Técnicas Flashcards
clasificación de microscopios y diferencias
- ópticos: tienen su fuente luminosa de luz blanca
- electrónico: fuente de iluminación un haz de electrones
que es aumento y que tipos hay
es la magnificación que logran los equipos
40x, 100x, 400x
que es nitidez
esta relacionada con la resolución
que es la resolución
la distancia mínima a la cual debe estar un equipo para identificar dos puntos independientes
cual es el rango del tamño entre las celulas
micrómetros
cuanto mas juntos esten 2 puntos independientes, la resolución será:
mayor
partes del microscopio optico
lente ocular, lente objetivo, condensador, diafragma, platina, tornillos macro y micrometro, revolver, foco, tubo y base inferior
que hace el lente ocular y el objetivo
- lente ocular: capta y amplifica imagenes dadas por el lente objetivo,
- lente objetivo: amplifica las imagenes, pueden haber secos y de inmersión
que hace el condensador
concentra los haces luminosos sobre la preparación
-permite aumentar o disminuir la cantidad de luz que va a incidir
diafragma
regula la cantidad de luz que entra en el condensador
los responsables de mejorar el aumento de nuestras muestras son:
el lente ocular y el objetivo
que tipo de imagen obtenemos con el microscopio
imagen real, invertida y aumentada
lente ocular
donde posamos la vista, “x” es el aumento que presenta el lente
lente objetivo estan insertos en
un revolver, lo que permite elegir el objetivo donde queremos mirar nuestras muestras
sistema de amortiguación
es un sistema de protección del lente objetivo
-esta parte se hundirá cuando acerquemos mucho platina al objetivo
tipos de lentes objetivo
- secos, que no utilizan ninguna ayuda para conducir los haces de luz
- inmersión, el aceite de inmersión capta el 100% de los haces de luz, dando una mejor resolución y máximo aumento
poder de resolución
capacidad para distinguir separadamente 2 puntos muy cercanos entre sí
límite de resolución
distancia mínima que existe entre 2 puntos para verlos independientes
la resolución y el límite de resolución son
inversamente proporcionales
el poder de resolución del microscopio electronico de transmisión
2 Armstrong, esta aumentado en 1.000.000 la resolución del ojo humano
relación de longitud de onda con el poder de resolución
mientras menor sea la longitud de onda, mejor será la resolución
la longitud de onda esta relacionada directamente
con la fuente de iluminación
la apertura numérica es
la capacidad que tiene para captar los haces de luz o de electrones
-es el indice de refracción multiplicado por el seno del ángulo (N x sen a)
la relación entre apertura numérica y resolución es
directamente proporcional
con el aceite de inmersión
tenemos nuestra mejor resolución
microscopio electrónico de transmisión (MEC)
- mayor resolución
- utiliza imanes qu permiten conducir los hacees de electrones
- se detectan los electrones transmitidos
en MET se obtienen
regiones electrodensas y electroclaras, relacionada directamente con la cantidad de electrones que va a incidir
en electroclaras
hay transmisión de electrones
en electrodensas
se genera sombra porque no hay transmisión de electrones
microscopio electrónico de barrido (SEM)
da imagenes de 3 dimensiones
- haz luminosos de electrones
- tiene detectores de electrones
diferencia microscopio optico y electronico
- optico: muestras vivas
- electronico: muestras muertas
en SEM
se detectan electrones secundarios
- zonas mas planas van a tener menor cantidad de electrones
- zonas más 3D más electrones
procesamiento histológico para lograr la tinción
1) Obtención de la muestra
2) Fijación: en formalina para detener procesos (evita proteólisis o degradaciones)
3) Deshidratación y aclaramiento: remover el exceso de formalina
4) Impregnación en parafina fundida
5) Inclusión de parafina, cuando la parafina se solidifica
diferencia entre deshidratación y aclaramiento
- deshidratación: sacarle todo el agua y reemplazarla por formalina
- aclaramiento: se sacan excesos, es como un lavado previo para que la muestra no rechaza el paso siguiente de parafina
tinción hematoxilina/eosina
celulas incoloras se les da tipo de contraste, para visualizar el nucleo y el citoplasma
hematoxilina
es un colorante, que se prepara en presencia de metales
con hematoxilina y metales se forma un complejo llamado
“hemalumbre”, que es catiónico con características básicas
hematoxilina tiñe
los grupos fosfatos del ADN, quedando purpura o morado el núcleo
-debido a que los grupos fosfatos tienen carga negativa, el complejo hemalumbre va a precipitar en estos lugares
eosina se utiliza
como contraste para distinguir el citoplasma del nucleo
eosina tiene
grupos carboxilicos, que dan caracteristicas acidas
eosina es afin
a grupos aminos de las proteinas citoplasmaticas
blastocistos son
celulas pluripotenciales: con la capacidad de diferenciarse en 3 líneas germinales
celulas reprogramadas IPS cells
celulas pluripotenciales inducidas, que despues pueden diferenciarse
como se hizo el experimento de IPS cells
a partir de fibroblastos adultos de la piel humana, los reprogramo para expresar factores de transcripciones que estan presentes solo en celulas embrionarias
imnunohistoquímica e inmunofluorescencia
- identificar un tipo de especifico de proteina
- basada en la utilización de anticuerpos
- anticuerpo va a tener una porción variable que es la que va a reconocer nuestro antigeno y una porcion constante
Inmunohistoquímica
- es indirecta
- utilización de anticuerpo primario para unirse a proteina de interes
- este anticuerpo es reconocido por un anticuerpo secundario con enzima marcadora (peroxidasa o fosfatasa alcalina)
- en presencia de sustratos adecuados producen precipitados colorados qu permiten identificar el complejo anticuerpo-anticuerpo
- podremos ver el lugar especifico de presencia de proteina
Inmunofluorescencia
- es directo
- utilización de anticuerpo marcado con colorante fluorescente para que se una a proteina de interes
mecanismo de inmunofluorescencia
el fluorofosforo que esta unido al anticuerpo, se excita y emite fluorescencia que sera captado por microscopio de fluorescencia
inmunofluorescencia vemos de color
- verdes: las neuronas
- rojo: celulas de Schwann
- azul: fluoroforo, que se intercala en el DNA (tinción DAPI)
proteina fluorescente verde (GFP) se encuenta naturalmente en
medusa que sufre modificaciones postraduccionales que le otorgan fluorescencia
GFP es codificada
de forma normal por uin solo gen que puede clonar e introducir en otras especies mediante ingeniería genética
