Tema 4. Diseño y optimización de estructuras "coiled-coil" Flashcards
¿Qué son las estructuras coiled-coil?
Los coiled-coil son estructuras en alfa-hélice con forma de varilla que intervienen en una gran cantidad de funciones celulares. Se calcula que un 10% de las proteínas de eucariotas y procariota presentan coiled-coil o están relacionadas con ellas en su funcionamiento. Atendiendo al proteoma de levadura destaca una gran diversidad de funciones en las que intervienen coiled-coil: complejos SNARE para fusión de membranas, citoesqueleto, cinetocoro, proteínas surfactantes… Existe, por tanto, una gran paleta de funciones y estrechas interacciones con otras proteínas
Se trata de estructuras muy estables, gracias a lo cual han permanecido en la naturaleza durante millones de años. Además, son fáciles de manipular y están muy estudiadas, por lo que presentan numerosas aplicaciones a nivel de nanotecnología y biología sintética.
La unidad estructural mínima son aa, que se asocian para formar hélices-alfa (tecton). Dos hélices-alfa se enrollan entre sí para dar el coiled-coil. Varios Coiled-Coil pueden interaccionar entre sí para dar ensamblados, pudiendo llegar a un máximo nivel estructural en el que los ensamblajes de coiled-coil interaccionan con membranas o vesículas lipídicas (por ejemplo, el mecanismo de liberación de neurotransmisores está relacionado con complejos de este tipo)
¿Cómo es la estructura de los coiled-coil?
El coiled-coil está formado por hélices-alfa en sentido de la mano derecha (dextrógiros), que se enrollan entre sí también en sentido de la mano derecha. La estructura se basa en unidades repetitivas de 7 aa (héptadas) con características especiales desde la a hasta la g
En cada posición no tiene por qué haber siempre el mismo aa, pero sí que debe tener unas características físico-químicas específicas de acuerdo con su posición. De este modo, la héptada repetitiva, denotada como [abcdefg]n, cumple que:
a) Los aa de a y d son siempre hidrofóbicos
- Se encontrarán en la zona central del coiled-coil, formando un bolsillo hidrofóbico
b) Los aa de e y g suelen tener carga (+ o -), aunque no siempre
- Al formar el coiled-coil, si tienen carga pueden interaccionar entre sí mediante puentes salinos aumentando la estabilidad de la estructura
- Por la estructura del coiled-coil, los aa de e y g de una de las hélices estar inclinados con respecto a los e y g de la otra, es decir, no están a la misma altura, lo que les permite estar algo más cerca y poder formar esos puentes salinos entre ellos
c) Los aa de b, c y f están menos restringidos
d) No puede existir Gly: crearía curvas e impedimentos que destrozan la estructura de cualquier alfa-hélice
Estas hélices tienen 3.6 aa por vuelta. En las hélices alfa, las cadenas laterales de los aa siempre miran hacia el exterior
En un coiled-coil, al estar dos hélices alfa enrolladas entre sí, los aa a y d no quedan expuestos al exterior, sino que forman un bolsillo hidrofóbico
Los e y g interaccionan entre sí gracias a sus cargas (una Lys o Arg formará puentes salinos si tiene un Glu o Asp enfrente)
¿Cómo se representa un coiled-coil?
a) La N del dibujo significa que estamos mirando la hélice desde su extremo N-t (como si la viéramos desde arriba). Si hubiera un C, estaríamos mirando desde el C-t
b) Las líneas que unen los aa tienen distinto grosor. Cuanto mayor sea el grosor, más cerca están de nuestra vista, más arriba. En los dibujos anteriores la línea más gruesa es la que une g con f, por lo que g es el aa en posición N-t (El aa en posición N-t de cualquier proteína siempre es Met (o formil metionina en bacterias). Si la profe pone una representación de un coiled-coil para que se lo expliques, es posible que no te ponga una Met en el N-t, para que no sea tan fácil encontrarlo)
c) Las hélices pueden superenrollarse de dos formas:
- De modo paralelo (quedando el extremo C-t de una hélice junto al C-t de la otra, y su N-t con el otro N-t)
- De modo antiparalelo (los C-t junto a los N-t)
d) En ambas formas, una hélice alfa está generalmente desplazada con respecto a la otra, y vemos el giro al revés de la antiparalela comparada con la paralela. En la representación vemos que ambas hélices tiene una N, por lo que están en posición paralela, un N-t junto al otro. Existe poca diferencia entre Coiled-coil paralelo o antiparalelo a nivel de secuencia primaria, pero se aprecia diferencias sutiles en la estructura terciaria
e) Si al lado de cada posición hay una fila o columna de letras de aa, empezaríamos a leer desde el aa escrito más cerca de la posición
Si quiero hacer un coiled coil de 150 nm, ¿cuántos aa necesito?
Para resolver la pregunta, debemos acordarnos de que p = 0,54 (la distancia paralela al eje de la hélice alfa cuando se realiza una vuelta completa) y que por cada vuelta hay 3,6 aa. Sabiendo esto, 150 nm/ 0,54 nm para saber cuántos aa hay, y como por cada 0,54 nm hay 3,6 aa, entonces 277,7778*3,6 = 1.000 aa que serán necesarios para formar una de las hélices alfa. Pero como un coiled es un dímero superenrollado de hélice alfam serán necesarios 2.000 aa en tota
¿Cómo se forman tetrámeros y heptámeros de coiled coil?
También existen coiled coil de 3 ó 4 hélices alfa, que sí que deben tener obligatoriamente las interacciones e-g. En estas estructuras, el poro central hidrofóbico es mucho más grande. Todas las hélices pueden discurrir de forma paralela, antiparalela o mezclada, y pueden ser hélices iguales o con secuencia de aa diferente. Todo esto da lugar a muchísimas posibilidades
Las características del coiled coil pueden cambiar mediante el cambio de las propiedades físicoquímicas de sus posiciones. Lo que nos interesa de los coiled-coil en general es modificar los aa e y g para aumentar o disminuir la estabilidad y alterar la estructura del coiled coil. Por otro lado, también podemos modificar b, c y f para darles distintas funcionalidades a los coiled coil, ya que estos 3 aa son los que van a quedar expuestos
Así, por ejemplo, cambios en la hidrofobicidad de los aa inducen una mayor oligomerización. Independientemente de que existan coiled-coil en la naturaleza con tendencia a formar trímeros o tetrámeros, nosotros podemos inducir la formación artificial de tetrámeros y heptámeros a partir de dímeros, cambiando las posiciones e y/o g por aa hidrofóbicos:
a) Si cambiamos g o e por aa hidrofóbicos, inducimos la formación de un tetrámero a partir de un dímero (pasamos de un coiled coil de 2 hélices a uno de 4)
- Los residuos en posición de están normales, como en un dímero, pero el residuo en posición a sufre un pequeño desplazamiento de 26 o -26 grados, necesario para que pueda formarse el tetrámero
- En función de que posición, e o g, se haga hidrofóbica, tendremos un core a, d, g o a, d, e
En la naturaleza podemos encontrar otras estructuras muy peculiares que son excepciones a la regla general:
b) Coiled-coil interfase d-g: puede haber algunos aa electroestáticos que rompen la hidrofobicidad, pero aun así, la interfase mayoritaria es hidrofóbica, pues a pesar de la variabilidad de g, la mayoría de residuos tienden a ser hidrofóbicos
c) Coiled-coil interfase a-e: a pesar de la variabilidad de e, permite formar un core central hidrofóbico. Si g y e fueran hidrofóbicos, no se formaría un coiled-coil tetrámero sino un tetrámero parecido a un canal hidrofóbico
d) Si cambiamos g y e por aa hidrofóbicos, inducimos la formación de un heptámero a partir de un dímero (pasamos a un coiled-coil de 7 hélices)
En estas estructuras artificiales, la superficie hidrofóbica y el hueco central serán mucho mayores, pues los impedimentos estéricos de los aa darán lugar a un core hidrofóbico más expandido cuanto mayor sea la oligomerización
Nos sirven, por ejemplo, para crear estructuras que, anclándolas a una membrana, podrían servir como transportadores o poros para dejar pasar moléculas hidrofóbicas por su hueco interior
¿Cuáles son las propiedades de los coiled-coil?
1) Los aspectos relacionados con las uniones e interacciones entre las hélices en las estructuras coiled-coil están determinados por sus secuencias de aa. Por tanto, modificando la secuencia podemos modificar parámetros como:
a) El grado de oligomerización (dos o más péptidos)
b) El tamaño (2 nm a 200 nm de longitud)
c) La dirección de unión de unos con otros: paralelo si los dos empiezan por N y acaban en COOH, y antiparalelo si es una en cada dirección
d) Homo- o heterobinding: homo- si son la misma hélice, hetero- si son distintas
e) Estabilidad y rigidez (depende de la secuencia de aa u del nº de puentes salinos)
2) Propiedades fisicoquímicas: las interacciones no covalentes que se forman en los coiled-coils son sensibles a propiedades físico-químicas y cambios en el ambiente que afectan a las interacciones hidrofóbicas y electroestáticas:
a) pH: puede hacer que la proteína precipite o no, en función de su punto isoeléctrico
b) Temperatura: no es un factor muy determinante ya que estas estructuras coiled-coil son muy estables y aguantan hasta 50 ºC
c) Fuerza iónica: si tengo un péptido con muchas Lys y Arg, precipitará cuando tengo una concentración muy alta de sal
d) La adición de sal elimina el agua que solubiliza la proteína para solvatar los iones. Entonces queda una superficie hidrofóbica descubierta a través de la cual las proteínas se agregan y precipitan
e) El efecto salting out sería mayor si tenemos en posición e y g, una Arg y Glu que son aa de gran tamaño y muy electroestáticos
3) Iones metálicos
¿Cómo son los coiled coil en la naturaleza?
Los encontramos en cremalleras de leucina, que son dominios característicos de factores de transcripción
También en las espectrinas del citoesqueleto, que son agrupaciones de 3 coiled coil que forman un entramado bajo la membrana celular. Estos trímeros de coiled coil forman nudos donde se une la actina por lo que son el andamiaje del citoesqueleto y aumentan la estabilidad de la membrana. Las espectrinas alfa forman dímeros de y trímeros coiled coil como cuerdecillas y las espectrinas beta forman un entramado secuencial mediante un enganche continuo de trímeros
La kinesina, que transporta sustancias y componentes caminando sobre el citoesqueleto, contacta con los microtúbulos a través de un tallo coiled-coil. La velocidad a la que se mueve la kinesina aumenta conforme aumenta la longitud de sus coiled-coil
En la transmisión sináptica el complejo SNARE media la fusión de la vesícula presináptica con la membrana citoplasmática, permitiendo la exocitosis de neurotransmisores. SNARE está formado por 4 coiled-coil diferentes
Los virus también usan coiled-coil para transferir su contenido al interior celular. A pH neutro, en el virus de la gripe las hélices alfa están protegidas por un capuchón de estructuras beta. Cuando la estructura viral llega al lisosoma, el cambio de pH ácido altera la capucha, el coiled-coil se estira y abre un poro de fusión en el endosoma y permite la salida del material vírico al citoplasma
¿Cómo se puede modificar los coiled-coil?
Hay muchas funciones basadas en coiled-coil. Como se conoce la estructura 3D de todas ellas, se han estudiado sus características y qué aa dan una funcionalidad u otra
Desde 1.950, los científicos estudian la naturaleza de los coiled-coil mediante ingeniería inversa: estudian la forma y función de las proteínas y, a partir de ellas, determinan las secuencias de aa para obtener las reglas del autoensamblaje de proteínas, lo que ha permitido el diseño de péptidos de novo, produciendo estructuras de forma y función nuevas. Es decir, que tras estudiar la estructura los científicos analizaban los resultados de determinadas modificaciones de aa para establecer un patrón que prediga la formación de dímeros, tetrámeros, heptámeros u otras estructuras
En ingeniería de proteínas, los coiled-coil son buenos candidatos para el autoensamblaje de nanoestructuras biosintéticas funcionales porque:
1) Tienen un tamaño y forma muy precisa, varillas de 2 nm de diámetro (anchura) con cada héptada de más o menos 1 nm de longitud. Se pueden crear varillas biológicas y añadirles funcionalidades como la colocación de una sonda fluorescente
2) Las interacciones inttra- e interhelicoidales no covalentes se conocen relativamente bien
3) Se pueden autoensamblar en estructuras estables a bajas concentraciones (por debajo del orden de nanomolar)
4) Pueden ser funcionalizados en sus extremos N o C, o en sus aa solubles expuestos, es decir, pueden ser modificados en sus radicales con distintos grupos funcionales. Excepto el enlace del C alfa (del enlace peptídico), el resto de interacciones son por puentes de H
5) Puedo jugar con la afinidad y especificidad de la unión de los coiled coil cambiando determinados aa de la secuencia. Por ejemplo, crear un biosensor (un coiled coil de alta afinidad)
Por ejemplo: en relación con este último punto, el alterar los pares hidrofóbico/polar de las repeticiones de héptadas de los coiled-coil puede generar variedad de estructuras. Ya hemos mencionado estas modificaciones antes (podemos crear tetrámeros y heptámeros cambiando e y/o g por aa hidrofóbicos) pero vamos a ver modificaciones más específicas:
Tenemos dos variantes de un factor de transcripción GCN4, con estructura en cremallera de leucina de levadura, con aa hidrofóbicos en e o g. En la naturaleza en a y d a veces se encuentran aa no hidrofóbicos, de todas maneras, la mayoría tienden a la hidrofobicidad. Observamos que, aunque todas las modificaciones han dado lugar a tetrámeros, las orientaciones y alineamientos axiales varían según la sustitución realizada:
a) Poniendo valinas en la posición e, se forma un tetrámero paralelo
b) Poniendo valinas o alaninas en la posición g, se forma un tetrámero antiparalelo 2 a 2
c) Poniendo alaninas en e y g, se forma un héptamero paralelo, con un gran radio interno superhelicoidal. Esta estructura posee un canal continuo hidrofóbico a través del core coiled-coil debido a que una hélice alfa se desplaza sobre la otra, así para las 7
d) Poniendo fenilalaninas en todos los a y d, nos da un pentámero paralelo
e) Cambiando algunas de esas fenilalaninas por metionina nos da un tetrámero paralelo
De esta forma, observamos como la variabilidad de aa da lugar a muchas estructuras distintas debido a las propiedades físicas y químicas de los radicales, y al tamaño de estos
El proceso se hace a la inversa. Primero se predice informáticamente qué cambio estructural va a producir el cambio de secuencia, y después se reproduce experimentalmente y se compara la predicción con la estructura resultante determinada por rayos X
¿Ejemplos de coiled coil con materiales biohíbridos?
1) Actualmente se están usando para llevar fármacos a sitios celulares específicos. Por ejemplo, podemos engancharle unja hélice de coiled coil a un Ac que reconozca receptores, sobre expresarlos en células cancerígenas, y tras incubar, las células cancerosas quedarán con el Ac + la hélice pegado a su superficie. Si ahora añadimos una droga que lleva enganchada otra hélice de coiled coil adecuada, esa hélice podrá unirse (por reconocimiento entre coiled coil) a la hélice que llevaba unido el Ac, y formarán un coiled coil gracias a la afinidad entre las hélices. De este modo, la droga solamente llegará a las células cancerígenas que habían sido reconocidas por el Ac, y la droga será endocitada por la célula y la matará
2) Purificación de proteína. Tenemos una columna de alta afinidad con una resina a la que hemos acoplado una de las hélices. También hemos creado una proteína recombinante en bacterias, y a esa proteína le hemos fusionado una hélice
Cuando genera mi proteína en bacterias, las lise, y las haga pasar por la columna de afinidad, solamente mi proteína de interés, con la hélice, quedará retenida al formar el coiled-coil en la columna al unirse a la hélice unida a la resina
Precaución: no debe haber competencia, si mi proteína expreso en E. coli, hay que evitar que compita, es decir, mi proteína no debe ser una estructura que exista en E. coli, porque si ese fuera el caso, se formaría el coiled coil con la proteína endógena de E. coli, por lo que hay que usar una combinación de secuencia lo más lejana posible para que no se una a nada de E. coli
Finalmente, eluyendo por NaCL (la interacción es electroestática), mi proteína se disocia de la columna purificada
3) Marcaje de proteínas específicas
Podemos utilizar de nuevo un heterodímero que nos permita marcar un dominio extracelular de las proteínas de la superficie de la célula (por ejemplo, un receptor de estrógenos) una de las hélices del heterodímero se conjuga o se une con una molécula de estrógeno o con estructura similar; mientras que a la otra hélice se une una sonda fluorescente
Tras incubar, las moléculas de estrógeno se unirán a sus receptores arrastrando con ellas una de las hélices, y por estabilidad y gran afinidad que existe con la otra hélice marcada con fluorescencia, se formará un coiled-coil
Por tanto, la fluorescencia solamente se observará en aquellas células que posean los receptores de estrógeno
4) Para formar superficies y ensamblados de nanopartículas
En este caso lo que se hace es utilizar las propiedades de las hélices alfa para favorecer el autoensamblaje de partículas de oro
Para ello, unas partículas se modifican con una de las hélices del heterodímero, y con la otra hélice se añade a otro conjunto de partículas. Al mezclarlas, las hélices interaccionan formando coiled-coil y se constituye un entramado de partículas
Normalmente, se emplean partículas de oro coloidal por ser un material muy poco reactivo
5) Biosensores
Un biosensor es un instrumento para medir parámetros biológicos o químicos. En este caso, nos basamos en la capacidad de los heterodímeros para capturar y unir proteínas a determinadas superficies
Los heterodímeros pueden emplearse en la construcción de biosensores de SPR (resonancia de plasmón superficial)., En un SPR, el ligando se inmoviliza en un chip cubierto con una capa de oro
La novedad de estos biosensores de SPR es que en este caso el chip permite estudiar interacciones biológicas:
a) Una de las hélices la habremos unido a la superficie del chip
b) La otra hélice se emplea para inmovilizar determinados componentes biológicos o ligandos al chip (gracias a la formación del coiled-coil)
c) A continuación, se hace pasar un flujo con un conjunto de analitos que podrán o no interaccionar con el ligando inmovilizado y de esta manera podremos estudiar su afinidad y otros parámetros relacionados con su interacción
También se usa para cribados de antígenos y anticuerpos, para vacunas sintéticas…
6) Bloques de polímeros
Los copolímeros de bloques son macromoléculas formadas por dos o más bloques poliméricos unidos, principalmente, mediante uniones de tipo covalente
En este caso podemos utilizar coiled-coil ancladas a moléculas como el polietilenglicol (PEG) para favorecer el autoensamblaje de los monómeros y construcción de un bloque, malla o soporte a los que podemos añadir nutrientes, fármacos… para utilizarlos, por ejemplo, en medios de cultivo para la regeneración de tejidos. El autoensamblaje y la estabilidad del bloque dependerá y podré manipularlos en función de:
a) La Temperatura
b) El pH
c) La longitud de los péptidos del heterodímero
d) etc
7) Hidrogeles
Los hidrogeles son estructuras tridimensionales formados por polímeros reticulados, capaces de absorber gran cantidad de agua y de proporcionar un microambiente acuoso muy similar al de la matriz extracelular. Se usan en cultivos de tejidos para su regeneración…
Podemos emplear la flexibilidad y sensibilidad de las estructuras coiled-coil para construir estos hidrogeles, cuya composición y estabilidad dependen de estímulos que afectan a las coiled-coil: pH, temperatura, fuerza iónica…
Estos hidrogeles tienen interés en la liberación controlada de sustancias, así como aplicaciones en ingeniería de tejidos
8) Proteínas multivalentes
A veces al hacer un ELISA cada Ac tiene que reconocer un Ag. Si a cada Ac le coloco una hélice, estoy amplificando la señal, porque se unirán entre sí y darán estructuras como la de la imagen, capaces de detectar hasta 4 Ag. Así, se consigue aumentar la sensibilidad, y puedo detectar niveles de Ag bajísimos. Los sistemas de detección pueden ser realmente muy eficientes y eficaces para diversas funciones tales como amplificar la interacción Ac-Ag o secuestrar microvesículas
