T4- Isolamento do DNA plasmídico Flashcards
Para que serve o Ficol?
O Ficol serve para conferir densidade à amostra auxiliando a migração no gel de eletroforese.
Para que serve o Azul de Bromofenol?
O Azul de Bromofenol é um corante que se liga à amostra e permite ver a migração dos fragmentos de DNA e das proteínas na “corrida”.
O que é SDS e qual a sua função?
O SDS é um detergente aniónico. Tem como função solubilizar as proteínas e a membrana, conferir carga negativa a todos os fragmentos e proteínas que estão a sofrer eletroforese e romper as membranas das células (detergentes).
Qual a solução de neutralização utilizada e qual a sua função?
A solução de neutralização utilizada é o Acetato de Potássio. Esta tem função de impedir que duas cadeias de DNA se voltem a unir quando estão separadas.
Qual a função do Brometo de Etídio?
O Brometo de Etídio é um composto que vai interagir com o DNA, intercalando-se nas bases e permitindo a visualização através de luz UV, uma vez que este composto emite fluorescência quando exposto a esta luz.
O que contém o tampão da amostra?
1xTAE, 10% Ficol, 0.2% SDS e 0.025% Azul de Bromofenol
Em que direção ocorre o movimento de DNA?
Ocorre do polo negativo para o polo positivo.
Descreve o protocolo do isolamento de DNA plasmídico.
De modo a isolarmos o DNA plasmídico, as células vão ter de sofrer lise celular através da adição de SDS e NaOH (solução lise). Depois, adiciona-se solução de neutralização que serve para neutralizar e impede a ligação entre as 2 cadeias de DNA.
Adiciona-se etanol que precipita o DNA plasmídico e etanol 70% que faz a lavagem do DNA.
Posteriormente, centrifugamos, rejeitamos o sobrenadante e adiciona-se EDTA ou tampão TE ou ainda H2O.
Dê exemplos de detergentes não iónicos utilizado na lise.
EDTA e Triton-X
O que são isosquisómeros?
Isósquisomeros são enzimas de restrição de diferentes espécies que reconhecem a mesma sequência numa sequência particular de DNA e cortam-na no mesmo local ou em locais diferentes, sendo este corte perfeito ou imperfeito.
No isolamento de DNA plasmídeo, para que serve o etanol absoluto seguido de incubação a -20ºC e de centrifugação?
Promove a precipitação dos ácido nucleicos.
O que entende por enzimas de restrição? Onde atuam? Qual o nome das extremidades às quais dão origem?
Enzimas de restrição são endonucleases específicas que cortam o DNA em locais com sequências de nucleótidos particulares/específicas.
Atuam em sequências alvo, designadas por palíndromas. Podem originar 2 tipos de extremidades depois do corte:
- Extremidades cegas ou abruptas
- Extremidades coesivas
Qual a concentração de agarose que se deve utilizar para um DNA com fragmentos entre os 2500-2000 pb e entre 500-2500 pb.
5000-2500: 1.2% agarose
2500-500: 2.0% agarose
Para que serve o etanol menos 70%?
Mais aquoso do que alcoólico
