Sondes moléculaires Flashcards
Une sonde est une molécule qui a une _______ ________ pour la molécule que l’on veut détecter/quantifier. Qu’est-ce qui permet la détection de la molécule de manière stable, sensible et spécifique?
- Affinité spécifique.
- Un traceur.
VRAI OU FAUX : un traceur est présent naturellement sans l’échantillon analysé et ne modifie pas l’affinité de la sonde pour sa cible.
FAUX, ne modifie pas l’affinité de la sonde pour sa cible mais n’est pas présent naturellement dans l’échantillon.
Nomme les 2 fragments d’un anticorps.
- Fragment variable (Fab) → le haut du Y
- Fragment constant (Fc) → bas du Y
VRAI OU FAUX : les anticorps sont des immunoglobuline IgG, IgE ou IgM.
Vrai.
Nomme les deux types d’isotopes utilisés comme traceurs pour le marquage des sondes.
- Instables (éléments radioactifs)
- Stables (ex : en RMN et spectrométrie de masse)
Tous les atomes d’un même élément possèdent …?
Le même nombre de protons (donc le même numéro atomique → mêmes propriétés chimiques). MAIS propriétés nucléaires différentes.
La stabilité du noyau dépend du ratio _____.
Ratio N/Z, N = nombre de neutrons et Z = nombre de protons.
Que ce passe t-il s’il y a trop de neutrons ou pas assez dans un noyau?
L’atome est instable et il émettra un rayonnement radioactif pour se stabiliser.
Suite à l’émission d’un rayonnement radioactif (alpha), que fait le noyau?
Le noyau instable se transforme en éjectant 2 neutrons et 2 protons simultanément.
Le rayonnement radioactif alpha est associé au élément du tableau périodique… ?
Z est plus grand ou égal à 52. Pouvoir pénétrant de quelques centimètres.
La majorité des traceurs radioactifs utilisés en biochimie sont des émetteurs de rayonnement …?
Beta. (si le nombre de protons change, il y a transmutation → transformation d’un élément chimique en un autre) . Pouvoir pénétrant = quelques mètres, aluminium = écran protecteur.
Décrit les rayonnements gamma et les rayons X.
- Rayonnements très énergétiques
- L’émission de ces particules peut accompagner l’émission de particules alphas ou beta.
- Pouvoir pénétrant très élevé → quelques centaines de mètres (écran protecteur = béton ou plomb)
Nomme 3 exemples d’enzymes utilisés comme traceurs usuels pour le marquage des sondes.
- Phosphatase alcaline.
- Peroxydase du raifort (HRP)
- B- galactosidase
Qu’est-ce qu’un traceur colorimétrique?
Une enzyme liée de façon covalente à la sonde. La réaction enzymatique avec un substrat est spécifique et génère un produit coloré que l’on peut mesurer.
VRAI OU FAUX : L’intensité de la couleur n’est pas proportionnelle à la quantité de sonde fixée à la cible lors de l’utilisation de traceurs colorimétriques.
Faux, habituellement proportionnel.
Explique comment faire un ELISA (traceur colorimétrique).
- Enrobage des puits avec un antigène (essai direct) ou capture d’un antigène avec un anticorps (méthode en sandwich).
- Blocage des sites de liaisons non-spécifiques.
- Ajout d’un anticorps spécifique qui se lie à l’antigène (anticorps primaire → détection directe) ou d’un anticorps spécifique et d’un anticorps secondaire (détection indirecte).
- Mesure du signal.
Explique le principe des traceurs luminescents (enzymes).
- Utilisation d’un substrat qui produit de la lumière lorsqu’il est transformé en produit → chimioluminescence.
- L’intensité du signal lumineux est habituellement proportionnelle à la quantité de sondes fixées à la cible.
Comment détecte-t-on la lumière lors de l’utilisation de traceurs luminescents?
- Luminomètre (ex : caméras CCD).
2. Autoradiographie → lumière émise impressionne le film au niveau du lieu de l’émission.
Qu’est-ce que la fluorescence?
L’émission de la lumière par une substance absorbant des radiations et les émettent à des longueurs d’ondes plus grandes.
Qu’est-ce qu’un fluorochrome?
Une molécule émettant de la fluorescence. (émission de lumière arrête dès que l’illumination cesse).
Qu’est-ce que la phosphorescence?
L’émission de lumière continue après que l’illumination ait cessée.
L’émission (en fluorescence) est toujours à une longueur d’onde ___ ______ que celle utilisée pour l’excitation.
Plus élevée.
Que se passe-t-il si l’excitation n’est pas réalisée au pic d’absorption maximale?
L’intensité de la fluorescence émise est plus faible.
Que peut-on utiliser pour exciter spécifiquement dans une gamme de longueurs d’onde (si la source de lumière est la lumière blanche)?
Des filtres, des LEDs ou des lasers dans une gamme de longueur d’onde très étroite ou une longueur d’onde précise.
Des filtres de bandes passantes étroites permettent …?
L’excitation et la mesure de la fluorescence émise dans des gammes étroites de longueurs d’ondes → par exemple, peut permette de détecter le signal de fluorescence originant d’une molécule en particulier.
À quoi sert un spectrofluorimètre?
Nécessaire pour connaître des longueurs d’ondes des pics d’absorption et d’émission.
Nomme 3 applications courantes impliquant des fluorochromes.
- Détection des acides nucléiques sur gel
- Séquençage de l’ADN
- Microscopie à fluorescence.
Nomme 4 applications courantes impliquant des sondes fluorescentes.
- Cytométrie en flux
- Hybridation des puces à ADN
- Microscopie à fluorescence
- FRET
Comment s’effectue le marquage des sondes (conjugaison chimique)?
Couplage par la formation d’un lien chimique stable entre un traceur et une molécule de reconnaissance froide pour générer la sonde.
Comment s’effectue le marquage des sondes (synthèse biochimique)?
- Biosynthèse de composés complexes à partir de précurseurs munis du traceur.
- Coupler un gène à celui codant pour une protéine fluorescente afin d’obtenir une protéine de fusion.
Quelles sont les applications des sondes pour les acides nucléiques?
- ELISA
- Buvardage Southern/Nothern
- Microscopie, cytométrie en flux, FRET et puces dADN
Qu’est-ce que la digoxigénine?
Hormone de plante très rarement retrouvée dans les systèmes vivants. Hormone peut être détectée à l’aide d’un anticorps spécifique.
