné de protéines spécifiques pour former les complexes Pre-RC : ORC,
Cdc6, MCM2-7, Cdt1.
− Entrée en phase S : le complexe CdK2-
cycline E est actif. Avec les DDK, il va
phosphoryler Cdc6 et Cdt1 pour libérer le
complexe MCM, et éliminer les protéines ORC pour permettre la fusion de l’ADN et la fixation
des ADN polymérases. La réplication peut
commencer.
− Progression en phase S : le complexe CdK2- cycline A contrôle les étapes d’élongation de la
réplication.
− Phases S, G2 et M : les complexes CdK2-cycline A puis CdK1-cyclines A/B empêchent le réassemblage
des complexes Pre-RC en maintenant les ORC, Cdc6 et Cdt1 hors du noyau
chaperones d’histone
1/ Après dissociation des nucléosomes, les histones parentales sont prises en charge par les chaperones ASF1
(Anti Silencing Function 1) pour H3–H4, et par FACT (Facilitates Chromatin Transcription) pour H2A–H2B.
2/ Les histones néosynthétisées sont apportées par ASF1 qui transfère les dimères H3–H4 à CAF-1 (Chromatin
Assembly Factor 1) en interaction avec PCNA. Après formation du tétramère (H3–H4)2, les dimères H2A–H2B
s’associent grâce aux chaperones FACT.
3/ Post-réplication, il y aussi la transmission mitotique des marques épigénétiques
Réplication du télomère
La télomérase = complexe protéique composé de
- l’enzyme telomerase reverse transcriptase (TERT),
- d’une amorce ARN appelée telomerase RNA component (TERC) servant de matrice pour
l’ajout des répétitions (TTAGGG)n,
- et d’un complexe aidant au bon fonctionnement de l’enzyme télomérase et à la stabilisation de l’amorce ARN
− La télomérase possède une activité de type transcriptase inverse, permettant de rallonger le brin se terminant par un simple brin en 3’.
− Puis, les ADN polymérases α (qui possède aussi l’activité primase) et δ se servent du simple brin comme matrice pour allonger le brin avec une extrémité 5’.
Cibles thérapeutiques
Les particularités de la réplication chez les eukaryotes peuvent être ciblés pour lutter contre des cancers en inhiber la réplication des cellules cancéreuses
−Agents alkylants
− Intercalants
− Dommages à l’ADN et inhibiteurs de réparation
− Inhibiteurs de topo-isomérases
− Inhibiteurs des ADN polymérases et de la télomérase
− Analogues de nucléotides
