T3-Transformação de bactérias por um DNA recombinante Flashcards
Calcule a eficiência da transformação.
Eficiência = nº total de transformantes (brancas + azuis)/ (ml células competentes/ μg DNA)
Para que serve o IPTG e porque que se utiliza na transformação de bactérias?
O IPTG é um análogo da lactose que se liga ao repressor e inativa-o, fazendo com que o
operão da lactose fique ativo e a transcrição se dê.
Neste caso, utilizamos o IPTG para que ocorra a ativação do repressor do operão da
lactose, levando à expressão dos genes estruturais, neste caso, a β- galactosidase.
Para que serve o X-Gal?
O X-Gal é um cromogénio que por oxidação, na presença de β-galactosidase apresenta cor azul. Se a β-galactosidase não estiver ativa, o composto não é degradado e origina colónias brancas (o gene MCP1 não foi inserido).
Duas razões para, na preparação de células competentes, se colocar as células em gelo.
- Permitir que as nucleases não degradem o DNA.
- A maturação das células competentes em gelo previne o aparecimento de mutações
espontâneas.
O que é a Ampicilina e qual a sua função?
A ampicilina é um antibiótico adicionado ao meio para selecionar todas as bactérias em que o plasmídeo foi introduzido, uma vez que este possui um gene que codifica para a β-lactomase, que degrada antibióticos β-lactâmicos como a ampicilina.
Indique os métodos mecânicos de lise bacteriana?
Homogeneizador de alta pressão, sonicação e moinho de contas.
Porque que na transformação de células competentes, deixamos o DNA que queremos
transformar em contacto com as células transformantes durante 15 minutos?
É o tempo necessário para a bactéria expressar resistência ao antibiótico conferida pelo
plasmídeo.
Num plasmídeo, qual a função do gene que confere resistência a um antibiótico?
Num plasmídeo, o gene que confere resistência a um antibiótico permite que esse
plasmídeo, quando inserido na bactéria, transmita-lhe esse gene e este ganhe a resistência ao mesmo. Desta forma, podemos verificar se a bactéria recebeu o plasmídeo ou não.
Calcule a eficácia da transformação.
% de recombinantes e % não recombinantes
