Termodinamica Flashcards
Acidi nucleici: da filamento singolo a duplex
Ibridizzazione e annealing: hanno lo stesso significato, processo con cui si stabilisce un legame tra due filamenti di DNA o RNA separati per ottenere un filamento a doppia catena.
’Ibridizzazione’ indica un processo naturale, mentre ’annealing’ si riferisce a un processo ’artificale’ indotto in laboratorio.
I due filamenti devono essere complementari in termini di basi azotate per potersi legare attraverso interazioni non covalenti e dipendenti dalla sequenza (ponti idrogeno tra le basi).
Annealing: usi
è utilizzato in laboratorio in due processi: la PCR (Polymerase Chain Reaction, reazione a catena della polimerasi), in cui indica il legame di un primer a un frammento di DNA denaturato (’aperto’) e il pyrosequencing.
Indica anche la riformazione (’rinaturazione’) di filamenti complementari che erano stati separati tramite calore (denaturazione termica).
PCR Fasi
Polymerase Chain Reaction.
Fasi:
1. Denaturazione (94°C - 96°C): srotolamento della doppia catena e separazione in due filamenti.
2. Annealing (circa 65°C): i due primer si legano alle sequenze complementari.
3. Allungamento(72°C): i nucleotidi liberi che si trovano nella soluzione di reazione vengono legati al primer, uno alla volta, a formare una catena complementare al filamento di DNA template, grazie all’azione della DNA polimerasi Taq polimerasi resistente al calore, derivante dal batterio termofilo Thermophylus aquaticus).
4. Termine del ciclo
Al termine del primo ciclo termico si ottengono due doppi filamenti di DNA aventi la medesima sequenza di quello originale. Ad ogni ciclo quindi il numero di filamenti che si ottengono duplica, quindi la crescita del numero di copie è esponenziale rispetto al numero di cicli (2N, con N = num. di cicli); da qui la definizione di questo processo come amplificazione della sequenza di DNA.
Primer
opportuni “inneschi”,sintetizzate artificialmente per fungere da punto di ancoraggio per la duplicazione di un filamento singolo di DNA, costituiti da brevi sequenze di DNA (oligonucleotidi) complementari alle estremità 5’ e 3’ dei due filamenti del segmento da riprodurre.
Da duplex a singoli filamenti
Denaturazione o Fusione del DNA: processo srotolamento doppia catena tramite rottura legami idrogeno tra le basi.
Denaturazione può avvenire per somministrazione di calore, ma anche grazie ad agenti chimici. Fusione solo per calore.
Temperatura di fusione
Per una miscela di più copie di molecole di DNA, si definisce una temperatura di fusione (Tm) come la temperatura a cui metà dei filamenti di DNA sono nello stato di doppia elica e metà sono invece in forma di random coil o di filamento singolo.
Quando avviene denaturazione in natura
avviene diverse volte durante il ciclo vitale di una cellula: una volta prima della mitosi per la replicazione del DNA e diverse volte per la trascrizione, in diversi punti lungo il filamento per la produzione di diverse proteine.
Quando avviene l’ibridizzazione in natura
L’ibridizzazione è necessaria dopo la replicazione e la trascrizione perché il DNA nelle cellule è normalmente in forma di doppia catena.
PCR
tecnica di biologia molecolare che permette di amplificare una (o più) porzione di DNA di diversi ordini di grandezza per generare da migliaia a milioni di copie di una particolare sequenza.
Il metodo è basato sulla ripetizione di riscaldamento e raffreddamento della miscela (cicli termici) per consentire la denaturazione e la replicazione enzimatica del DNA.
Perché gruppo viene inserito il gruppo trifosfato nel primer
A differenza dei nucleotidi naturalmente presenti nel DNA, questi di sintesi hanno non uno ma tre gruppi fosfato e sono perciò denominati dNTP (deossiribonucleotide trifosfato).
Il gruppo trifosfato è inserito perché due dei gruppi fosfato sono
necessari per ricavare energia che viene utilizzata per concatenare differenti unità l’una con l’altra in modo da sintetizzare una sequenza specifica che fungerà da primer nella PCR. (Questo processo prende il nome di ’primer preparation’).
