Técnicas de Biología Celular y Molecular Flashcards
1
Q
Características del microscopio de Anton Van Leeuwenhoek
A
- Siglo XVII
- Utilizaba un sólo lente
- Le permitió ser el primero en describir a las bacterias (que llamó animalículos)
Se le adjudica a Anton Van Leeuwenhoek ser el creador del microscopio óptico de luz
2
Q
Características del microscopio de Robert Hooke
A
- Era un microscopio compuesto (tenía dos lentes).
- Poseía un condensador (hecho de un espejo)
- Al observar un corcho, nombró como “células” a las celdillas que lo conformaban (a partir de esto se comenzó a utilizar la palabra “célula”).
Hooke era contemporáneo de Leeuwenhoek
3
Q
¿Cuáles son las dos cualidades de un microscopio?
A
- Aumento: aumenta el tamaño.
- Resolución: aumenta la resolución
4
Q
Cual es el otro nombre que recibe el microscopio óptico de luz
A
Microscopio de campo claro
5
Q
Nombre algunos componentes del microscopio óptico de luz
A
- Ocular
- Revolver. Tiene varios objetivos.
- Objetivos. Tienen distintos aumentos.
- Platina. Donde se deposita la muestra.
- Diagragma. Aumenta o disminuye la cantidad de luz.
- Fuente de luz.
- Macrométrio y micrométrico. Permiten enfocar la muestra.
6
Q
¿De qué depende el aumento del tamaño de una imágeno?
A
Depende del ocular y el objetivo
7
Q
¿Cómo se calcula el aumento total?
A
Se multiplica la capacidad de aumento del objetivo (5x, 10x, 40x o 100x) por el ocular (10x). Por esto, el aumento máximo es 1000x.
8
Q
¿Qué es el poder de resolución (R)?
A
Capacidad de distinguir separadamente dos puntos muy cercanos entre sí
9
Q
¿Qué es el límite de resolución (d)?
A
Corresponde a la distancia mínima entre dos puntos para distinguirlos separadamente
10
Q
¿Cual es el límite de resolución de un microscópio óptico de luz?
A
200 nm
11
Q
¿Cuál es el límite de resolución del ojo humano?
A
200 um (micrómetros).
12
Q
¿Como se calcula el poder de resolución?
A
R = 1/d
donde R es el poder de resolución y d es el límite de resolución
13
Q
¿Cómo se calcula el límite de resolución?
A
d = λ / 2AN
donde λ es la longitud de onda de la fuente de iluminación y 2AN es la suma de la apertura numérica del condensador (capacidad de iluminar la muestra) y la apertura numérica del objetivo (capacidad de captar las muestras de luz).
14
Q
Relación de proporcionalidad entre d y λ
A
Directamente proporcionales
d = λ / 2AN
15
Q
Relación de proporcionalidad entre R y d
A
Inversamente proporcionales
R = 1 / d
16
Q
Relación de proporcionalidad entre λ y AN
A
Inversamente proporcionales.
17
Q
¿Qué es la apertura numérica (AN)
A
Corresponde al rango de ángulos para los cuales el sistema capta la luz.
Se calcula como AN = n * sen(a)
Donde n es el indice de refracción, calculado como c / v (c: velocidad de la luz en el vacío y v: velocidad de luz en el medio entre el espécimen y el objetivo). El ángulo a, por su lado, indica el angulo de apertura de la luz que es capaz de captar el objetivo.
18
Q
¿Que información lleva escrita el objetivo?
A
- Poder de aumento (cuantas veces aumenta el tamaño de la imágen)
- Apertura numérica.
- Necesidad de uso de aceite de inmersión.
19
Q
¿Por qué es necesario aplicar tinciones a las muestras celulares?
A
Porqué las estructuas celulares y subcelulares tienen escaso contraste natural y las tinciones aumentan el contraste de estas.
20
Q
¿Cuales son los pasos del procesamiento histológico?
A
- Obtención de la muestra.
- Fijación
- Deshidratación
- Impregnación con parafina fundida
21
Q
¿En qué consiste la fijación en el procesamiento histológico?
A
Fijarla en algun medio químico (generalmente formalina) que permita mantener la estructura morfológica del tejido cuando estaba vivo, impidiendo su descomposición.
22
Q
¿En qué consiste la deshidratación en el procesamiento histológico?
A
Se sumerge la muestra en varios recipientes con etanol, cada uno con concentraciones crecientes.
23
Q
¿En qué consiste el aclaramiento en el procesamiento histológico?
A
Se utilizan agentes aclarantes miscibles, deshidrantates y medios de impregnación.
24
Q
¿En qué consiste la impregnación con parafina en el procesamiento histológico?
A
Se impregna la muestra con parafina para darle consistencia más rígida a la muestra y poder cortarla utilizando un micrótomo. Esto permite que la muestra sea lo suficientemente delgada para que sea atravesado por la luz.
25
¿Cual es la técnica de tinción más utilizada?
La hematoxilina/eosina (H/E)
26
Características de la hematoxilina
- Colorante básico
- Tiñe de azul, purpura.
- Tiene afinidad con lo ácido, como DNA, grupos Pi, RER.
- Tiñe el núcleo.
- Las estructuras que tiñen se denominan basófilas.
27
Características de la Eosina
- Colorante ácido.
- Tiñe de color rosado.
- Tiene afinidad por lo básico, como grupos amino, aminoácidos, etc.
- Tiñe el citoplasma.
- Las estructuras que tiñen se denominan eosinofilas o acidófilas
28
¿Qué es un mordiente?
Una sustancia que actúa como "puente" entre el colorante y las moléculas que forman el tejido y permite la fijación de estos. Un ejemplo es el aluminio en la tinción con hematoxilina.
29
¿Qué son las células troncales embrionarias?
Son un grupo de células que se ubican en el blastocisto, que tienen la particularidad de ser **pluripotenciales**, pudiendo diferenciarse en las **tres capas germinales** (ectodermo, mesodermo y endodermo).
30
¿Que son las IPS o iPSC?
Es el acrónimo de **Células Pluripotenciales Inducidas**, que se obtuvieron a partir de fibroblastos por el Dr. Shinya Yamanaka al sobreexpresar factores de transcripción que normalmente se encuentran en las células embrionarias.
31
¿Para qué se utiliza generalmente la inmunohistoquímica o inmunofluorescencia?
Para hacer visibles proteínas específicas
32
¿En qué consiste la inmunohistoquímica?
Técnica que utiliza **anticuerpos** con afinidad por un **epítopo común (antígeno)**. Un anticuerpo primario se une a la proteína de interés y un **anticuerpo secundario** que se une a la región constante (fragmento Fc) del anticuerpo primario. Este anticuerpo secundario va conjugado a una **enzima** que cataliza una reacción cuyo producto es coloreado e insoluble y que se puede ver en el microscipio óptico de luz.
## Footnote
Fragmento Fc: región del anticuerpo que no se une al antígeno sino a los receptores de las células inmunes.
Conjugado: Compuesto formado por la unión química de dos o más sustancias diferentes
33
¿En qué consiste la inmunofluorescencia?
Técnica similar a la inmunohistoquímica donde el **anticuerpo está conjugado con un fluoroforo** que puede ser de distintos colores. Estas preparaciones deben ser observadas en un **microscopio de fluorescencia o en un microscopio confocal**.
La inmunofluorescencia puede ser **directa (IF)** (donde el anticuerpo primario está conjugado con el fluoróforo) o **indirecta (IFI)** (donde se utilizan dos anticuerpos, el primario se une al antígeno y el segundo está conjugado con el fluoroforo)
34
Diferencia entre inmunohistoquímica e inmunocitoquímica
**Inmunohistoquímica**: Se utiliza en secciones de tejido.
**Inmunocitoquímica**: Se utiliza en frotis de células o células en cultivo.
35
La afirmación "Los fluoróforos se excitan a cualquier longitud de onda" es verdadera o falsa
Falsa. El fluoróforo debe ser estimulado con la longitud de onda de excitación de ese fluróforo para que este emita fluorescencia.
36
¿Como funciona un microscopio de fluorescencia?
- Ocupa como fuente de luz una lampara de mercurio o lásers.
- Posee distintos filtros que permiten seleccionar al longitud de onda necesaria para excitar al fluoróforo.
- Posee un segundo filtro para observar solamente la señal de interés que provenga del fluorófor y no todo el _background_ o ruido de fondo.
36
¿Como funciona un microscopio de fluorescencia?
- Ocupa como fuente de luz una lampara de mercurio o lásers.
- Posee distintos filtros que permiten seleccionar al longitud de onda necesaria para excitar al fluoróforo.
- Posee un segundo filtro para observar solamente la señal de interés que provenga del fluorófor y no todo el _background_ o ruido de fondo.
37
¿Que es la proteína fluorescente verde (GFP)?
Es una proteína que emite fluorescencia de color verde sin necesidad de cofactores, solo necesita oxífeno. Permite observar células y tejidos vivos en tiempo real. Además, mediante mutagénesis pueden obtenerse proteínas fluorescentes de distintos colores.
Es útil pues permite se puede conjugar la GFP con una proteína de interés
38
Como funciona la microscopía electrónica de transmisión (MET)
Se bombardea la muestra con electrones. Las áreas más densas dispersan los electrones (formando áreas **electrondensas**), mientras que los electrones pueden pasar (o "transmitirse") a través de las áreas menos densas, dando como resultado una región más brillante (**electronlúcida**).
Permite ver la ultraestrucutra de la célula, pues su resolución es 1000 veces mayor que el MOL.
39
Como funciona la microscopía electronica de barrido (SEM)
Se utiliza un haz de electrones rodeado por un cañon "al vacío" que permite un escaneo o barrido sobre toda la muestra, y en vez de de detectar los electrones transmitidos, existe un detector de electrones secundarios, que son aquellos que salen desde la superficie de la muestra tras el choque de los electrones ccon lo que la muestra es irradiada.
Permite generar imágenes tridimensionales de la superficie estudiada.
40
¿Qué técnicas existen para la sobreexpresión de genes?
1. Transducción retroviral o lentiviral.
2. Transduccion adenoviral.
3. Transfección.
41
¿En qué consiste la transducción retroviral o lentiviral?
Se usan **partículares virales** con la secuencia del DNA que queremos sobreexpresar en la célula. Cuando las partículas virales infectan la célula blanco, el material genético se integra al genoma de la célula. La célula y todas las células hijas sobreexpresan esa secuencia o factores.
42
¿En qué consiste la transducción adenoviral?
Similar a la transducción retroviral pero utilizando **adenovirus**. No hay integración en el genoma y luego de cierta cantidad de replicaciones se acaba la sobreexpresión de esta secuencia de DNA.
43
¿En que consiste la transfección?
Utiliza **vectores o plásmidos** que ingresan a la célula a través de poros transitorios de membrana plasmatica (a partir de un proceso conocido como electroporación) o utilizando liposomas.
Luego de incorporar el plásmido, la maquinaria de la célula comienza a transcribir y traducir la proteína.
44
¿Que técnicas existen para el silenciamiento de genes?
1. Knockdown.
2. Knockout
45
Que significa cromogeno
Que produce color.
46
Como ocurre un knockdown
- Ocurre a nivel del **transcrito**.
- Se utiliza **shRNA** para generar **siRNA** complementario a una región de mRNA.
- Al asociarse el siRNA con el mRNA se forma una molecula de doble hebra reconocido por el complejo **RISC** que lo degrada.
- Hace que el mRNA no pueda ser traducido a una proteína disminuyendo considerablemente los niveles de la proteína en la célula.
47
Como ocurre un knockout
- Actua a nivel del **gen**, por ejemplo, provocando una mutación en él.
- Esto provoca que cuando se transcriba el mensajero va a existir un **codón de término anticipado** generandose una proteína no funcional.
48
¿Que son los CRISPR?
Son familias de secuencias de ADN en bacterias. Las secuencias contienen fragmentos de ADN de virus que han atacado a las bacterias.
Es útil para un sistema usado por las bacterias para deshacerse de DNA exógenos incorporados por virus.
49
¿Cual es la relevancia del sistema CRISPR/CAS9 en la Biología Celular y Molecular?
- Funciona como "tijeras moleculares"
- Permite silenciar genes o incorporar una secuencia en la zona de corte, lo que a su vez permite reparar mutaciones o reemplazar un gen alterado por otro normal.
50
¿Cómo puede verificarse que una edición del DNA utilizando CRISPR/CAS9 ocurrió correctamente?
Amplificando el fragmento de DNA con la **reacción de polimerasa en cadena (PCR)**
51
¿En que consiste un PCR?
Consiste en la amplificación in vivo de un fragmento específico de DNA, con el objetivo de generar múltiples copias del original
52
¿Qué elementos son necesarios para realizar un PCR?
1. **Taq Polimerasa** (DNA polimerasa que puede actuar a altas temperaturas).
2. **DNA o cDNA** (Fragmento o templado con segmento a amplificar).
3. **Buffer** (Mantiene el pH para que la enzima funcione a su pH óptimo).
4. **Desoxirribonucleótidos** (Sustratos para la polimerasa).
5. **Partidores Específicos** (Dan especificidad a la amplificación y así permiten amplificar solo un segmento de interés).
6. **Magnesio** (Cofactor de la polimerasa).
52
¿Qué elementos son necesarios para realizar un PCR?
1. **Taq Polimerasa** (DNA polimerasa que puede actuar a altas temperaturas).
2. **DNA o cDNA** (Fragmento o templado con segmento a amplificar).
3. **Buffer** (Mantiene el pH para que la enzima funcione a su pH óptimo).
4. **Desoxirribonucleótidos** (Sustratos para la polimerasa).
5. **Partidores Específicos** (Dan especificidad a la amplificación y así permiten amplificar solo un segmento de interés).
6. **Magnesio** (Cofactor de la polimerasa).
53
¿Cuáles son las etapas de un PCR?
1. **Denaturación**. Se denatura el DNA separando las dos hebras por calentamiento a 94-95° (la temperatura depende de la proporción C-G y el largo de la cadena.
2. **Alineamiento**. Se añade a la muestra cebadores o partidores que se hibridan con el DNA molde. Para esto se debe bajar la temperatura a 50-65° durante 10-30 segundos.
3. **Extensión**. Adición de los desoxirribonucleotidos por la Taq Polimerasa a parti del extremo 3' libre que aporta el partidor. Es por esto que los partidores determinan que segmento del DNA será amplificado.
Lo anteriormente mencionado corresponde a un ciclo; habitualmente se repite unas 20-40 veces.
## Footnote
La hibridación de ácidos nucleicos es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencias de bases complementarias en una única molécula de doble cadena
54
En que consiste el RT-PCR
Variante del PCR con un paso previo
- Utilizando buffer de lisis se extrae el RNA total (rRNA+mRNA+tRNA) de la célula.
- Se utiliza la enzima **transcriptasa reversa** que es capaz de generar cDNA a partir de RNA
55
¿Por qué se utiliza un Oligo-dT en la RT-PCR?
Sirve como partidor específico que se une a la cola poliA del mRNA permitiendo a la transcriptasa reversa comenzar con la sintesis de una hebra complementaria al RNA mensajero, es decir, **cDNA (DNA complementario)**.
## Footnote
La hebra de cDNA no contiene intrones.
56
¿Que es el Nat1 y cual es su importancia en el proceso de electroforesis?
Es un gen de expresión constitutiva o _housekeeping_, es decir, que se expresa en todas las celulas.
En técnicas de PCR y posterior electroforesis siempre se utiliza al menos un gen de expresión constitutiva para poder hacer una cuantificación relativa de los demás genes.
57
¿Qué es el RT minus?
Control negativo en una electroforesis posterior a una PCR. Consiste en colocar en la mezcla de reacción el RNA sólo, con todo el resto de los componentes de la mezcla, para asegurarse de que el RNA no está contaminado con DNA genómico, producto de la homogenización.
58
¿Qué es una sonda?
Es una secuencia de DNA complementaria a una secuencia de DNA específica
59
¿Qué es el PCR en tiempo real?
Técnica cuantitativa que corresponde a una variante del PCR tradicional.
- Utiliza **fluoroforos** que cuando se añaden a la doble hebra fluorescen (SYBR Green por ejemplo).
- También puede utilizar **sondas secuencia-específicas** que se marcan con fluoróforos (Taqman) y van junto a una secuencia de DNA complementaria a la que queremos amplificar.
## Footnote
**Explicación detallada de las sondas secuencia-específicas**
Existe una sonda que corresponde a una secuencia de DNA complementaria a la secuencia a amplificar. Se observan los partidores en cada extremo. Además, existe un fluoróforo y un apagador de la fluorescencia del fluoróforo. Si estos últimos 2 están muy cerca, la luz que emite el fluoróforo no se produce, pero si la actividad exonucleasa de la polimerasa es capaz de romper esta sonda a medida que amplifica la señal, el fluoróforo se separa del apagador y emite fluorescencia. (Taqman).
60
¿Cual es la ventaja del PCR en vivo con respecto al PCR convencional?
Permite calcular la cantidad inicial de moléculas blanco, pues a partir de dos muestras se puede determinar la que tiene mayor cantidad de DNA blanco en base al número de **Ct** (numero de ciclo donde la fluoresencia sobrepase al background).
- **Ct menor**: se demora menos ciclos en sobrepasar al background ya que tiene **mayor cantidad de DNA blanco**
## Footnote
En el PCR convencional, donde solo se pueden analizar los resultados a través de electroforesis, no permite discernir entre dos muestras cual tiene mas DNA.
61
¿Que es la hibridación in situ (ISH)?
- Permite observar a que célula pertenece el DNA o mRNA que se está amplificando.
- Utiliza una sonda marcada que posee nucleotidos conjugados con un antigeno (como la digoxigenina) que son reconocidos por anticuerpos (como en la inmunohistoquimica).
- Permite un análisis morfológico.
62
¿Que es la hibridación in situ fluorescente (FISH)?
Lo mismo que la hibridación in situ pero con sondas fluorescentes.
63
¿Que es un microarreglo?
- Técnica donde se puede conocer la expresión de varios genes.
- Se hace un microarreglo de DNA, es decir, un microchip donde en cada pocillo hay una secuencia de cDNA específica.
- Se marcan con fluoroforos distintos el RNA de una célula control y el de una célula no control.
64
¿Para que sirve la técnica de secuenciación?
Para conocer la secuencia nucleotídica exacta de un fragmento de interés cualquiera.
65
¿Como se realiza una secuenciación de un fragmento de DNA?
- 4 PCR distintos c/u con un dideoxinucleotido marcado con un color.
- Se obtienen fragmentos de tamaños diferentes.
- Ordenan fragmentos por tamaño a través de electroforesis.
- Se reconstruye la secuencia.
## Footnote
dideoxinucleotido: nucleotido modificado que no se puede elongar, es decir que al unirse a la secuencia, no se puede colocar ningún nucléotido más a su lado.
66
¿Para que sirve la técnica de Northern Blot?
Para detectar secuencias de RNA específicas
67
¿Como se realiza un Northern Blot?
1. Se usa electroforesis para la separación del RNA por tamaño.
2. Se transfiere el contenido desde el gel de agarosa a una membrana (generalmente nitrocelulosa).
3. Se incuba con una sonda específica marcada, por ejemplo, con radioactividad.
4. Se revela la imagén por radioautografía.
68
¿Para que sirve la técnica de Southern Blot?
Para detectar secuencias de DNA específicas.
69
¿Como se realiza un Southern Blot?
1. Se usa electroforesis para la separación del DNA por tamaño.
2. Se transfiere el contenido desde el gel de agarosa a una membrana (generalmente nitrocelulosa).
3. Se incuba con una sonda específica marcada, por ejemplo, con radioactividad.
4. Se revela la imagén por radioautografía.
70
¿Cómo ocurre la detección y cuantificación relativa de proteínas?
Se deben romper las membranas para poder liberar las proteínas contenidas en la célula. Los pasos son:
1. Hervir la muestra.
2. Sonicación (ruptura de membranas).
3. Homogenización (como por ejemplo mortero+nitrógeno líquido)
4. Electroforesis en condiciones desnaturantes y reductoras (para separación de las proteínas).
71
¿Por qué se debe realizar la electroforesis en condiciones denaturantes y reductoras para la cuantificación relativa de proteínas?
Para que ni la forma original (estructura tridimensional) ni la carga neta sean factores que afecten el movimiento de las proteínas a lo largo del gel, sino que solo el tamaño, es decir, la cantidad de A.A que componen la proteína inciden en la migración.
72
¿Como se logra generar un ambiente reductor y denaturante para la electroforesis?
Incubando las muestras homogenizadas con un buffer de carga que contiene:
- **SDS** (dodecil-sulfato de sodio): agrega cargas negativas a todas las proteínas.
- **β-mercaptoetanol**: reduce (rompe) los puentes disulfuro, fundamentales para la estructura terciaria de la proteína.
73
¿Para que sirve la técnica de Western Blot?
Permite detectar proteínas específicas previamente separadas mediante electroforesis.
74
Las bandas más altas observadas en un Western Blot corresponden a...
Proteínas de mayor peso molecular.
75
¿Como se realiza un Western Blot?
1. Luego de la electroforesis se transfieren las proteínas desde el gel de polietilamida a una membrana de nitrocelulosa.
2. Se incuba la membrana con un anticuerpo primario que se une a un epítope de la proteína de interés.
3. Se incuba la muestra con un anticuerpo secundario que reconoce la región constante del primario. El anticuerpo secundario va conjugado con una enzima (generalmente peroxidasa) que cataliza la formación de un producto quimioluminiscente.
76
¿Para que sirve el test ELISA?
Para cuantificar proteínas de manera exacta (**cuantificación absoluta**) al analizar una muestra incubada con antigenos primarios y secundarios (donde el secundario está conjugado a una enzima que genera una solución coloreada) y comparar los resultados con una **curva de cuantificación** con valores conocidos de ciertas concentraciones de algun analito (se compara la absorbancia de los pocillos con el suero que contiene al analito = antígeno con la curva de calibración).
77
¿Como puede evaluarse si existen asociacoines de proteínas?
1. **Inmunoprecipitación** (se añaden anticuerpos con bolitas pesadas de agarosa que precipitan ante la centrifugación. Se realiza Western Blot para analizar resultados).
2. **EMSA** (se basa en la movilidad electroforética).
3. **Pulldown** (para purificar proteínas).
4. **FRET** (La cercanía de fluoroforos de proteínas que deberían estar asociadas" permite la emisión de fluorescencia).
78
¿Que técnicas de fraccionamiento subcelular existen para separar los órganelos de un homogeneizado de células?
1. **Sedimentacion diferencial**: centrifuga a diferentes velocidades, de manera que al centrigurar lento precipitan los órganelos más pesados y al centrifugar rápido precipitan los órganelos más livianos.
2. **Sedimentación en gradiente de densidad**: introducir los organelos en un gradiente de sacarosa, que posee diferentes densidades dependiendo de la altura del tubo, asi al centrifugar todos los elementos precipitarán a la altura del tubo correspondiente a su densidad. Luego, se pueden perforar los tubos y obtener los elementos para realizar un Western Blot e identificar en que lugar se encuentran ciertas proteínas.
