Tema 1. Introducción Flashcards
¿Qué es la Ingeniería de Proteínas?
Son los procesos por los que la función y estructura proteíca se modifican o crean in vitro mediante la alteración de los genes estructurales o sintetizando nuevos genes. Dichos genes dirigen la síntesis de las proteínas con funciones deseadas
¿Qué pueden incluir estos procesos?
El diseño de modelos moleculares de proteínas, mutagénesis sitio-específica de genes existentes y técnicas dirigidas de evolución molecular para crear nuevos genes
¿Cómo se puede estudiar en Ingeniería de Proteínas?
Atendiendo a 2 aproximaciones:
- El diseño racional
- La aproximación aleatoria
¿Qué es el diseño racional?
El diseño racional determina la estructura y luego la secuencia de una proteína a partir de su función conocida
¿Qué es la aproximación aleatoria?
También llamada diseño irracional, intenta crear una secuencia que forme la estructura que lleva a cabo la función deseada. Se usa para casos en los que no se conoce con certeza una cierta función, estructura o secuencia
¿Cuándo se utiliza el modelo racional?
Cuando se conoce la estructura 3D de una proteína y su secuencia, en el caso de que no se conozca la estructura, se puede hacer uso de los programas de computación con el fin de conocerla.
¿Qué se utiliza en el modelo irracional?
Se usa la genética jugando con la aleatoriedad, hasta conseguir el fin deseado, en ella conozco la secuencia, pero no la estructura ni la función, por lo que se muta el gen aleatoriamente, generando librerías, y mediante la experimentación podremos obtener una proteína cuya función corresponda con la que nos interesa
¿Se usa más la racional, la aleatoria, o ambas?
Ambas
¿Qué es la mutagénesis dirigida?
Consiste en cambiar un aa por otro en una posición de la secuencia silvestre de una proteína.
¿Cuál fue la primera proteína a mutagénesis dirigida?
La tRNA sintetasa, enzima encargada de acoplar el aa correspondiente a cada tRNA. La enzima tiene un centro activo, el cual debe reconocer un solo aminoácido y distinguir entre cada uno de los tRNA
¿Cuál es la reacción que catalizan las aminoacil-tRNA sintetasas?
Comienza con la formación de un enlace éster con e -OH del extremo 3’ del tRNA y el grupo carboxilo del aa. Se forma así el aminoacil-AMP. Este intermedio no abandona la enzima. Entonces, se puede dividir a las tRNA sintetasas en dos grupos:
- Grupo I (transfiere el aa al OH-2’, libera AMP y transesterifica hasta el OH-3’)
- Grupo II (transfiere el aa al OH-3’ directamente y libera AMP)
¿Qué es el centro de acilación y el centro de edición?
Para aas que se diferencian mucho entre sí, basta con el centro de acilación para discriminarlos. Para aquellos que son parecidos, la enzima posee además un centro de edición con actividad hidrolítica para liberar el aa incorrectamente unido
¿Por qué era importante el Asp 176?
Para fijar el sustrato al centro activo, ya que sin él podrían entrar otros aas parecidos en volumen a la Tyr, como la Phe. Por eso, la especificidad la provee el Asp interaccionando con Tyr
¿Cómo se comprobó la especificidad del Asp 176?
Se intercambió el Asp por Asn, y se observó que esta mutación no producía cambio en la estructura de la proteína pero sí en la función, pues ya no existe tanta especificidad
¿Qué se vio en la Thr40 e His45?
Que disminuían la velocidad de la reacción y la actividad de la enzima, esto se debe a que estos aas interaccionan con el fosfato gamma, estabilizando el ATP.
¿Qué se vio en la Thr51 y la Cys35?
Son claves para formar puentes de hidrógeno con el anillo de ribosa de la Tyr-ATP
¿Existe un subcódigo genético?
Sí, se encuentra en las tRNA sintetasas, ya que estas son específicas para cada aa, por lo que la modificación de las sintetasas nos permite crear nuevas proteínas con aas no naturales. Un ejemplo de esto sería la síntesis de nuevos fármacos
¿Qué conlleva el conocimiento de los aas más implicados en la función del enzima?
Múltiples aplicaciones. Podemos ir variando esos aas hasta encontrar unos que provoquen un aumento de la actividad y velocidad de la reacción, o el reconocimiento de aa-ATP diferentes. Se puede hacer por diseño racional (conociendo los aas, cambio solo esos, menos experimentos) o mediante aproximación aleatoria (cambio de forma aleatoria, mucho más difícil). Debe ser un compendio de ambas
¿Por qué debe ser un compendio de ambas?
Porque la forma aleatoria ofrece ventajas y sorpresas, y a la vez es necesario la racional para disminuir la cantidad de mutantes que se someten a estudio
¿Qué es la hemoglobina?
Es un tetrámetro que une cuatro O2, uno en cada subunidad.
¿Qué regula la afinidad del O2 por la hemoglobina?
La presión parcial de O2, CO2, pH, BPG…
¿Qué se usa como sustituto a las transfusiones de sangre?
La Hb purificada, ya que es un aporte de O2 inmediato, pero su uso conlleva dos problemas
¿Qué dos problemas conlleva el uso de Hb purificada en transfusiones de sangre?
- Afinidad por O2. La Hb purificada no es regulable por BPG. La hemoglobina purificada tiene mucha más afinidad por el O2 que en un sistema silvestre con células, por lo que al llegar a los tejidos no libera suficiente cantidad de O2 y no nos sirve.
- Estabilidad del tetrámero. En la hb purificada, la interacción entre la cadena alfa y beta es muy estable, pero los dímeros no se unen bien entre sí para formar el tetrámero, y tiende a desensamblarse. Las subunidades separadas pueden atravesar los poros del riñón y eliminarse por la orina
¿Solución para el primer problema?
Las personas que sufren anemias hereditarias sintetizan una Hb con poca afinidad por el O2, debido a que en vez de Asp108 tienen Lys108. Podemos hacer uso de esta mutación
¿Solución para el segundo problema?
Producir la hemoglobina de forma recombinante mediante dos plásmidos: uno con subunidad alfa y otro con beta. Luego, se puede crear un linker de aas que altera la estructura ni la función, pero consigue unir la dos subunidades alfa formando el tetrámero estable. Todo esto se realiza mediante ingeniería genética
¿Cuántos mAc se han creado mediante ingeniería de proteínas?
Hasta 30
¿Qué es mAc humanizado?
Es un Ac que contiene un 90% de material humano, lo que reduce la inmunogenicidad de los Ac, es decir, el rechazo del SI. En estos Ac, las regiones estructurales se obtienen de un anticuerpo humano, que sirven de soporte estructural al paratopo, mientras que las regiones responsables de la unión al Ag proceden del Ac del ratón
¿Qué nos permite la técnica de los mAc humanizados?
Crear Ac que reconozcan el Ag que deseemos y permite la obtención de Ac evitando el uso masivo de animales
¿Qué se hace en la actualidad con este técnica?
Se crean librerías de Ac y se enfrentan al antígeno en distintos fagos, por lo que también se reduce el número de animales usados en los estudios
¿Cómo podemos conocer laas modificaciones de un Ac?
Mediante espectrometría de masas, lo que permite realizar cambios sobre la molécula, es decir, obtener un producto con una mayor actividad y eficiencia
¿Cómo se obtiene la insulina comercial?
En forma de proteína recombinante. Cuando se determinó su estructura, se vio que formaba hexámeros pero el cuerpo solo la reconoce cuando está en forma monomérica, por lo que nos interesa evitar ese cambio conformacional.
¿Quiénes son los encargados de la hexamerización de la insulina?
La Lys29 y la Pro28. Si una persona necesita un aporte rápido de insulina, podemos mutar esos aas para conseguir una insulina de liberación rápida.
¿Qué hay que hacer si queremos que la insulina perdure en la sangre para mantener el nivel azúcar en homeostasis todo el día?
Podemos acetilar la insulina incorporándole un ácido graso en la Lys29, para que interaccione con la albúmina y ésta la mantenga en el torrente durante mucho tiempo. Conseguimos así una insulina de liberación lenta
¿Qué es Ispro?
Mediante la mutación de 2 aas sse obtuvo monómeros, se trata de insulina rápida para después de las comidas. Este tipo de insulinas están actualmente muy conseguidas
¿Qué es Glargine?
Es un dímero el cual se esterifica con un ácido graso y este, asy vez, se une en sangre a la albúmina, permitiendo su liberación lenta, y mantener los niveles de glucosa en sangre por más tiempo. Para este tipo de insulina es necesario más estudio
¿Qué es Tresiva?
Posee un enlace amina que estabiliza la molécula, es una insulina de liberación lenta
¿Qué es Eli Lily?
Es una proteína pegilada que posee graves efectos hepatotóxicos, por lo que no es apta para su uso médico
¿Qué es Embrel?
Es un bloqueador de TNF (factor de necrosis tumoral) y se usa como tratamiento de la artritis reumatoide. Este factor produce una reacción exacerbada en la célula, la cual provoca graves daños celulares cuya respuesta final es la síntesis de autolisinas. Esta enfermedad se caracteriza por el proceso inflamatorio que se produce, el cual es consecuencia de la producción de autolisinas.
¿Solución con Embrel?
Crear un bloqueador del TNF mediante la producción de una proteína que estaba formada por el ensamblaje de la región constante de una Ig humana (que permite que sea estable), unido mediante un hinge (bisagra) a una porción antagónica del TNF, permitiendo su unión al TNF, y por lo tanto, el freno del proceso de artritis reumatoide al impedir la apoptosis celular
¿Qué es Keytruda?
Es un fármaco importante en la actualidad, pues produce la disminución de determinados tumores sólidos
Una célula / linfocito T interacciona con una célula presentadora de Ag (APC), empieza a dividirse y da lugar a una célula T con Ac específicos, este proceso debe de estar regulado, sino, se puede dar lugar a una leucemia por sobreexpresión de linfocitos. La regulación se basa en la interacción entre PD-1 y PD-L1, que actúa como señal inhibitoria del proceso de división
En células cancerosas de determinados tipos de cáncer aumenta la síntesis de PD-L1 y 2, lo que tiene como consecuencia el freno de la división de linfocitos T y no hay respuesta inmune contra las células cancerosas
Solución: diseñar un Ac que bloquee a PD-L1, permitiendo la respuesta inmune frente a células tumorales. Es un tratamiento exitoso en cánceres de próstata, vejiga, melanomas y algunos cánceres de pulmón. Es imposible modificar proteínas en todas sus combinaciones posibles, por lo que es recomendable usar técnicas inteligentes de cribado
¿Por qué 3 métodos podemos conocer el plegamiento de una proteína?
Cristalografía de rayos X, RMN y Cryo-EM.
