Techniques d'études des membranes

Question 1

Qu’est-ce que la technique de fractionnement cellulaire par centrifugation ?

Answer 1

C’est une méthode qui permet de séparer les molécules en fonction de leur poids moléculaire ; se base sur le principe que, pour autant qu’elles soient plus denses que le milieu ambiant, les particules de taille et de poids différents vont se déposer au fond du tube à des vitesses différentes
Étapes :
(1) Rupture mécanique (broyage des cellules) dans une solution tampon isotonique (saccharose) à l’aide d’un homogénéisateur mécanique (empêchant la rupture par osmose des vésicules membrainaires)
(2) Série de centrifugations différentielles à différentes vitesse et de différentes durées : les organites les plus volumineux/les plus lourds vont se déposer les 1ers (des noyaux - aux mitochondries - aux microtubules)

Question 2

Qu’est-ce que la technique SDS-PAGE

Answer 2

Cette technique permet de séparer les protéines selon leur poids moléculairee ; elle repose sur la capacité des protéines à migrer lorsqu’elles sont soumises à un champs électrique
Étapes :
(1) Dénaturation/linéarisation des protéines
- SDS, mercaptoéthanol et chaleur –> les protéines retrouvent leur structure primaire, i.e. séquence a.a. et ont une charge (-)
*Le SDS déplie les prot par répulsion électrostatique et confère une charge (-)
(2) Migration des protéines vers l’anode, i.e. l’électrode (+) –> les protétines les moins volumineuses arrivent en 1ers car les protéines les plus volumineuses restent “coincés” dans les pore du gel polyacrylamide
+ Le déplacement est contrôlé par (1) la taille, (2) le poids et (3) la densité de charge de la molécule (charges pas unité de masse)
+ La progression des protéines est contrôlé par un colorant pristeur se déplaçant juste devant la protéine laplus rapide lorsque le colorant arrive à l’endroit souhaité, on coupe le courant
+ Il est possible de transférer les protéines du gel sur une membrane de nitrocellulose et d’effectuer un immunobuvargage de type Western Blot
+ Le bleu de Coomassie permet de colorer les bandes et ensuite et de comparer leur poids moléculaires à des protéines dont le poids est connu

Question 3

Qu’est-ce que la chromatographie ?

Answer 3

La chromatographie correspond à une gamme de techniques qui permet de fractionner un mélange au moyen de la migration dans différents type de matrices poreuses.
Il y a différents types de chromatographie :
- la chromatographie en phase liquide
- la chromatographie par filtration sur gel
- la chromatographie avec échanges d’ions
- la chromatographie d’affinité

Question 4

Qu’est-ce que la spectrophotométrie de masse ?

Answer 4

Séparation des ions par champ magnétique en fonction de leur masse moléculaire

Question 5

Quelle méthode permet d’étudier la structure des protéines ?

Answer 5

L’étude des protéines au moyen de la diffraction des rayons X

Question 6

Qu’est-ce que la chromatographie par filtration en gel ?

Answer 6

Les protéines sont séparées lors de leur passage dans un puit avec de minuscules billes composées de polysaccharides interconnectées avec des porosité différentes
Les protéines les plus petites pénètrent dans les billes, alors que les plus grosses se dirigent vers le fond du puit
Lors de l’ajout du solvant, les plus petites protéines finissent par atteindre le fond du puit, mais à des vitesses différentes
***Se base principalement sur la masse moléculaire

Question 7

Qu’est-ce que la méthode de focalisation isoélectrique ?

Answer 7

Type d’électrophorèse
Électrophorèse en gel de polyacrylamide au sein de laquelle il y a une gradient de pH, il y a des molécules du gr amine et des molécules du gr carboxyle qui se distribue plus près de l’un ou l’autre des extrémités (+/-)
Au cours de la migration des protéines, il y a des changements de leur charge ionique jusqu’à l’atteinte du pH où la molécule atteint son point isoélectrique et sa migration cesse

Question 8

Qu’est-ce que la chromatographie avec échanges d’ions ?

Answer 8

Technique basée sur l’attraction des charges différentes
qui repose sur l’association ionique de protéines à un support inerte stationnaire comme la cellulose qui est chargées + ou -
Il y a des échangeurs de cations et d’anions
Ex :
(1) Une résine échangeuse d’ions chargée (+) peut être utilisée pour fixer la protéine dont la charge (-) est la plus forte
(2) Ensuite on peut ajouter des protéines faisant compétition au site de fixation ou bien ajouter des solutions tampons
(3) Les protéines sont éluées de la colonne dans l’ordre en passant des plus faiblement aux plus fortement unies