Brainscape's Knowledge GenomeTM

Browse over 1 million classes created by top students, professors, publishers, and experts.


See full index

Rening av biomolekyler > Tenta > Flashcards

Tenta Flashcards

1
Q

För att lysera mammalieceller

A

mild men snabb, finns proteaser! Proteiner sekreteras dock

  • cykler av frys/tining
  • Sonikering
  • kemikalier som löser upp membran, ex SDS, obs denaturerande!
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
2
Q

För att extrahera proteiner ur vävnad/växter

A

Homogenisering i mixer eller mal/mortel. Sand kan tillsättas för att det ska bli mer effektivt.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
3
Q

Metod för att lysera jästceller

A

Mycket kraft behövs.

  • French press
  • High preassure homogenizer
  • beadmills (kulor som roterar, bra på filamentös fungi)
  • Enzymers som lyserar
  • Toulen (för en der jästsorter, inte miljövänligt, denaturerar proteiner).
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
4
Q

Metod för att lysera bakterier

A

Styrka mellan jäst och mammalie. Snabbt och vid låg temp.

  • Frech press
  • High preassure homogenizer
  • Cell bomb (kvävgasbomb skapar tyckskillnad)
  • Sonikering
  • Lysosymer bryter ned peptidoglykaner
  • Detergent
  • DNAse för att lösa upp DNA:t.
  • periplasmatiska protein kan man få ut genom osmotisk chock.
  • Membraboriteuner är hydrofoba, få kan man tillsätta en detergent.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
5
Q

Metoder för klarifiering

A
  • Sedimentation mha centrifugalkraft.
  • Filtrering
  • Fällning
  • tvåfasectraktion med en hydrofob och en hydrofil fas.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
6
Q

Pros/cons med automatiserade reningssystem

A

Pros:

  • lätt att skala upp odlingen.
  • mer exakt
  • reproducerbart
  • Göra exakta gradienter
  • möjlighet till kontinuerlig analys med UV/ konduktivitet

Cons:
-dyrt, ska man bara rena lite är det bättre att göra det för hand.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
7
Q

Olika typer av analyser under odling och rening

A

För att se till att man har rätt protein, kolla renhetsgra på prov, bestämman koncentration.

  • SDS-PAGE (molekylstorlek och renhet)
  • Infärgning med Coomaisse (binder till basiska aa i sura lösningar)
  • Infärgning med silver staining (känsligare än coomaisse, men skapar “egna band”.
  • Fluorescent dyes (snabbare och enklare än silver)
  • Uv-absorption, provet kan återanvändas, 280 nm, aromatiska aminosyror.
  • nano-drom (kräver bara 2 mikroliter, ben provet förstörs)
  • Infärgning och bestämma koncentration mot standardkurve, ex lowry, bca och bradford.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
8
Q

I kromatografi, vad är stora K och hur beräknar man den?

A

Fördelningkonstant som säger hur mycket av provet som befinner sig i lösningen jämfört mot mobila fasen. Beräknas:

K = Cs/Cm

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
9
Q

Hur beräknas hastigheten för mobilfas och analyt i kromatografi?

A

u=L/tm (hastigheten för mobilfasen) L= längd på kolonn, tm = tid innan mobilfasen nådde detektorn.

v=L/tr (hastigheten för analyt, valfri) Längd på kolonn genom tid för detektion av analyten.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
10
Q

Vad är upplösning i kromatografi, och hur beräknas det?

A

Upplösningen är hur väl separerade två toppar är. bäst är om de är baslinjeupplöst, då ligger R= 1.5. Vid R=1 kan man urskilja topparna, men 1.5 är bra.

R=dt/ (1/2)*(w1+w2)

Alltså skillnaden i tid mellan de två topparna och medelbredden på topparna.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
11
Q

I kromatografi vad är retentionsfaktor och hur beräknas det?

A

retentionsfaktor = k’. Bör ligga på 7-8 för att vara optimalt. Minder än så så går analyterna för snabbt och kommer inte vara urskiljbara, mer än så så kommer man att slösa tid.

k’ = ms/mm (massan av prov i stationärfas / massan av prov i mobilfas)

kan också beräknas ur ett kromatogram:
k’ = (tr-tm)/tm

detta ändras genom typ av stationärfas, temperatur och sammansättning av mobilfas.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
12
Q

Vad är selektivitet? (kromatografi)

A

Alfa. Det aldra viktigaste, utan selektivitet så hamnar topparna ovanpå varandra. Detta är alltså avståndet mellan två toppar.

alfa = k’/k’

beror även här på temp, mobilfas och stationärfas.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
13
Q

Vard är effektivitet i kromatografi?

A

Bandbredd per tids- eller längdenhet. Alltså hur bred toppen blir. För att beräkna detta använder vi Rs.

Rs=(sqrt(N)(alfa-1)k’)/4alfa(1+k’)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
14
Q

Vad är antalet teoretisk bottnar?

A

Hur många gånger en moleky går in och ut mellan mobilfas och stationärfas. Beräknas:

N =16*(tr/wb)^2

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
15
Q

Spec med matriser för proteinrening, storleksintervall

A

Vattenbaserad buffert så att proteinerna inte denaturerar. Hydrofil matris. Mkt liten ospecifik bindnign men hög specifik. Oorg material som kisel/glas, oorganiska som cellulosa. 100 mikrometer - 10 mikrometer.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
16
Q

mikroporösa vs makroporösa matriser

A

Där gångarna inte går igenom kulorna vs där de gör det. Instabila, byggs av korslänkade molekyler.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
17
Q

Vad heter det om matriser reagerar med mobila fasen eller inte

A

xerogel vs aerogel

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
18
Q

Vad är expanded bed adsorption

A
  • Bufferten kommer in i matrisen underifrån, det skapas en koncentrationsgradient, densiteten förändras gradvis.
  • luftigt packad vilket gör att man slipper klarifiering
  • koncentration av proteinerna krävs efteråt (eller låta kulorna gå ihop igen, mindre volym = eluera med mindre vätska)
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
19
Q

Buffertegenskaper

A
  • Hydrofil
  • inte så mycket salt
  • icke-toxisk
  • hög buffertkapacitet
  • hög renhet
  • lite absorbans vid 280nm
  • stabil(så att man kan göra iordning mycket på samma gång)
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
20
Q

Vanliga tillsatser i buffert

A
  • Syra/bas (om vi räknat fel eller vill göra en buffert)
  • Salt (för att minska elektrostatiska interaktioner)
  • Antioxidant (ex DTT för att sulfidbryggor inte ska bindas)
  • Proteashämmare
  • metallbindare (inaktiverar proteaser som aktiveras av metaller)
  • Detergent (om blibbiga proteiner)
  • Stabiliserare (Glycerol, proteiner kan denatureras om de har för mkt plats)
  • bakteriehämmare (för hållbarhet)
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
21
Q

Rita upp pilarna för reningssteg. Vad mer beror separationsordningen på?

A
  • preparation (extraktion klarifiering)
  • Capture (isolera, koncentrera, stabilisera, ex iex)
  • intermediate purification (ta bort bulkorenheter, ex affinity)
  • Polishing (uppnå final kvalitet, rätt buffert, ex sec)
  • sample conditionenig, ex rätt buffert, antibakteriell osv)

Provvolym, viskositet, konc av målprotein, proteaser, DNA, pyrogener

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
22
Q

Tvätta jonbytarmatris, IMAC, proteinmatris

A
  • Stark rengöring ett kort tag, ex NaOH (lut)
  • Sen salt, NaCL (frö att få bort elektrostatiska bindn)
  • En syra över natten (ex ättikssyra)
  • regenerera till rätt pH/salthalt (för jonbytare)
  • Kanske med metalljoner(Imac)
  • buffert med pH (affinitet, dessa måste även tvättas MKT mer försiktigt)
  • Förvaras i etanol för att slippa tillväxt.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
23
Q

Olika sätt att koncentrera sitt protein?

A
  • Fäll ut med salt/pH (risk för denaturering)
  • centrifugera till pellet
  • Filtrera
  • osmos genom vattenabsorberande material, ex PEG
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
24
Q

Olika typer av buffertbyte?

A
  • Diafiltrering (ultrafiltrering flera gånger)
  • Dialys (buffertämnena diffunderar ut i större vätskevolym, membran stänger proteinerna inne, funkar bara för små vol)
  • Gelfiltrering, ex med SEC
  • Frystorka. Kan då skickas på posten. Salter försvinner inte,
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
25
Q

Andra ord för SEC

A
  • Gelfiltrering
  • molecular sieving
  • Gel permeation
  • avsaltning
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
26
Q

Rita pilarna för reningssteg

A

-Preparation (extraktion, klariefiering)
-Capture (isolera, koncentrera stabilisera)
Intermediate purification (ta bort bulkorenheter)
-Polishing (uppnå final kvalitet, fixa rätt buffert)
-Sample conditioning (rätt buffert om man inte gjort det innan)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
27
Q

Rita HPLC-apparaturen

A
  • Två vätskebehållare (ex med metanol och vatten)
  • Gradientblandare (mixar de två vätskorna)
  • Pump, eftersom mkt högt tryck
  • Injektor (hit kommer både prov och mobilfasen)
  • kolonn
  • detektor
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
28
Q

Rita Van Deemter kurvan, beskriv vad de olika termerna är

A 
H = antal teoretiska bottnar (på y-axeln)
A = eddy diffusion
B = vanlig diffusion
Cu = Cm + Cs = motstånd mot masstransport i gasfas och stationärfas
u = flödeshast (på x-axeln)

H beräknas:

H = B/u + Cu + A

Cu är linjär och ökande
A är konstant
B/u minskar exponentiellt
H ligger i tomrummet ovanför alla dessa.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
29
Q

Hur mycket prov kan man ladda på en SEC?

A
  • 1-5 % av kolonnvolymen om man ska fractionera (proteinerna måste skilja minst 30% i storlek
  • 30 % om man ska avsalta
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
30
Q

Beräkna distributionskoefficienten för SEC

A

KD = (Vr-Vo)/Vi

Vo = void volym = all vätska som får plats i kolonnen samtidigt. Alltså volymen mellan partikarna. 
Vr = Ve = elueringsvolym, den volym som används för att skölja ut proteinerna
Vt = Vo + Ve = total volym
Vi = Vt-Vo-Vmatris = porvolym
31
Q

Vad är Franctionation range?

A

Alla de storlekar på proteiner som går in i porerna i SEC

32
Q

Vad är inclusion limit?

A

Den mista storlek på molekyl som fastnar i porerna. Mindre än så kommer att sköljas ut.

33
Q

Vad är exclusion limit?

A

Det minsta protein som inte fastnar i porerna därför att det är för stort för porerna.

34
Q

Vad finns på x- och y-axlarna i ett kromatogram?

A 
x = retentionstid
y = detektorrespons
35
Q

Hur avgör man relativ mängd/konc från ett kromatogram?

A

Går inte att göra mh toppstorlek eftersom detektorn är olika bra på att detektera olika ämnen. Man måste göra en intern eller extern kalibebring med känt ämne + konc.

36
Q

Pros/cons med SEC

A

-Sämst upplösning och kapacitet, detta späder verkligen ut provet.
+ Separerar multimerer och aggregat. Kan till och med separera veckade versioner av ett protein från oveckade.

37
Q

Varför heter det anjonbytare?

A

För att innan de neg laddade proteinerna komemr dit så kommer neg laddade molekyler i bufferten att ordnas längs den stationära positiva fasen. När de neg laddade proteinerna kommer så byts den neg laddade molekylerna i lösningen ut mot de neg laddade proteinerna. Den byter alltså negativa joner, anjoner.

38
Q

Hur eluerar man från en jonbytare?

A

TIllsätter joner med samma laddning som proteinerna har, fler joner kommer föra att proteinet sköljs av, någon annan tog deras plats. NaCl är en bra grej, detta försurar inte heller bufferten. Det går också att förändra pH-värdet eftersom man då lägger till eller tar bort H+ vilket förändrar proteinets laddning (beror ju på PI), pos laddade proteiner (i surare än deras PI) binder inte till en pos stationärfas..

39
Q

starka/svaga jonbytare?

A

Har en stark vs svag syra /bas fästade till stationärfasen. Starka syror är aktiva över ett större intervall än svaga.

40
Q

Vad är kromatofokusering?

A

Gradvis förändring av pH-värdet men speciell buffert. (polybuffert) Detta gör så att man sorterar proteinerna efter deras PI-värde. Finns risk för denaturering. Högre upplösning än salter.

41
Q

Pros/cons med jonbyteskromatografi

A

-låg selektivitet, måste optimeras för varje protein

+ Lätt, hög kapacitet, stabil matris, mild eluering, stark tvätt, bra upplösning.

42
Q

Vad är z-taggen?

A

En modifierad variant av protein A från en bakterie som binder till antikroppar. Kan föras mycket positivt eller mky negativt laddade. Dessutom binder den till Fc på alla ab,s så den kan användas i stat fas för att rena för alla ab.

43
Q

I vitro vs solid phase refolding

A

Om man har skapat inklusionskroppar och löst upp dessa med urea så kommer det aggregerade proteinet också att denaturera. Om man då långsamt späder bort denaturanten kommer det förhöppningsvis att vecka sig rätt. Antingen så kan man göra detta mch z-tag fästad till matris och förändra bufferten (solid phase) eller att man har det i lösning och späder bort denaturanten (in vitro)

44
Q

Uppbyggnad av affinitetmatris

A

Reversibel bindning, förut alltid enzymers substrat, nu massa grejjer.

  • Stora porer, vi vill inte göra en ofrivillig SEC
  • ingen ospecifik bindning(kladd)
  • Spacer 6-10 kol lång är ett “handtag” som sätter fast liganden i matrisen.
  • Ligandtäthet. För tätt så kommer sterisk hindring mellan proteinerna göra så att inte allt kan binda in.
  • Så stabil som möjligt under rening.
  • Hög affinitet för att fånga och stanna upp en molekyl, låg nog för att kunna eluera.
45
Q

Olika sätt att eluera vid affinitetskromatografi.

A
  • pH (proteinets aktiva site får en annan laddn = sämre bindning till ilgand. Dock krävs pH 2-4, vissa proteiner denaturerar då!
  • salthalt (förändrar laddn utan att försura. kan dock fälla ut.)
  • Poläritet (ändrar de hydrofoba interaktionerna i aktiva siten, mild eluering)
  • Kempetitiv eluering (måste finnas i minst lika stor mängd som liganden)
  • Denaturerande ämne(sesta utvägen).
46
Q

Rengöring av affinitetsmatris

A

pulsa bindnings och elueringsbuffert. Kanske jättekort tid i lut.

47
Q

Pros/cons affinitetsmatris

A

-Känslig vid rening, dyr, ibländ krävs tupp eluering

+ mkt hög specificitet, rening och konc i ett, få reningssteg.

48
Q

Eluering IMAC

A
  • jon-jon interaktioner (alltså andra neg laddade joner, salter som tävlar ut His)
  • Immidazole, tävlar ut His.
  • sänk pH, under 7lir His pos laddat.
49
Q

Pros/cons IMAC

A

-känslig för elueringsmedel med metallaffinitet som EDTA, och reducerande ämnen DTT
+ganska specifik, kan lätt klonas, liten så den är inte i vägen.

50
Q

Rening av antikroppar

A 
Grov = fäll en del av serumet som innehållar ab.
Generell = använd en matris med protein A, L eller G  som har affinitet för Fc-delen på ab.
Specifik = använd ab-ab interaktion.
51
Q

Loop engineering för mildare eluering

A

Calciumbindande loopar har satts in i z-taggen (protein A) Dessa binder till en spec Fc-region i ab, men bara om Ca2+ finns närvarande. Alltså kan man fånga in ab med dessa i matrisen, och eluera med en mycket mildare eluering, nämligen genom att ta bort kalcium. Då behåller ab sin aktivitet.

52
Q

Vad är immunoaffinitet?

A

Tvärt om mot specifik rening av ab. En ab sitter i matrisen och dess ligand finns i provet.

53
Q

Hydrofob kromatografi kallas något annat. Vad och varför?

A

Det kallas för att salta ut ett protein. Hydrofoba interaktioner gynnas av hög salthalt i bufferten, så kan även de proteiner som inte är SÅ hydrofoba binda in. Både extremt mycket och extremt lite salt sänker lösligheten på proteinerna, så kan man salta in och salta ut på detta sätt.

54
Q

Vad är additiv?

A

Ämnen så tillsätts i en HIC-buffert för att stabilisera proteinerna så att de inte vänder sig ut och in för att lägga sin hydrofoba sida mot statfasen. Ex är Ca2+ och 10% glycerol

55
Q

Berätta om stationärfasen i HIC

A

Matriserna är oftast gjorda av korslänkade kolhydrater (cellulosa) Om det måste vara stabilare kan vi använda kisel eller syntetiska polymerer. I detta fall så vill vi ha mycket klass, vi vill ha alla de ospecifika bindningarna, därför vill vi ha en mkt opolär statfas.

56
Q

Vilka ligander kan man använda i en HIC-matris?

A
  • Halvhydrofoba, ex eter (då kan man eluera mildare)
  • Aeomatiska grupper, ex fenyl. hydrofoba och pi-orbital
  • Linjära alkaner, ex hexyl. (oftast 4-10 kol)

För stark opolär ligand kan tvinga isär proteinerna.

57
Q

Vad är anti-chautrofic? Nämn en sådan kajon och en sådan anjon

A

Vatten-strukturerande joner som hjälper inbindning av polära molekyler (saltar ut dem). Ex är Anjon: PO4 3-, katjon: NH4+

58
Q

Vad är chautrofic? Nämn en sådan kajon och en sådan anjon

A

Vatten-destrukturerande molekyler som hjälper polära molekyler att lossna från polär fas, saltar in proteinerna i lösningen igen. Anjon: SCN-, katjon: Ba2+

59
Q

Hur påverkas hydrofoba interaktioner av temperatur?

A

Hydrofoba interaktioner blir starkare när det är varmare, men man måste tänka på vilken temperatur proteinet tål.

60
Q

Hur påverkas hydrofoba interaktioner av pH-värde?

A

pH-värdet påverkar inte hydrofoba interaktioner i sig, men däremot så gör ett förändrat pH-värde så att proteinerna kan bli laddade. Och laddade proteiner är mer hydrofila.

61
Q

Vilken inbindningsbuffert använder man till HIC?

A

1 M (NH4)2SO4 är bäst, den saltar ut. pH 7.5

62
Q

Hur eluerar man proteiner ur en HIC?

A

Minskad salthalt! Det kan också hjälpa med ett lösningsmedel som etanol eller isopropanol. I värsta fall, om inget annat funkar, en denaturant. Typ urea.

63
Q

Vad använder man för CIP på HIC?

A

Något som minskar vattenstruktureringen, det saltar ju in de proteiner som har fastnat i statfasen så att de kan sköljas bort. Ex alkoholer, detergenter och kautrofiska salter.

64
Q

Vilken matris används i reversed phase chromatography

A

En som är mkt stabil både kemiskt och mekaniskt. Kisel-OH ex, på OH kan man fästa ligander. Polystyren är polär i sig själv. Måste klara mkt högt tryck!

65
Q

Vilka ligander används i reversed phase chromatography

A

Ligander upp till 18 kol! kortare för peptider dock. Fenyl för Pi:Pi.

66
Q

Berätta om reversed pahse chromatography (RPC)

A

Opolära denaturerade proteiner binder till stationära fasen så länge den mobila fasen är polär. En ökande opolär mobilfas gör sedan att de släpper. Bra för HPLC, används ofta för att rena fram syntetiska peptider, mkt stabilar protiner eller separation av peptider innan MS.

67
Q

Vad är end-capping?

A

Alla OH på Si-OH måste vara täckta för att matrisen inte ska bil polär. Men man kan inte sätta fullånga alkyner på varje plats p.g.a. sterisk hindring. Därför sätter man korta opolära kedjor där, trots att de inte kommer kunna fpnga in något protein.

68
Q

Hur påverkas RPC av temperatur?

A

Upplösningen ökar med temperatur eftersom mobilfasens viskositet minskar så att det blir bättre transport mellan mobil- och statfas.

69
Q

Hur påverkas RPC ac flödeshastighet?

A

Låg flödeshasithet leder till bättre transport mellan mobil- och statfas, men det leder också till ökad diffusion. Alltså en stak som smalnar av en en annan som breddar toppen.

70
Q

Hur påverkas RIC av pH?

A

Kiselmatriseer kan bara användas i pH-värden under 7.5, pH över detta så lossnar kopplingen till alkaner. Oftast kör man låga pH-värden för då är det lättast att förutsäga vilken lafddning proteinet kommer att ha.

71
Q

Vad är jonparning?

A

När man tillsätter en motjon som binder in till laddningarna på ett protein, men som också täcker över den laddade delen med en opolär del. Alltså gör molekylen mer opolär.

72
Q

Hur funkar Tiolmatriser?

A

De har tioler som binder kovalent till aminosyror med sulfur i sig, ex cystein. Alltså inte absorption eller adsorption! De bildar då mycket starka sidulfidbryggor. Dessa kan sedan reverseras. De flesta proteiner har cystein, så inte jättespecifik, men kan användas för att koppla ligander.

73
Q

Inbinding/eluering till tiolmatriser

A

Måste ske under reducerande förhållanden för att sulfidbryggor inte ska kunna finnas. Eluering med en reducerande buffert för att disulfidbryggorna ska släppa igen.

74
Q

Klarifiering eller fraktionering genom fällning.

A

Utnyttja kemiska egenskaper som pH-värde, löslighet i salt och temperatur.

  • Hög/låg salthalt. salting in = elektrostatisk repulsion, salting out = hydrofoba interaktioner. Använd hofmeisterserien för att avgöra detta.
  • Organiska lösningar ökar den elektrostatiska interaktionen mellan proteinter. Oftast används det vid låga temp. p.g.a. brandfarligt.
  • Lösliga polymerer dehydrerar och bildar komplex med proteinet. Ex PEG.

Rening av biomolekyler (2 decks)

Brainscape helps you reach your goals faster, through stronger study habits.
© 2024 Bold Learning Solutions. Terms and Conditions