Tema 15. Virus de procariotas. Bacteriófagos Flashcards
1
Q
¿Qué son los bacteriófagos?
A
Son las entidades biológicas más abundantes de la biosfera. Se estima que hay 10^31 viriones y una relación fago:bacteria del 10:1.
2
Q
¿Qué hizo Frederick Twort?
A
En 1915, observó que las células de Staphylococcus eran lisadas por una sustancia que denominó agente bacteriolítico, capaz de atravesar filtros de porcelana.
3
Q
¿Qué hizo Felix d’Herelle?
A
En 1917, descubrió que la bacteria causante de la disentería, Shigella dysenteriae, era lisada por filtrados de bacterias libres de células.
Interpretó que se trataba de un virus: bacteriophagium intestinalle.
4
Q
¿Pueden afectar los bacteriófagos a los humanos?
A
No, ya que no presentan los receptores específicos para ello.
5
Q
¿Cuáles son las características de los bacteriófagos?
A
- Ampliamente distribuidos en la naturaleza.
- Esencialmente no se diferencian de otros virus, simplemente tienen otro hospedador.
- Importantes modelos en biología molecular. Es un parásito muy simple, con un hospedador unicelular.
6
Q
¿Cómo es el ácido nucleico de los bacteriófagos?
A
Principalmente dsDNA, pero también pueden ser de ssDNA, dsRNA o ssRNA.
7
Q
¿Cómo es la cápsida de los bacteriófagos?
A
Mayoritariamente es compleja, icosaédrica y helicoidal.
8
Q
¿Cómo es la envoltura de los bacteriófagos?
A
No suelen presentarla.
9
Q
¿Cómo puede ser la interacción con el hospedador?
A
Lisogénica o lítica.
10
Q
¿Cuáles son los fagos virulentos?
A
Son aquellos que establecen una relación lítica.
11
Q
¿Cuáles son los fagos atemperados?
A
Son aquellos capaces de llevar a cabo una relación lítica o lisogénica.
12
Q
¿Cómo es la relación lisogénica?
A
El DNA se integra en el genoma del hospedador, esperando a su oportunidad para lisar la bacteria. Pueden pasar varias generaciones antes de que actúe.
13
Q
¿Cómo es el fago M13?
A
Presenta una estructura filamentosa con proteínas que les permite reconocer el sitio al que se unen en la Escherichia coli para infectarla. Presenta un filamento flexuoso.
Presenta DNA de cadena sencilla.
14
Q
¿Cómo es el fago phi-X174?
A
Fue el primer genoma secuenciado por Sanger. Presenta estructura de icosaedro y proteínas en la espícula.
Afecta a Escherichia coli.
15
Q
¿Cuáles son las fases de la infección lítica?
A
- Adsorción.
- Penetración.
- Replicación.
- Maduración.
- Liberación.
16
Q
¿Qué ocurre durante la replicación?
A
La síntesis de proteínas tempranas y la replicación del ácido nucleico.
17
Q
¿Qué ocurre durante la maduración?
A
La síntesis de proteínas tardías codificadas en el genoma del fago y el ensamblaje de los viriones.
18
Q
¿Cómo es la adsorción?
A
Es altamente específica, determina el rango de hospedadores o especificidad.
19
Q
¿A qué se debe la especificidad de la adsorción?
A
- Las estructuras de fijación en virus.
- Los receptores específicos en bacterias.
20
Q
¿Qué estructuras de fijación en virus se ven implicadas en la adsorción?
A
- Los componentes de la cola, generalmente las fibras caudales. Se ha demostrado la importancia de estas estructuras de dos formas: adición de anticuerpos contra las fibras para prevenir la adsorción y las fibras de la cola aisladas se fijan a las bacterias.
- Las proteínas piloto en pentones de icosaédricos sin cola y en uno de los extremos en fagos filamentosos.
21
Q
¿Cómo es el fago M13?
A
Es un bacteriófago filamentoso que infecta solamente a estirpes F+ (machos) de Escherichia coli. En un extremo posee cinco copias de la proteína P3, que específicamente se une al pelo sexual F.
22
Q
¿Cuáles son los receptores específicos en bacterias implicados en la adsorción?
A
- Pared celular: LPS, ácidos teicoicos, proteínas (en el fago T1 a proteínas de transporte de hierro y en las gamma a proteínas de transporte de maltosa.
- Pili en células F+.
- Flagelos.
- Cápsulas.
23
Q
¿Cuál es el receptor LamB?
A
Es una porina que utiliza Escherichia coli en el intestino para incorporar maltosa como nutriente.
24
Q
¿Cuáles son los receptores celulares para bacteriófagos de Salmonella?
A
- Liposacáridos.
- Porinas para moléculas pequeñas.
- Bombas de eflujo multidrogas.
- Apéndices flagelares.
25
¿Cómo es la penetración?
Es una separación física de la cápsida y el ácido nucleico llamado decapsidación.
26
¿Quién descubrió la penetración?
Hershey y Chase en 1952.
27
¿Qué métodos de penetración existen?
1. Introducción del dsDNA por inyección.
2. Lisozima del fago debilita la pared celular bacteriana.
28
¿Cómo es la penetración del fago Lambda?
Reconoce el receptor de la maltosa de E. coli, que tiene un poro, a través del cual introduce el DNA.
29
¿Cómo es la penetración del fago phi-X174?
Se forma un tubo transitoria (tubo H) por oligomerización de subunidades de una de las proteínas de los pentones.
30
¿Cuáles son las funciones de las proteínas tempranas?
1. Reparan envoltura celular.
2. Detienen replicación y síntesis proteica celular.
3. Promueven la síntesis proteica viral.
4. Promueven la replicación viral.
31
¿Cómo reparan la envoltura celular?
Con proteínas que sellan los orificios por los que ha entrado el dsDNA.
32
¿Cómo detienen la replicación y la síntesis proteica celular?
- Inactivan RNA-polimerasa del hospedador por fosforilación o ADP-ribosilación (transferencia desde el NAD).
- Impiden que el DNA bacteriano se desenrolle.
- Degradan el DNA bacteriano respetando el vírico (DNA-sas).
- Promueven la síntesis de nuevos tRNAs.
33
¿Cómo promueven la síntesis proteica viral?
- Formación de RNA-polimerasas propias.
- Formación de factores específicos para transcripción.
- Síntesis de nuevos tRNAs para tripletes propios, para favorecer la transcripción de los genes en el genoma del virus. Se basa en la degeneración del código genético.
34
¿Cómo promueven la replicación viral?
- Síntesis de precursores de ácidos nucleicos: enzimas que fabrican 5-hidroximetil-citosina (protegen frene a enzimas de restricción) y enzimas que degradan precursores normales (dCTP).
- Formación de replicasas propias.
35
¿Cómo regula la síntesis de proteínas tempranas/tardías el fago T7?
Utilizando RNA-polimerasas distintas.
- Genes tempranos: transcritos por RNA polimerasa del hospedador. Entre las proteínas que se sintetizan se encuentra una RNA polimerasa vírica y una proteína que inactiva la RNA polimerasa del hospedador.
- Genes tardíos: transcritos por RNA polimerasa vírica, sintetizando proteínas tardías.
36
Demostración experimental utilización de distintos RNA polimerasa
La RNA polimerasa del E coli es inhibida por la rifampicina, que afecta a la subunidad beta del hospedador, bloqueando la transcripción.
- Síntesis de mRNAs tempranos: sensibles a rifampicina.
- Síntesis de mRNAs tardíos: insensible a rifampicina.
37
¿Cómo regula la síntesis de proteínas tempranas/tardías el fago T4?
Utilizando factores de reconocimiento distintos. Siempre se emplea el RNA polimerasa del hospedador.
- Factor sigma inicial permite sintetizar los genes tempranos. Entre las proteínas sintetizadas encontramos factores sigma víricos que permiten que la RNA polimerasa bacteriana reconozca específicamente genes medios y tardíos.
- La síntesis de los genes es sensible a la rifampicina.
38
¿Qué característica tiene el DNA bicatenario lineal de los fagos?
Suelen tener extremos redundantes, es decir, zonas repetidas en los extremos.
39
¿Cómo es la replicación del dsDNA lineal?
Es el caso del fago T7. Tiene extremos redundantes, pero con moléculas no permutadas.
- Llega un momento en el que no tiene cebador, por lo que queda una cadena sencilla en los extremos (útiles los extremos redundantes).
- Quedan extremos con huecos, que se unen para dar lugar a un concatémero con extremos redundantes.
40
¿Cómo es la replicación del dsDNA circular?
Es el caso del fago Lambda. Son moléculas permutadas.
Se considera una replicación bicatenaria (modelo del circulo rodante), ya que se circulariza el genoma cuando entra en la bacteria: extremos cohesivos que se unen por ser complementarios.
Una de las cadenas se replica continuamente y otra va haciendo fragmentos de Okazaki.
El resultado es un concatémero con muchas copias del genoma.
41
Extremos redundantes
Extremos bicatenarios repetidos, con la misma secuencia.
42
Extremos cohesivos
Extremos monocatenarios con secuencias complementarias.
43
¿Cómo es el procesamiento de concatémeros en el fago lambda y T7?
Hay una enzima de restricción que reconoce sitios concretos haciendo cortes sesgados.
- Mecanismo: reconoce secuencias específicas.
- Resultado: moléculas no permutadas, pero con extremos cohesivos (fago lambda) y redundantes (fago T7).
Los extremos cohesivos tienen 12 pares de bases.
44
¿Cómo es el procesamiento de concatémeros en el fago T4?
El reconocimiento se lleva a cabo por la longitud del DNA maduro (es independiente de la secuencia).
Resultado: moléculas permutadas con extremos redundantes.
45
¿Qué procesos ocurren durante la maduración?
1. Síntesis de proteínas tardías.
2. Ensamblaje de los viriones.
46
¿Cuáles son las proteínas tardías?
- Proteínas estructurales del fago.
- Proteínas de procesamiento: proteasas.
- Proteínas de ensamblaje: proteínas andamio ("Scaffolding proteins") para ensamblar la cabeza.
- Proteínas para la lisis celular.
47
¿Cómo es el ensamblaje de los viriones?
Se conoce bien en fagos T4.
Tres líneas independientes de autoensamblaje: una para las fibras caudales, otra para las colas y otra para las cabezas.
48
¿Cómo se conoce la función de los distintos genes?
Se utilizan mutaciones letales condicionales.
49
Mutaciones letales condicionales
- Temperatura permisiva: 25ºC (viable). El producto adopta la conformación funcionalmente activa y no se expresa la letalidad.
- Temperatura restrictiva (37-42ºC). Afecta por lo general a la conformación de la proteína (inviable). El producto no adopta la conformación funcionalmente activa y se expresa la letalidad.
50
¿Gracias a que se produce la lisis celular?
A dos proteínas del fago:
- Endolisina: degrada el peptidoglicano.
- Holina: afecta a la membrana. Provoca lesiones que detienen la respiración celular y poros que permiten el acceso de la endolisina a la pared celular.
51
¿Qué otro método de liberación hay?
Algunos fagos, como los filamentosos (ssDNA) se liberan por extrusión.
Se acumulan monómeros de proteína P8 en la parte externa de la membrana, permitiendo la unión del fago con la proteína una vez se produce la inyección a la célula.
52
¿Qué fagos se liberan por extrusión?
Fago M13: E coli.
Fago Pf1: Pseudomonas aeruginosa.
53
The One-Step Growth Curve
Experimento de Delbruck y Ellis en 1939.
Observaron como funcionaba la infección del fago T2 sobre la bacteria E coli. Se dieron cuenta que la infección, su multiplicación ya aparición en el sobrenadante sigue una curva de multiplicación.
54
¿Qué características tiene la relación lisogénica?
- No se toma el control de la célula.
- No se multiplican.
- No destruyen el hospedador.
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¿Cómo son la mayoría de bacteriófagos?
De tipo atemperado: relación lítica y lisogénica.
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¿Qué pruebas avalan las ventajas de la lisogenia?
- Privación de nutrientes favorece la lisogenia.
- La infección múltiple favorece a la lisogenia.
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Características del fago lambda
- Hospedador: E coli.
- Ácido nucleico: dsDNA. Tiene 48490 bp y extremos cohesivos.
- Cabeza icosaédrica.
- Cola no-contráctil (cuando infecta a la bacteria no se contrae): flexible, sin vaina, una fibra en extremo y fibras caudales.
- Interacciona con un receptor de maltosa: LamB maltoporina.
58
¿Quién descubrió el fago lambda?
Joshua y Esther Lederberg en 1950.
59
¿Cómo se organiza el genoma del fago lambda?
- Módulo regulatorio: se toma la decisión entre la lisogenia y la lisis.
- Módulo de replicación: componentes para la replicación del DNA.
- Módulo de lisis: destrucción de la célula hospedadora (gen S y R).
- Módulo de cabeza: proteínas estructurales de cabeza.
- Módulo de cola: proteínas estructurales de cola.
- Módulo de recombinación: integración/escisión en lisogenia (gen xis y int).
- att (attachment): donde se produce la recombinación.
60
¿Cómo se produce la expresión del módulo regulatorio?
- Gen cI: codifica el represor cI.
- Gen cII: codifica para la proteína reguladora cII (activador transcripcional).
- Gen cIII: codifica para la proteína estabilizadora cIII (inhibe la proteolisis de cII).
- Gen cro: codifica para el represor cro.
- Promotor PL: control de la expresión de genes de la banda izquierda.
- Promotor PR: control de la expresión de genes de la banda derecha.
- Promotor PRE: controla el establecimiento del represor cI (establishment).
- Promotor PRM: controla el mantenimiento del represor cI (maintenance).
61
¿Qué ocurre en el módulo de regulación cuando entra el materia genético a la célula hospedadora?
Se inicia simultáneamente la transcripción a partir de dos promotores:
- PR: genes cro y cII -> represor cro y activador cII.
- PL: gen cIII -> proteína cIII.
62
Función proteína cIII
Protege a la cII de la degradación proteolítica por la proteasa Hfl del hospedador.
63
¿Qué hace el activador cII?
Inicia la transcripción desde el promotor PI (protegido por cIII) generando un transcrito con los genes int y xis, del que solamente se traduce el gen int para dar lugar a la enzima integrasa, por si se opta por lisogenia.
64
Decisión lisogenia o lisis
- Predomina el represor cI: lisogenia.
- Predomina el represor cro: lisis.
65
¿Cuáles son los factores determinantes de la decisión lisis/lisogenia?
- Multiplicidad de infección: relación fago/bacteria.
- Estado fisiológico de las células.
- Constitución genética.
66
Multiplicidad de infección
- Baja multiplicidad de infección: 1 fago/célula.
Hay una concentración de cII y cIII insuficiente para expresar cI, por lo que predomina el represor cro y se da la lisis. Hay suficientes células para que la descendencia del fago pueda seguir infectando.
- Alta multiplicidad de infección: 10 fagos/célula.
Hay una concentración de cII y cIII suficiente para expresar cI, por lo que predomina y se establece lisogenia. Hay pocas bacterias para infectar por lo que el fago entra en estado latente hasta que mejore la situación.
67
Estado fisiológico de las células: nutrientes
- Células en crecimiento activo (nutrientes disponibles).
Alta actividad proteásica (Hfl), por lo que se degrada el cII y no se expresa cI. Predomina el represor cro y se establece lisis. Las células está en estado metabólico óptimo para soportar la multiplicación de los virus.
- Células en fase estacionaria (carencia de nutrientes).
Hay baja actividad proteásica, por lo que no hay degradación de cII y se expresa cI. Predomina el represor cI y se establece lisogenia. El fago entra en estado latente hasta que mejoren las condiciones nutricionales.
68
Constitución genética/fondo genético
- Constitución genética del fago.
Mutantes del fago cI-, por lo que no se produce represor cI y predomina el represor cro. Siempre se da la infección lítica.
- Constitución genética de la bacteria.
Mutantes bacterianos Hfl, no se produce la proteasa Hfl y predomina el represor cI. Se da mayoritariamente infección lisogénica.
69
Dependencia de la multiplicidad de infección
Razón por la cual el fago lambda puede formar placas turbias. En una población determinada, cada célula puede ser infectada a una diferente "multiplicidad de infección". La mayoría serán lisadas, pero algunas serán lisogénicas (crecimiento).
70
Proteínas reguladoras
Poseen dominios de unión al DNA que interaccionan exacta y específicamente con secuencias diana en los promotores génicos.
71
Clases estructurales proteínas reguladoras
- Hélice-giro-hélice.
- Dedo de zinc.
- Cremallera de leucina.
- Hélice-lazo-hélice.
72
Estructura represores cI y cro
Hélices alfa separadas por segmentos cortos de aminoácidos sin estructura secundaria. La hélice de reconocimiento se sitúa dentro del surco mayor del DNA interaccionando con secuencias específicas.
73
Proteínas reguladoras con motivos hélice-giro-hélice
- Represor del operón del triptófano.
- Represor cro del fago lambda.
- Represor cI del fago lambda.
- Proteína activadora del catabolito (CAP).
74
Proteínas reguladoras "hélice-giro-hélice"
Los sitios de unión a DNA son a menudo repeticiones invertidas de una secuencia corta (palíndromo) a la que se unen cooperativamente dos subunidades de la proteína reguladora.
75
¿Cómo actúan los represores cI y cro?
Como homodímeros
76
Represor cI
- 236 aa's.
- Cinco hélices alpha.
- Motivo hélice-giro-hélice.
- Actúa como represor y activador.
- Mayor afinidad por O1 y O2.
77
Represor cro
- 66 aa's
- Tres hélices alpha y tres hojas beta.
- Un motivo hélice-giro-hélice.
- Actúa como represor.
- Mayor afinidad por O3.
78
Decisión lisis/lisogenia fago lambda
Primeras moléculas del represor cI se pegan al O1, imposibilitando estéricamente que la polimerasa pueda transcribir cro. Se producen más moléculas de cI, encajan en O2, facilitando que la polimerasa se una del otro lado, y permitiendo la transcripción de cI.
Cro tiene afinidad por O3, se pega a él y provoca un bloqueo de que la RNA polimerasa sintetice cI. No tiene efecto de estimulación de la síntesis, O2 y O1 están simplemente libres, por lo que se puede unir la polimerasa al otro lado y transcribir cro.
79
Modelo de Alan Campbell
1962
La región att es la responsable de la integración del genoma del fago en el genoma bacteriano. El DNA del virus queda incluido en el de la bacteria. La integración se da por entrecruzamiento recíproco simple.
En el genoma del cromosoma bacteriano hay una región idéntica a una zona del genoma del virus. Una integrasa sintetizada por el fago produce un entrecruzamiento ente los cromosomas, de tal forma que el locus gal y bio flaquean al DNA del fago, con dos zonas de DNA repetidas a los lados.
80
¿Cómo se produce la inducción del profago?
Se produce como respuesta a un estímulo inductor.
Se produce una respuesta de reparación (respuesta SOS) con la activación de RecA (proteasa).
81
Estímulo inductor
Suelen ser agentes que producen un daño en el DNA:
- Luz ultravioleta.
- Rayos X.
- Agentes alquilantes.
- Deprivación de timina.
82
¿Qué vías puede tomar la activación de la RecA?
- Degradación del represor LexA y activación de los genes de reparación del DNA. En estado normal, LexA está activo, inactivando la reparación de genes.
- Degradación del represor cI y activación de genes del ciclo lítico, comenzando la lisis.
83
¿Cómo es la inducción del profago?
Es un proceso irreversible. En un lisógeno hay solamente un profago por célula, lo cual equivale a una multiplicidad de infección de 1, insuficiente para restablecer la lisogenia.
