Tecnología del ADN recombinante Flashcards
WHD recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1978 por el descubrimiento de las enzimas de restricción
Werner Arber y Hamilton Smith, Daniel Nathans
Es una molécula que proviene de la unión artificial de dos fragmentos de ADN
ADN recombinante
Es el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente
La tecnología de ADN recombinante
La tecnología del ADN recombinante comenzó con dos herramientas fundamentales:
las enzimas de restricción y
los vectores de clonación del ADN
Es una técnica que produce grandes cantidades de un segmento de DNA específico. El segmento de DNA que se clona se une primero con un ADN vector, que es un vehículo para transportar el DNA extraño a una célula hospedadora adecuada, como la bacteria E. coli. El vector contiene secuencias que le permiten replicarse dentro de la célula hospedadora.
La clonación de ADN
Estos extremos son generados cuando la enzima corta las dos hebras asimétricamente, dejando los extremos de cada hebra de simple cadena complementarios entre sí.
Los extremos cohesivos
Estos extremos son generados cuando la enzima corta las dos hebras por el mismo lugar, generando dos extremos doble cadena.
Los extremos romos
Cuando el ADN está libre de contaminantes como proteínas o productos fenólicos provenientes del proceso de extracción. Dicha pureza se puede verificar leyendo el DNA en un espectrofotómetro además de a 260 nm a las longitudes de 280 nm (contaminación con proteínas) y a 230 nm (contaminación con grupos fenólicos).
Pureza biológica del DNA.
Contaminantes del que se debe estar libre de SDS y EDTA provenientes del proceso de extracción. Durante este proceso es importante separar con mucho cuidado la fase acuosa y evitar contaminarla con la fase orgánica (que contiene SDS y fenol) al momento de
su separación.
Contaminantes como detergentes y estabilizadores.
Como para la mayoría de las enzimas, estas condiciones son los factores más importantes para que éstas actúen con su máxima actividad, por lo que se debe cuidar que estos dos factores sean lo más exactos posible sin sufrir fluctuaciones durante el
proceso de digestión.
Ph y temperatura adecuados.
Es la metilación en ambas cadenas o la hemimetilación (sólo en una) inhibe la acción de las enzimas de restricción, por lo que para obtener una alta eficiencia en la digestión es necesario asegurarse que el DNA esté libre de metilación.
Grado de metilación del DNA.
Es una técnica para hacer muchas copias de una determinada región de ADN in vitro (en un tubo de ensayo en lugar de un organismo).
La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR
La PCR depende de una ___________________70°C, la Taq polimerasa (al principio se aisló de Thermus aquaticus, una bacteria que vive en manantiales calientes a temperaturas mayores de 90°C), y requiere de cebadores de ADN diseñados específicamente para la región de ADN de interés.
ADN polimerasa termoestable
La reacción se calienta bastante (96°) para separar las cadenas de ADN. Esto proporciona los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso.
Desnaturalización (96 °C)
La reacción se enfría (50-60°) para que los cebadores puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla.
Templado (50-60°C)
