Labbförhör

Question 1

• Hur stor andel andra proteiner (värdscellens egna) förväntar du dig intracellulärt i E.
coli? Hur skulle man kunna göra för att minska bakgrundsmängden?

Answer 1

Det finns ca 2000 andra typer av proteiner i cytoplasman, förutom detta finns 100 olika sorter i periplasman, plus en hel del membranbundna. Om proteinet är överuttryckt så kan det utgöra 40% av de totala intracellulära proteinerna. Fr att minska bakgrundsmängden skulle mankunna överuttrycka de proteine man vill ha ut, då kommer de andra automatiskt att bli färre.

Question 2

• Vad är det för andra molekyler som bör renas bort?

Answer 2

Andra varianter av målproteinet, DNA, celldebris, lipider, endotoxiner, pigment, virus.

Question 3

• Vad har lysozym för funktion under lyseringen?

Answer 3

Bryter ner peptidoglycan i cellväggen på gram-positiva bakterier. De lyseras på detta sätt.

Question 4

• Vad har DNAse för funktion?

Answer 4

Bryter ned DNA som hamnar i provet efter lysering. Utan DNA:se kan provet bli viskouöst.

Question 5

• Vad hamnar i supernatant respektive pellet under centrifugeringen?

Answer 5

Det lösliga proteinet hamnar i supernatanten, celldebris hamnar i pelleten.

Question 6

• Vad är en isoelektrisk punkt?

Answer 6

Det pH där proteinet är oladdat (alla dess laddningar tar ut varandra). Basiska proteiner har ofta pos ladd. Sura proteiner är ofta neg laddade. De flesta proteiner har ett PI inder 7. (sura). pH under PI detta så kommer proteinet att vara pos laddat, över detta kommer proteinet att vara neg laddat.

Question 7

• Vad påverkar pI för ett protein?

Answer 7

Hur många basiska eller sura aminosyror de har. Många basiska ger ett högt PI och vice versa.

Question 8

• Vad kallas den kromatografimetod som använder specifika protein:protein interaktioner
för separation?

Answer 8

Affinitetskormatografi

Question 9

• Vad bör man tänka på med en matris där ett protein som t.ex. IgG används som ligand?

Answer 9

De är mycket känsligare än ex. jonbytare och sec-matriser vid rening. För stark rengöring kan göra att proteinerna dantaurerar. Den klarar ex int för lång tid i NaOH (lut). Balansgång mellan att få rent och förstöra matrisen.

De behöver också rätt pH för att binda in, gynna interaktionen. Iland behövs en extra co-faktor för att få rätt konformation. Man kan behöva anpassa flödeshastigheten om inbindningen till ab är långsam. Ibland krävs tuffa elueringsförhållanden för att affiniteten till reningsprodukten är så bra, då finns risk att proteinet som ska renas förstörs. Mkt dyra matriser.

Question 10

• Hur kan man bryta bindningen mellan Zwt och IgG?

Answer 10

Lågt pH-värde.

Question 11

• Vilka metalljoner används vanligen för IMAC?

Answer 11

Ni2+, Cu2+ Zn2+, Co2+. Absolut vanligast med nickel.

Question 12

• Vilket pH bör du ha vid påladdning på IMAC-kolonnen?

Answer 12

IMAC slutar binda vid pH strax under 7. Då blir histidin positivt laddat och binder inte längre tilll pos metalljoner.

Question 13

• Hur kan du eluera His-taggade proteiner?

Answer 13

pH under 7.

Question 14

• Vilken sort jonbytare bör du använda om du vill rena fram ett protein i en buffert under
dess pI?

Answer 14

Under dess pI kommer proteinet att var apos laddat Därför behöver man en katjonbytare.

Question 15

• Vad bör du tillsätta vid gradient-eluering från en jonbytare?

Answer 15

EN speciell buffert (polybuffer) som ger stail och långsam pH-förändring.

Question 16

• Vad kommer att hända med proteinerna om du tillsätter urea i bufferten?

Answer 16

Urea denaturerar proteinerna, alltså förstör proteinstrukturen. Det löser också upp inklusionskroppar, men det steget sker före bufferten.

Question 17

• Vad kommer hända om du tillsätter NaOH till din buffert?

Answer 17

NaOH kommer att göra den basisk, för hög konc kommer också att denaturera prteinerna samt göra dem negativt laddade (om de inte har ett väldigt högt PI). Detta gäller om det är för mycket! Om du istället späder ut det och blandar det med NaH2PO4 så kan man skapa en bra fosfatbuffert.

Question 18

• Vad bör man tänka på när man packar en kolonn med matris?

Answer 18

Vid kolonnpackning av matris är det viktigt att undvika kanaler i packningen, i så fall kan prov “smita igenom” där. En del matriser behöver också svälla i sin buffert innan de packas, dessa kallas för xerogeler. Bubblor ska också undvikas. Detta är viktigare ju längre kolonnen är, längre kolonner påverkas mer av detta. Det kan krävas mycket buffert för att få den jämn. Tänk också på att hälla på matrisen med ett jämnt flöde och att den aldrig får bli torr!

Question 19

• Vilken matris är det viktigast att vara nogrann att undvika kanaler i när man packar:
Talon-Co2+ eller Superdex 75?

Answer 19

• Talon-Co2+ Binder His taggar.
• Superdex 75 - en matris för storleksseparation. Kan packas i stora XK-kolonner till ÄKTA systemen. 200 mm hög

Viktigare att en SEC-matris inte har kanaler eftersom man vill sortera molekylerna efter storleksordning, så att alla av samma storlek måste gå lika långsamt genom matrisen. Om någon åker genom en kanal och fastnar på något annat ställe, längre ner i matrisen så breddar detta toppen. Om IMAC:en har kanaler så spelar inte det lika stor roll, eftersom alla histaggar ska binda in förr eller senare, och det spelar ingen roll vart, eftersom alla med his-tag ändå bara ska sköljas ut i ett steg.

Question 20

• Vilka fördelar och nackdelar finns med manuell bordsrening jämfört med reningssystem
med pump och mixer?

Answer 20

Pump och mixer = ÄKTA maskiner, mixer = två eluenter som mixas så att man kan få en gradient.

Ska man bara göra en enda separation så är det betydligt bättre att använda en bordskolonn än att köpa in en äkta. (ja det är svaret…)

Question 21

• Varför är det bra att kontinuerligt mäta absorbans och konduktivitet?

Answer 21

Absorbans ger proteinhalt i provet, då vet du att du inte tappat ditt protein på vägen. Konduktivitet är salthalt. Då en kromatografi körs väljer man ofta att förändra salthalt i en gradient. Genom att mäta den ser man vilket steg man är på i elueingen, vilka proteiner som fäller ut vid vilken konduktivitet.

Question 22

• Vilka fördelar finns med att samla upp elueringen i fraktioner? Hur stora fraktioner är
lagom, vad beror det på?

Answer 22

Om man eluerar med en gradient så kan man få olika typer av proteiner i olika prov om man delar upp det i fraktioner.

Question 23

• Vilka aminosyror bidrar mest till absorbans vid 280 nm?

Answer 23

De aromatiska aminosyrorna ger mest absorbans, alltså de med aromatiska ringar.

Question 24

• Åt vilken elektrod kommer proteinerna vandra?

Answer 24

Genom att sätta till den
negativa detergenten sodium dodecyl sulfat (SDS) blir alla proteiner starkt negativa oavsett ursprungligt pI, och därigenom sker separationen främst på storlek. Eftersom proteinerna är negativt laddade, så det kommer vandra mot pluspolen

Question 25

• I vilken ände hamnar de största proteinerna?

Answer 25

De minsta proteinerna kan vandra längst eftersom de har minst motstånd i gelen.

Question 26

• Varför bör du tillsätta DTT vid klyvning med Proteas 3C?

Answer 26

DTT är en antioxidant. Utan denna kan proteinerna bygga massa disulfibryggor

Question 27

• I vilka fall bör du göra ett buffertbyte efter klyvningen?

Answer 27

Om man använder en matris som IMAC, den tål inte DTT.