Lyse alcaline, digestion, amplification PCR et électrophorèse des acides nucléiques Flashcards
Que sont les plasmides?
- Petites molécules circulaires d’ADN double brin extra-chromosomiques.
- Se répliquent de façon indépendante du chromosome.
- Souvent modifiés pour inclure un MCS (site de clonage multiple).
Que sont les enzymes de restriction?
- Enzymes isolées de microorganismes qui reconnaissent et coupent une séquence spécifique d’ADN.
VRAI OU FAUX : plus la longueur du site de reconnaissance est longue, plus la reconnaissance est spécifique.
Vrai.
Les sites de reconnaissance sont souvent palindromiques. Explique.
On retrouve la même séquence si on la lit 5’ vers 3’ sur le brin matrice que si on la lit 3’ vers 5’ sur le brin complémentaire.
En coupant, une enzyme peut générer 3 types d’extrémités. Nomme les.
- Franches (coupe l’ADN au milieu)
- 5’ protubérantes (petit bout à l’extrémité 5’)
- 3’ protubérantes (petit bout à l’extrémité 3’)
Quelles sont les 3 étapes du principe de digestion et de clonage de fragments d’ADN?
- Couper le plasmide par l’enzyme de restriction.
- Couper le fragment d’ADN par l’enzyme de restriction (extrémités 5’ protubérantes formées).
- Lier les deux ADN par leurs sites de l’enzyme de restriction.
Qu’est-ce que la transformation des bactéries? Que fait-on en labo. après la transformation?
C’est l’étape d’insertion d’un plasmide dans une bactérie. Après la transformation, on sélectionne les bactéries sur Pétri selon le/les gènes de résistance portés par le plasmide. On obtient des colonies isolées sur pétri.
Comment fait-on pour isoler et purifier l’ADN plasmidique à partir d’un bouillon de culture?
Par lyse alcaline (l’ADN est sous forme super-enroulée dans les cellules).
Explique les étapes de l’isolement de l’ADN plasmidique par lyse alcaline.
- Centrifugation de la culture bactérienne et resuspension du culot dans la solution de resuspension.
- Ajout de la solution de dénaturation → protéines sont dénaturées et les cellules lysent, les liaisons H entre les brins d’ADN sont brisées (car pH alcalin).
- Les 2 brins de l’ADN chromosomique se séparent, mais les 2 brins du plasmide ne peuvent se séparer car ADN plasmidique est super-enroulée.
- Ajout de la solution de neutralisation → pH redevient neutre, ADN chromosomique ne peut pas reprendre sa forme initiale et reste insoluble, mais l’ADN plasmidique retrouve sa forme double-brin native et demeure soluble.
- Centrifugation → ADN plasmidique est dans le surnageant et ADN chromosomique est dans le culot.
- Ajout d’éthanol froid → centrifugation → ADN plasmidique est dans le culot.
- Surnageant est enlevé, puis culot d’ADN est lavé avec de l’éthanol 70 % (pour éliminer le sel qui a précipité avec l’ADN). Après centrifugation, l’ADN plasmidique est toujours dans le culot.
- Culot d’ADN est séché à l’air pour permettre l’évaporation complète de l’alcool → ADN est dissout dans la solution TE.
Qu’est-ce que la PCR? Que faut-il comme réactifs de départ? (6)
Technique de synthèse de fragments d’ADN linéaires, amplification exponentielle, l’amplicon devient le fragment le plus abondant dans le tube. Il faut :
- Tampon pour l’enzyme
- Mélange des 4 nucléotides (ACTG)
- Amorce foward
- Amorce reverse
- ADN polymérase thermostable
- ADN à amplifier
Décrit un cycle de PCR (il peut y avoir jusqu’à 30 cycles environ).
- Dénaturation de l’ADN double-brin à 95 degré C. (les 2 brins se séparent). On a 2 brins simples.
- Température est abaissée à une température permettant l’appariement des amorces (60 degré C.) On a toujours 2 brins simples.
- La température est augmentée à 72 degré C. → température optimale pour l’activité de la Taq ADN polymérase). 2 nouveaux brins d’ADN sont synthétisés. On a 2 double-brins donc 4 simples brins.
- On répète…..
Lors d’une PCR, que se passe-t-il si la température est trop basse?
Les amorces pourront s’apparier avec une cible partiellement complémentaire et alors générer des amplicons non-spécifiques.
Lors d’une PCR, que se passe-t-il si la température est trop élevée?
Les amorces ne s’apparient pas et on n’obtient pas d’amplicons.
Par quoi est dictée la taille de l’amplicon lors d’une PCR? Qu’est-ce que cela permet?
C’est dictée par l’endroit de l’appariement des amorces. On peut donc prévoir, au nucléotide près, la taille attendue de l’amplicon si l’on connait la séquence nucléotidique de l’ADN cible.
Pourquoi, lors d’une PCR, la quantité d’ADN synthétisé demeure limitée?
Parce que les nucléotides et les amorces sont présentes en quantité limitée dans le tube.
