SMISTAMENTO PROTEINE

Question 1

COMPARTIMENTI IN CUI SI DIVIDE LA CELLULA

Answer 1

Perché è necessario avere un corredo di specifiche proteine nei vari compartimenti? Ogni compartimento ha la sua funzionalità e necessita di avere un corredo di proteine indispensabili al suo corretto funzionamento. Per questo è importante lo smistamento delle proteine all’interno della cellula

I compartimenti in cui si divide la cellula sono principalmente due:
- Topologicamente equivalenti, ovvero sono corrispondenti gli uni agli altri e questo fa sì che le molecole non debbano attraversare nessuna membrana plasmatica per passare dall’uno all’altro (per esempio il reticolo endoplasmatico risulta essere topologicamente equivalente all’apparato Golgi, ai lisosomi e allo spazio extra molecolare)
- Topologicamente distinti

Question 2

TIPOLOGIE DI TRASPORTO DELLE PROTEINE

Answer 2

Tipologie di trasporto delle proteine
- trasporto regolato: avviene tra citosol il nucleo e viceversa, quindi compartimenti topologicamente equivalenti (che non richiedono l’attraversamento di membrana). I pori nucleari fungono da canali selettivi che permettono il passaggio di grossi complessi macromolecolari
- traslocazione transmembrana o trasporto transmembrana: avviene tra citosol e un compartimento topologicamente distinto, reticolo endoplasmatico, mitocondrio o perossisoma. Sono quindi presenti delle proteine trasportatrici che dirigono le proteine attraverso la membrana
- trasporto vescicolare: avviene tra compartimenti topologicamente equivalenti e simili. In questo caso intervengono degli intermedi di trasporto racchiusi da membrana, come delle vescicole.

Question 3

COME FANNO LE PROTEINE A SAPERE DOVE ANDARE ?

Answer 3

La destinazione delle proteine dipende da specifici segnali di smistamento riconosciuti da molecole sull’organello bersaglio che si occupano del trasporto: i recettori di smistamento.
Un tipico peptide segnale consiste in una sequenza di residui amminoacidici generalmente collocati nella zona N-terminale. E’ fondamentale ricordare che ogni sequenza segnale è altamente specifica, infatti esiste quella per l’importazione nel nucleo, nei mitocondri e così via.
Queste proteine sono condizione sufficiente e necessaria allo smistamento proteico e nella maggior parte dei casi vengono eliminate dall’enzima peptidasi del segnale al termine del trasporto.

Question 4

1. TRASPORTO REGOLATO- definizione

Answer 4

Il trasporto regolato consiste nel traffico di proteine per esempio dal citosol allo spazio intranucleare e viceversa, dunque tra organi topologicamente equivalenti.
All’interno della doppia membrana nucleare, ognuna avente una composizione proteica differente, sono presenti dei siti di legame per i cromosomi e la lamina nucleare che conferisce stabilità alla struttura, mentre esternamente presentano una continuità con il reticolo endoplasmatico ruvido. I pori nucleari sono le strutture funzionali e il collegamento tra le due membrane, strutture complesse che giocano un ruolo fondamentale per il trasporto regolato.
I pori nucleari sono formati da proteina chiamate nucleoporine che risultano permeabili alle piccole molecole idrosolubili, ma impermeabili alle macromolecole, che non possono passare spontaneamente ma devono possedere una sequenza di localizzazione nucleare.
Nei pori nucleari sono presenti una serie di ramificazioni che fungono da filtro: sul lato citosolico vi è un insieme di fibrille, su quello nucleare una struttura detta canestro. I pori nucleari sono numerosi e possono trasportare fino a mille macromolecole al secondo persino in entrambe le direzioni in contemporanea.

Question 5

1. TRASPORTO REGOLATO- IMPORTAZIONE NUCLEARE

Answer 5

Importazione nucleare
Come fanno le proteine a muoversi verso i pori nucleari? I vari segnali di localizzazione cellulare vengono legati da diversi recettori di importazione nucleare, le importine, molto specifiche, per cui ogni proteina ne ha una corrispondente. Le importine sono inoltre in grado di legare ripetizioni di fenilalanina e glicina presenti nei domini di nucleoporine.
Una situazione particolare è il caso in cui il recettore non si lega direttamente alla proteina che necessita di entrare nel nucleo, ma ad una proteina adattatrice di importazione. In questo caso tutto il complesso proteico entra nel nucleo.

Energia del trasporto nucleare
l’energia del trasporto nucleare è fornita dalle GTPasi RAN, sono delle proteine con attività idrolitica in grado di trasformare il GTP in GDP, liberando energia.
Sono interruttori molecolari che si presentano in forma attiva se legati al GTP e inattiva se legati al GDP. La transizione dall’una all’altra è regolata da 2 enzimi regolatori:
- Proteina GAP, GTPase Activating Protein, attiva la GTPasi e velocizza l’idrolisi del GTP in GDP, liberando un gruppo fosfato ed energia. In questo modo la proteina GTPasi RAN passa dalla sua forma attiva a quella inattiva.
- Proteina GEF, GTPase Exchange Factor, che scambia il GDP con un GTP, riportando la GTPasi RAN in forma attiva

Trasporto nucleare: ciclo della RNA GTPasi
- La RAN-GDPasi entra nel nucleo, incontra la proteina GEF che la trasforma nella sua forma attiva, RAN-GTPasi, in modo da permetterle di trasportare qualcosa fuori dal citosol.
- una volta fuori dal nucleo la proteina GAP idrolizza il GTP in GDP, trasformando la RAN-GTPasi in RAN-GDPasi
- ricomincia il ciclo…

CICLO DELL’RNA-GTPasi con quello dell’importina:
1. Il recettore per il trasporto nucleare localizzato sull’importina si lega alla proteina trasportatrice
2. Il recettore trasporta il suo carico proteico nel nucleo: Il complesso proteico proteina cargo importina attraverso il poro nucleare grazie ai legami che l’importina instaura con la fenilalanina e la glicina presenti nel groviglio di nucleoporine. Nel frattempo entra nel nucleo una RAN GDPasi, attivata dall’enzima GEF, che la trasforma in RAN GTPasi
3. La proteina viene recapitata al nucleo: il complesso viene disassemblato grazie all’intervento della RAN GTPasi, che si lega all’importina, ne modifica la conformazione e libera la proteina cargo che verrà recapitata nel nucleo.
4. Il recettore scarico torna nel citosol: il complesso RAN GTPasi-importina esce dal nucleo. La gtpasi grazie all’intervento dell’enzima Gap idrolizza il GTP, diventando inattiva e libera l’importina che verrà riciclata.

Question 6

1. TRASPORTO REGOLATO- ESPORTAZIONE NUCLEARE

Answer 6

l’esportazione nucleare? L’esportazione nucleare è sostanzialmente analoga all’importazione ma al contrario.
- Una proteina adibita all’esportazione della proteina cargo, l’esportina, entra spontaneamente del nucleo, nel frattempo anche una RAN GDPasi attraverso il foro nucleare e grazie all’azione dell’enzima GEF, si attiva
- la proteina cargo da portare nel citosol lega il suo segnale di esportazione nucleare alle sportina. La RAN GTPasi si lega all’intero complesso e lo trasporta fuori nel citosol punto
- l’enzima GAPidrolizza il GTP, trasformando la RAN GTPasi in RAN GDPasi liberando la proteina nel citosol.

Question 7

2. TRASPORTO DI MEMBRANA- definizione

Answer 7

trasporto transmembrana
il secondo tipo di trasporto è il trasporto trans membrana attraverso le membrane

Question 8

2. TRASPORTO TRANSMEMBRANA- nei mitocondri e cloroplasti

Answer 8

Trasporto trans membrana nei mitocondri e cloroplasti
Il trasporto nei mitocondri e cloroplasti è un trasporto di tipo trans membrana. Il mitocondrio ha una membrana interna e una esterna, uno spazio in tempo in membrana e una matrice. Nel caso di cloroplasti si avrà una terza membrana detta dei tilacoidi.
I mitocondri, come noto, posseggono delle mRNA, con cui possono sintetizzare delle proteine, ma la maggior parte delle proteine che regolano il loro funzionamento provengono dal citosol. Per entrare come abbiamo già visto necessitano di una specifica sequenza segnale, che da un lato presenta una serie di amminoacidi carichi positivamente mentre dall’altro presenta due amminoacidi idrofobici. Si ha quindi un’alfa elica anfipatica molto importante per la localizzazione delle proteine sintetizzate nel citosol a livello del mitocondrio.
I tipi di trasportatori presenti nel mitocondrio sono due:
- Il complesso TOM, Traslocase of the Outer Membrane, formato da porzione recettoriale che interagisce con l’alfa elica e una porzione che funge da canale di traslocazione
- il complesso TIM 23, Traslocase of the Inner Membrane, in comunicazione con il complesso TOM
- altre tipologie di proteine selettive sono il complesso SAM, responsabili del folding delle proteine per lo spazio interno.
- le proteine del complesso OXA, che si trova sulla membrana interna e prenderà le proteine del mitocondrio sintetizzate nella matrice e le sposterà nello spazio intermembrana
- il complesso TIM 22 che ha funzioni legate alla localizzazione delle proteine implicate nel trasporto di ADP e gruppi fosfati.

passaggi:
Il problema principale che devono affrontare i traslocatori riguarda la struttura tridimensionale ingombrante che presenta la proteina che deve entrare.
Il processo per proteine che devono entrare nella matrice:
1. La proteina chaperon hsp70, di tipo citosolico, lega la proteina da trasportare nel citosol, e riesce a mantenerla in forma non foldata, quindi distesa, che non ha struttura secondaria e terziaria.
2. la proteina hsp70 citosolica non passa attraverso il complesso TOM e TIM 23 e viene tagliata con una spesa energetica utile alla proteina che la usa come forza motrice per passare i complessi.
3. la proteina passa per primo il complesso TOM e successivamente si inserisce nel TIM 23, quando una porzione di essa esce dal complesso TIM 23, viene legata da una chaperon hsp70 di tipo mitocondriale che la trascina all’interno della matrice.
4. appena il passaggio è completato interviene una peptidasi, un enzima, che effettua un taglio alla sequenza segnale e alla hsp mitocondriale.
5. la proteina sarà quindi libera nella matrice, dove verrà inserita in un altra chaperon di origine mitocondriale, hsp60 con dispendio di altra energia. Questo è un passaggio utile per il processo del folding.
E’ bene ricordare che la proteina raggiunge la forma matura grazie a delle proteine accessorie dette chaperoni.

Non tutte le proteine devono raggiungere la matrice mitocondriale, alcune devono inserirsi nella membrana. Entrano in gioco in questo caso delle sequenze della proteina volutamente idrofobiche: nel momento in cui il traslocatore le riconosce interrompe l’entrata, poi si apre lateralmente e rilascia la proteina nella membrana. Questo può avvenire sia nel Tom che nel TIM. E’ importante però che la proteina passi prima nel TOM senza essere bloccata oppure la proteina potrebbe doversi fermare nello spazio intermembrana.
Da questa possibilità derivano tre casi:
- La proteina è traslocata interamente dal TOM ma non è riconosciuta dal TIM, quindi viene rilasciata nello spazio intermembrana
- La proteina attraverso TOM, attraversa TIM, che però riconosce una parte idrofobica e la rilascia nella membrana. A questo punto interviene una proteasi che taglia la parte idrofobica da quella idrofilica, che si trova ancora nello spazio intermembrana, in modo che questa possa essere rilasciata
- Una proteina attraverso sia Tom che TIM completamente, ma viene fondata nella matrice mitocondriale e solo in seguito dei canali la porteranno nello spazio intermembrana. In questa tipologia ciò che fa passare la proteina dalla matrice ha lo spazio intermembrana è un canale e non è un complesso TOM né TIM

Question 9

2. TRASPORTO TRANSMEMBRANA- nel RE

Answer 9

Trasporto trans membrana del RE
Questo riguarda il passaggio di proteine dal citosol al reticolo endoplasmatico.
Al contrario dei trasporti visti precedentemente, quindi post tradizionali per quanto riguarda il RE si parla di trasporto co-traduzionale poiché il processo avviene ancora prima che tutta la proteina venga sintetizzata, il ribosoma che sta traducendo l’RNA è traiettato dalla membrana del RE in modo da offrire la proteina nell’immediato trasporto.
Esistono due tipi di ribosomi:
-quelli sparsi nel citosol, che traducono i messaggeri a formare polipeptidi traslocati dopo la traduzione, mitocondri, cloroplasti, nucleo
-quelli attaccati al reticolo endoplasmatico ruvido che traducono tutti i restanti messaggeri.
Il reticolo endoplasmatico è spesso solo un compartimento di transizione per le proteine che devono raggiungere altri compartimenti. Tutte le proteine che devono transitare nel reticolo hanno un segnale caratterizzato da residui amminoacidici idrofobici e devono possedere anche una particella di riconoscimento del segnale, SRP, Signal Recognition Particle è un recettore che riconosce la SRP situato sulla membrana del RE.
Cos’è la SRP? L’SRP è una ribo proteina composta da 6 domini proteici e avente forma di cerniera, con una tasca di legame per la sequenza segnale e una per il ribosoma. I 6 domini sono connessi da una molecola di RNA che fornisce la flessibilità necessaria per effettuare il cambiamento conformazionale a livello della cerniera nel momento in cui lega la sequenza segnale.

La seconda funzione del reticolo endoplasmatico è quella di sintesi dei lipidi, quindi dei fosfolipidi. Questo avviene sul versante citosolico del reticolo endoplasmatico, dove sono inserite catene di acido grasso che tramite diverse reazioni vanno progressivamente unite ad una molecola di glicerolo e ad un gruppo fosfato. Dal momento che I fosfolipidi crescono soltanto sull’emistrato esiste un meccanismo che ne permette la ridistribuzione sui due strati evitando una crescita disomogenea.
Il meccanismo sopra citato è regolato da scramblasi, proteine chiamate scramblasi, che sposteranno in modo aspecifico i fosfolipidi dal lato citosolico al lato interno. Avremo anche delle proteine dette flippasi (specifiche per i gruppi di testa) che agiscono principalmente sul monostrato citoplasmatico e catalizzando il flip-flop di fosfolipidi, creano la simmetria tipica delle membrane cellulari.

Question 10

SEQUENZE SEGNALE

Answer 10

La sequenza segnale ha un ruolo di legame con la particella di riconoscimento del segnale, ma è anche responsabile dell’apertura del canale per entrare nel RE. La traslocazione completa la peptidasi del segnale taglia il segnale e la proteina è rilasciata nel reticolo dove può riassumere nuovamente la sua conformazione tridimensionale.
I passaggi:
- Il ribosoma sta iniziando a sintetizzare una proteina: di solito la sequenza segnale è situata all’N-terminale, quindi la prima parte di sequenza sintetizzata.
- appena l’N-terminale è espulsa dal ribosoma viene riconosciuta dal SRP, e lega la sequenza di riconoscimento instaurando, grazie alla sua conformazione, anche un legame con il ribosoma, in contemporanea questo legame ferma momentaneamente la traduzione della proteina per far sì che i ribosoma raggiunga la membrana del re per attaccarvisi prima che la proteina sia completamente sintetizzata.
- il legame ribosoma-RE avviene grazie alla presenza del recettore che riconosce l’SRP
- il recettore si trova nei pressi di una proteina traslocatore: nel momento in cui il traslocatore riconosce il segnale della proteina, si apre può iniziare il trasporto all’interno del re.
- le componenti del processo vengono poi staccate e riutilizzate per altre proteine.
- RICAPITOLAZIONE: Il processo inizia con il riconoscimento della sequenza segnale da parte della proteina SRP; questa, legandosi al segnale, subirà un cambiamento conformazionale, esponendo un sito di legame per il recettore di membrana che a sua volta è connessa ad una proteina traslocatrice sulla membrana del 12 reticolo endoplasmatico. Quando avviene questa serie di legami, il traslocatore si apre, il ribosoma resta attaccato al traslocatore e inizia a produrre la proteina all’interno del lume del RE. La proteina SRP si stacca dal recettore e dal ribosoma, torna nuovamente lineare e così comincia un nuovo ciclo.

I ribosomi liberi e quelli attaccati al reticolo endoplasmatico presentano una struttura
identica: troveremo, infatti, tutte le subunità libere nel citosol indistintamente da ciò
per cui, poi, saranno utilizzate. La sola differenza sta nella proteina da sintetizzare
che presenterà o meno la sequenza segnale che ne identifica l’indirizzamento verso
il reticolo endoplasmatico. Si individuano due situazioni differenti in base alla localizzazione ultima della proteina sintetizzata: le proteine sintetizzate dai ribosomi liberi nel citoplasma verranno poi indirizzate verso il nucleo, il mitocondrio, il cloroplasto e il perossisoma in base a specifici segnali di localizzazione; diversamente, le proteine indirizzate al reticolo endoplasmatico vengono sintetizzate direttamente all’interno del lume del RE.

Question 11

PROTEINe CHAPERONE- BiP- ALTRE- SCRAMBLASI

Answer 11

proteina chaperone: aiuta le proteine neosintetizzate a ripiegarsi nella loro struttura 3D funzionale
proteine BiP: sono delle proteine all’interno del reticolo endoplasmatico responsabili del controllo del Folding delle proteine, BiP sta per Binding immunoglobulin Protein. Queste sono in grado di associarsi a residui di idrofobici esposti dalle proteine nel lume e non si staccano fin quando la proteina non raggiunge la sua forma tridimensionale corretta. Quando i residui idrofobici vengono fondati correttamente, questo costituisce il segnale di stacco alla proteina bip e successivamente la proteina potrà gemmare in vescicole e passare al compartimento successivo.
Le proteine destinate ad altri compartimenti saranno indirizzate ad essi quindi solo se ripiegate correttamente all’interno del lume del reticolo endoplasmatico, in caso contrario ne conseguirebbe un danno in quanto la proteina non avrebbe un ruolo funzionale nella cellula

La seconda funzione del reticolo endoplasmatico è quella di sintesi dei lipidi, quindi dei fosfolipidi. Questo avviene sul versante citosolico del reticolo endoplasmatico, dove sono inserite catene di acido grasso che tramite diverse reazioni vanno progressivamente unite ad una molecola di glicerolo e ad un gruppo fosfato. Dal momento che I fosfolipidi crescono soltanto sull’emistrato esiste un meccanismo che ne permette la ridistribuzione sui due strati evitando una crescita disomogenea.
Il meccanismo sopra citato è regolato da scramblasi, proteine chiamate scramblasi, che sposteranno in modo aspecifico i fosfolipidi dal lato citosolico al lato interno. Avremo anche delle proteine dette flippasi (specifiche per i gruppi di testa) che agiscono principalmente sul monostrato citoplasmatico e catalizzando il flip-flop di fosfolipidi, creano la simmetria tipica delle membrane cellulari.

Question 12

OLIGOSACCARIDI

Answer 12

Oligosaccaridi
Il reticolo endoplasmatico effettua la glicosilazione delle proteine, quindi l’aggiunta di zuccheri alla proteina neo sintetizzata, si avranno quindi dei polisaccaridi precursori formati da n-acetilglucosamina, mannosio e glucosio.
Gli oligosaccaridi fungono da etichette che indicano lo stato di ripiegamento di una proteina. Esse si trovano ancorate alla membrana all’interno del reticolo endoplasmatico. Gli oligosaccaridi sono il segnale riconosciuto delle proteine chaperoni all’interno del reticolo endoplasmatico, le quali riescono a distinguere le proteine correttamente consumate e ne permettono il rilascio.
Se la proteina non è ripiegata correttamente inizialmente intervengono le chaperone che modificano la proteina in questione permettendo di essere rilasciate nel citoplasma. Nel caso in cui invece la proteina non dovesse comunque raggiungere la conformazione corretta (SS?) verranno trasportate al di fuori del RE e verranno degradate.

Durante la vita di una cellula può capitare che vi sia un accumulo tossico di proteine malformate che attiva però un segnale detto UPR, ovvero risposta alle proteine non ripiegate (unfolded protein response), che attiva la trascrizione dei geni che codificano per le chaperone.
Le UPR sono delle risposte alle proteine non ripiegate correttamente, sono proteine accessorie capaci di riconoscere situazioni di unfolding e incrementare la sintesi di proteine chaperone in grado di ripiegare correttamente. Anche lo stesso reticolo endoplasmatico risponde a questi errori di folding espandendosi in modo tale da aumentare la superficie e facilitare il corretto ripiegamento.

La seconda funzione del reticolo endoplasmatico è quella di sintesi dei lipidi, quindi dei fosfolipidi. Questo avviene sul versante citosolico del reticolo endoplasmatico, dove sono inserite catene di acido grasso che tramite diverse reazioni vanno progressivamente unite ad una molecola di glicerolo e ad un gruppo fosfato. Dal momento che I fosfolipidi crescono soltanto sull’emistrato esiste un meccanismo che ne permette la ridistribuzione sui due strati evitando una crescita disomogenea.
Il meccanismo sopra citato è regolato da scramblasi, proteine chiamate scramblasi, che sposteranno in modo aspecifico i fosfolipidi dal lato citosolico al lato interno. Avremo anche delle proteine dette flippasi (specifiche per i gruppi di testa) che agiscono principalmente sul monostrato citoplasmatico e catalizzando il flip-flop di fosfolipidi, creano la simmetria tipica delle membrane cellulari.

Question 13

3. TRASPORTO VESCICOLARE- definizione, elementi chiave

Answer 13

trasporto vescicolare
Il trasporto vescicolare consiste nel mettere smistamento delle proteine agli altri compartimenti della cellula.

Gli elementi chiave del trasporto vescicolare sono:
-un compartimento donatore, dal quale gemma, quindi si originano e successivamente si stacca, una vescicola
-la vescicola che contiene al suo interno le proteine cargo, che devono essere trasportati in un altro compartimento, oppure proteine cargo trans membrana che entrano a far parte della membrana bersaglio
-compartimento bersaglio, dove si fonderanno la membrana della vescicola e quella del compartimento. A questo punto si libera il contenuto della vescicola stessa, quindi la proteina cargo solubile o la proteina cargo transmembrana

Question 14

3. TRASPORTO VESCICOLARE- come capire in quale compartimento sarà indirizzato

Answer 14

Come capire in quale compartimento sarà indirizzata? Nel citoplasma esistono numerosi compartimenti differenti, sarà quindi necessario avere delle localizzazioni specifiche che permettono di muoversi verso il compartimento corretto. Si distinguono in particolare due vie di trasporto vescicolare.

Question 15

3. TRASPORTO VESCICOLARE- tipologie di trasporto vescicolare

Answer 15

Tipi di trasporto vescicolare: esistono due tipi di trasporto vescicolare
-via secretoria: dal centro della cellula verso l’esterno. si parte dai compartimenti di membrana più interni della cellula e ci si dirige verso lo spazio extracellulare
- via endocitica: compie il percorso inverso. Si parte dallo spazio extracellulare e viene utilizzato dalla cellula per internalizzare ciò che è al di fuori di essa.
-via di recupero: sono piani di trasporto generalmente retrogrado che permettono di recuperare membrana riportandola ai compartimenti da cui si sono originate le vescicole. Ad esempio se una vescicola gemma dal RE diretta verso il Golgi, viene portata dalla membrana del re e, se non esistesse un sistema di recupero, il re perderebbe progressivamente la sua membrana. Questa tipologia di trasporto è funzionale al riporto delle proteine residenti nei compartimenti di origine.

Question 16

3. TRASPORTO VESCICOLARE- specificità delle vescicole

Answer 16

Specificità delle vescicole: ciascuna vescicola di trasporto che gemma da uno specifico compartimento deve essere selettiva, assumere soltanto le molecole appropriate, fondersi soltanto con la membrana bersaglio giusta. Esistono delle proteine, che donano specificità al tipo di vescicola e che dipendono da dove Gemma la vescicola stessa. Vescicole rivestite da:
- CLATRINA: gemmano dallo spazio extracellulare, quindi dalla membrana plasmatica, e sono dirette prima agli endosomi precoci, poi da essi al Trans Golgi Network
- COPI: sono proteine di rivestimento di tipo 1, gemmano dal Golgi
- COPII: proteina di rivestimento di tipo 2, gemmano dal RE
ciascuna vescicola che gemma da un certo compartimento è caratterizzata da un rivestimento specifico, che viene perso nel momento in cui è terminata la gemmazione, per esporre delle molecole che la indirizzano al compartimento bersaglio.

Question 17

3. TRASPORTO VESCICOLARE- VESCICOLE RIVESTITE DA CLATRINA

Answer 17

VESCICOLE RIVESTITE DA CLATRINA: Distinguibili dal punto di vista morfologico. Sono molto distinte rispetto a quelle rivestite di COPI e COPII, che appaiono invece più simili tra loro. Le vescicole rivestite da clatrina sono caratterizzate da una molecola di rivestimento che forma una struttura a canestro con regioni pentagonali ed esagonali.
Essi vengono coinvolti principalmente nel trasporto dalla membrana plasmatica al comparto endosomiale e del Golgi. Sul versante ed extracellulare si possono accumulare delle molecole che la cellula internalizza. Grazie a dei recettori specifici la cellula avverte la presenza di queste molecole, recluta sul versante interno della membrana plasmatica delle molecole di clatrina che formano una fossetta della membrana stessa, che poi si richiude formando una struttura di scivolare ancora connessa alla membrana plasmatica da una sottile regione detta COLLO.
Sono dunque necessarie delle proteine che tagliano il collo di membrana e stacchino la vescicola di clatrina che si libera all’interno del citosol. La vescicola appare con un rivestimento esterno di clatrina e la molecola da internalizzare si trova all’interno della vescicola stessa.

La struttura caratteristica di rivestimento di clatrina è formata da proteine specifiche, in particolare tre polipeptidi molto grandi detti Heavy Chain e tre più piccoli detti Light Chain.
Trischelio di clatrina: è formato da tre catene pesanti e tre catene leggere. Assemblando diversi triskeli tra loro si forma una struttura ad esagoni e pentagoni che costituisce il canestro delle vescicole rivestite di clatrina. Tuttavia il trischelo di clatrina non è specifico per la proteina cargo che deve essere trasportata ma si configura come elemento strutturale generico per la formazione della vescicola. Sono necessarie delle proteine che fungono da adattatori.
Adattine: sono proteine necessarie all’adattamento, quindi in grado di agire mediante il rapporto tra la proteina cargo e il triskelio. Le proteine adattatrici formano uno strato interno del rivestimento posizionato tra la proteina Cargo e il trischelio di clatrina.
Come funzionano le adattine? Sulla membrana plasmatica è presente un recettore che riconosce la molecola cargo che deve essere internalizzata. Successivamente a questo legame si ha l’arrivo di due adattive AP1 e AP2 che riconoscono il recettore legante la molecola cargo, e a loro volta reclutano il trischelio di clatrina. Con l’assemblamento dei vari trischeli si formula la struttura vescicolare che è ancora connessa alla membrana dalla regione del collo.
A questo punto vengono reclutate delle proteine con funzione di fissione della membrana che stringono sempre più il collo fino a staccare la vescicola rivestita da clatrina.
Si ha una vescicola di trasporto libera per rivestimento che si muove verso il compartimento bersaglio.
Dinamina: proteina specifica che polimerizza attorno al collo di membrana, formando una vera e propria spirale che stringe sempre di più la porzione del collo di membrana fino a quando non avviene il distacco della vescicola. Dopo aver operato il taglio, la dinamina si stacca. La dinamina riconosce in maniera specifica la regione di membrana a cui deve legarsi e poi staccarsi successivamente al taglio grazie a i fosfoinositidi.
i fosfoinositidi sono fosfolipidi poco rappresentati nella membrana plasmatica che hanno un ruolo chiave nel processo di internalizzazione mediato dalle vescicole e rivestite di clatrina.
Il fosfoinositide specifico fosfoinositide-3,4-bifosfato definisce l’entità del collo di membrana che deve essere tagliato durante l’endocitosi mediata da clatrina. Permette quindi il riconoscimento del collo della vescicola da parte della dinamina. I fosfoinositidi giocano perciò un ruolo cruciale, sono elementi chiave della vita della cellula e agiscono anche come marcatori di alcuni compartimenti di membrana.

Come viene perso il rivestimento di Clatrina? Viene perso grazie alla transizione dei fosfosinotidi che costituiscono la vescicola di clatrina. Essa è molto affine al PI(4,5)P2 (fosfosinotide 4,5 bisfosfato)che ritroviamo sulla membrana plasmatica ma non a quello che rimane sull’endosoma. La clatrina perde affinità con la vescicola e si stacca

Question 18

3. TRASPORTO VESCICOLARE- VESCICOLE RIVESTITE DA CLATRINA- GTPasi di reclutamento

Answer 18

GTPasi di reclutamento del rivestimento: sono altre proteine che insieme ai fosfosinotidi danno identità alle membrane che devono generare dei vari compartimenti. Sono proteine monomeriche che controllano l’assemblaggio delle vescicole, esistono in uno stato attivo elegante il GTP e in uno stato inattivo legante il GDP. Esistono quindi delle GTPasi specifiche che vengono reclutate sul rivestimento delle vescicole infiammazione e servono per l’assembramento del rivestimento stesso e l’indirizzamento della vescicola al compartimento corretto.

Sar 1: è un tipo di GTPasi che si trova sul RE nell’assemblamento del rivestimento COPII. Esiste in forma solubile, quindi citosolica, poiché legando il GDP l’elica anfipatica si trova nascosta all’interno della proteina, quindi non si lega alle membrane.
Nel momento in cui Sar1 intercetta la sua GEF (Guanine Exchange Factor), che toglie il GDP e lega il GTP la coda idrofobica viene esposta e si inserisce nella membrana del RE. Da forma inattiva, la proteina, passa ad una forma attiva inserita nella membrana del RE.
È importante sapere che Sar1, una volta legata alla membrana del RE, recluta una serie di proteine che hanno un dominio di legame per il recettore della proteina cargo che deve essere trasportata, definiti adattatori. Questo è il primo strato è il rivestimento interno delle vescicole COPII. Successivamente vengono reclutate altre proteine che invece formano il rivestimento esterno il quale, simile al trischelio di clatrina, porta alla gemmazione della vescicola.
Il rivestimento viene perso non appena la vescicola gemma dal Re: le GTPasi di reclutamento del rivestimento hanno anche un ruolo nel disassemblaggio del rivestimento. Idrolisi a GDP del GTP legato alla Sar1, provoca un cambio conformazionale della GTPasi. La sua coda idrofobica esce dalla membrana provocando il disassemblaggio dei rivestimenti della vescicola.
Disassemblamento del rivestimento più esterno: vengono esposte due tipi di proteine che servono a indirizzare la vescicola verso la membrana bersaglio.
- Rab GTP: GTPasi che servono indirizzare la vescicola verso la membrana bersaglio dove sono presenti degli effettori per la Rab, che essendo legata al GTP, si trova nel suo stato attivo e riconosce l’effettore sulla membrana per effettuare il cosiddetto attacco della vescicola. La vescicola comincia ad avvicinarsi alla membrana bersaglio
- proteina v-SNARE: sporge dalla vescicola e interagisce con le t-SNARE presenti sulla membrana bersaglio. Legandosi tra di loro esse formano il complesso trans-SNARE che media la fusione della vescicola sulla membrana bersaglio. Dopo l’attacco la Rab viene staccata, legata al GDP, quindi si trova nella sua forma inattiva e al GDI, una proteina che inibisce l’associazione della Rab con la vescicola, poiché altrimenti la sposterebbe nuovamente punto Grazie a questo complesso la vescicola si avvicina alla membrana bersaglio e si fonde liberando il suo contenuto all’interno del compartimento.
E’ importante ricordare che esistono tante Rab diverse che si distribuiscono in maniera selettiva nei sistemi di membrana, per questo sono degli ottimi marcatori molecolari per l’identificazione di ogni tipo di membrana e la guida del traffico vescicolare

Riassumendo: la specificità di attacco è assicurata dalla presenza sulla superficie di tutte le vescicole, di marcatori che le identificano in base alla loro origine e al tipo di carico, e dalla presenza sulle membrane bersaglio di recettori complementari che riconoscono gli appropriati marcatori.
Il processo di fusione mediato da t-SNARE e v-SNARE porta ad avere un complesso trans-SNARE sulla membrana bersaglio che è molto stabile perché deve superare la distanza critica. Proprio perché molto stabile, non si dissocia da solo e quindi si rendono necessarie delle proteine in grado di dissociarlo. A questo scopo, esiste un complesso di proteine chiamato NSF che, insieme a proteine accessorie, usa una molecola di ATP per dissociare il complesso trans-SNARE ripristinando la condizione iniziale necessaria per fusioni successive.
Ricapitolando, nel processo di gemmazione dal RE, la vescicola gemma in seguito alla
segnalazione da parte di una proteina solubile che si trova nel lume; quest’ultima contatta il
recettore di uscita sulla membrana che, a sua volta, segnala e recluta il complesso Sec24,Sec23,Sar1GTP rivestito da Sar13 e 31; a questo punto la vescicola si stacca dal RE.
Esistono però proteine residenti nel lume del RE che devono ritornarvi dopo la gemmazione
della vescicola, e altre proteine che non entrano a far parte di una vescicola in gemmazione
dal RE perché non sono foldate, cioè non hanno raggiunto il ripiegamento tale da permettere
di far parte di una vescicola e di lasciare il compartimento del RE (controllo di qualità ).

VESCICOLE RIVESTITE DA COPII: Dopo il distacco dal re le vescicole ricoperte con COPII, raggiungono il gruppo vescicolare tubulare prima di arrivare al Cis Golgi. Durante questo trasporto si formano delle vescicole di recupero volte a riportare al reticolo endoplasmatico proteina residenti del RE e membrana per evitare che esso rimpicciolisca le sue dimensioni continuando a gemmare vescicole.
Vescicole retrograde tutte le proteine che contengono una sequenza detta KDEL, sigla che sta per lisina, acido aspartico, acido glutammico e leucina, verranno riconosciute nel gruppo vescicolare tubulare da un recettore per il KDEL che permette impacchettare qualsiasi proteina in cui questa sequenza sia presente. Queste proteine vengono impacchettate in vescicole retrograde rivestite da Cop1 e dirette al RE.
Perché le proteine non legano fin dal principio i recettori KDL del RE, ma solo dopo essere stata riportata indietro dal Golgi? Cioè è dovuto alla struttura tubolare che precede il CIS Golgi: il pH è inoltre leggermente diverso rispetto a quello del RE e dà un valore tale da favorire l’associazione del recettore con la proteina residente nel RE.

Question 19

3. TRASPORTO VESCICOLARE- TRASPORTO VESCICOLARE DAL RE AL GOLGI

Answer 19

Trasporto vescicolare dal re al Golgi
Le vescicole che gemmano dal RE per dirigersi verso il Golgi si interfacciano inizialmente con il cis-Golgi Network, CGN, dal quale si diparteno poi una serie di strutture intermedie: cisterna cis, cisterna mediale e cisterna trans.
Segue poi un eventuale altra regione d’uscita detta trans-Golgi network, TGN, da cui origineranno le vescicole destinate invece ad altri compartimenti cellulari o verso la membrana cellulare nel caso di secernere qualcosa all’esterno.
E’ già noto che il golgi abbia struttura fortemente tubulare che collega tutte queste cisterne, che svolgono però funzioni differenti (quindi ognuna delle cisterne del Golgi è dotata di enzimi specifici per canalizzare reazioni diverse):
* glicosilazione delle proteine: essa avviene lungo tutte le cisterne del Golgi attraverso una serie di passaggi svolti da una specifica regione, la prima del cis-Golgi vicina alla regione di smistamento si occupa della fosforilazione del mannosio presente nelle proteine, nella cisterna successiva viene rimosso il mannosio, a livello mediale invece può proseguire la rimozione del mannosio oppure può essere direttamente aggiunta la N-acetilglucosamina. Nella cisterna trans può essere aggiunta una molecola di galattosio o una molecola di acido sialico. Infine nel trans Golgi potrebbe venire l’aggiunta di solfati a tirosina e carboidrati, rendendo possibile lo smistamento delle proteine.
Nell’apparato del Golgi avvengono due tipi di glicosilazione:
- O-glicosilazione: aggiunta di uno zucchero su un atomo nucleofilo di ossigeno che porta alla formazione di O-glicani. In particolare lo zucchero viene aggiunto sul residuo di serina e treonina
- N-glicosilazione: avviene su atomi di azoto formando gli N-glicani. In questo caso lo zucchero viene legato a residui di aspartato.
* Un’altra funzione del Golgi è quella di accumulo delle idrolasi acide, ovvero enzimi che caratterizzano l’ambiente interno del lisosoma. Si tratta di enzimi con attività idrolitica, attivi ad un pH ottimale di 4,5, che vanno a scindere le sostanze di scarto, i monomeri, che potranno essere nuovamente utili alla cellula. In base alla sostanza da scindere entrano in gioco enzimi diversi:
-proteasi: scindono le proteine dei singoli aminoacidi
-glicosillasi: degradano gli zuccheri
-lipasi: degradano i lipidi
-fosfatasi: degradano i gruppi fosfato.
Tutto ciò permette alla cellula il riciclo di questi componenti essenziali. Il pH acido è necessario per il corretto funzionamento di tutti questi enzimi ed è fornito dalla pompa protonica ATPasi che sfrutta ATP per spingere nel lume dei lisosomi gli ioni idrogeno.
Le idrolasi sono prodotte nel RE ma vengono prodotte in forma inattiva, in quanto in caso contrario andrebbero a degradare il reticolo endoplasmatico stesso. Nel momento in cui vengono sintetizzate vengono legate ad una molecola di mannosio che funge da segnale di smistamento: dal RE passano nel cis-Golgi, dove al mannosio viene legata una fosfo N-acetilglucosamina nella regione intermedia. A questo punto viene esposto il segnale: entrano in gioco un enzima che taglia la N-acetilglucosamina mentre il fosfato resta legato al mannosio formando mannosio-6-fosfato, fondamentale poiché nel trans Golgi Network esistono recettori selettivi per il mannosio-6-fosfato. Una volta riconosciuto, questi recettori andranno a legare l’idrolasi acida e favoriranno la gemmazione di una vescicola rivestita di clatrina.
Durante il transito la vescicola maturerà formando una vescicola di trasporto priva di rivestimento che andrà a fondersi con un endosoma precoce, dove l’idrolasi acida con mannosio-6-fosfato viene rilasciata dal recettore a causa della differenza di pH. Si ricorda infatti che mentre nel TGN il pH era di 6,5/6,7,00 nell’endosoma precoce scende ad un valore di circa 6 e viene persa l’affinità tra idrolasi e recettore.
Il distacco è fondamentale poiché altrimenti l’idrolasi verrebbe riportata nel Golgi insieme al recettore che invece viene riciclato.
Viene quindi rimosso il fosfato dal mannosio: questa reazione costituisce un ulteriore sistema di controllo volto ad evitare che l’idrolasi possa nuovamente legarsi al recettore e tornare indietro verso il TGN. Da qui l’endosoma precoce tende tramite una pompa protonica ad abbassare il suo pH diventando un lisosoma, oppure andrà a fondersi con un lisosoma preformato dove l’idrolasi diventerà attiva grazie ad un ulteriore cambio di pH ancor più acido, che possiede un valore pari a 5/4,5 (quindi il valore che consente all’idrolasi acide di funzionare in modo ottimale).
Molte malattie da deposito lisosomiale sono causate da difetti genetici che colpiscono una o più idrorasi lisosomiali. Il difetto porta all’accumulo di substrati inseriti nei lisosomi con gravi conseguenze patologiche nel sistema nervoso.

Question 20

3. TRASPORTO VESCICOLARE- SMISTAMENTO DELLE PROTEINE DAL TRANS GOLGI

Answer 20

Smistamento delle proteine dal trans-Golgi: le vie di smistamento dal Golgi sono principalmente tre:
* Via verso i lisosomi appena spiegata
* via di secrezione regolata: caratteristica di cellule specializzate nella secrezione. Dal trans Golgi si distaccano delle vescicole che si accumulano in prossimità della membrana plasmatica senza poi fondersi con essa. La liberazione del loro contenuto si avrà soltanto in presenza di un segnale proveniente dall’ambiente extracellulare.
* via secretoria costitutiva: caratteristica di tutti i tipi cellulari, procede dal trans-Golgi verso la membrana plasmatica con lo scopo di trasportare verso l’esterno della cellula o indirizzare proteine costitutive della membrana o proteine che dovranno essere inviate nell’ambiente cellulare. Si tratta dell’esocitosi.
L’esocitosi differisce dalla secrezione regolata in quanto si ha successivamente un accumulo di materiale da secernere, mentre il secondo, si ha successivamente ad un segnale come un ormone o un neurotrasmettitore.
Durante il transito nelle esocitosi, quindi dopo essersi distaccate dal trans Golgi, perderanno il loro rivestimento diventando vescicole secretorie immature, detta immatura in quanto perderà grande quantità di membrana che verrà gradualmente smaltita grazie all’azione di altre vescicole rivestite da clatrina che ridurranno la superficie di membrana della vescicola secretoria riportandola verso il TGN. La vescicola a questo punto sarà matura raggiungendo la massima densità al suo interno di molecole da secernere.

Question 21

3. TRASPORTO VESCICOLARE- SMISTAMENTO DELLE PROTEINE DAL TRANS GOLGI- LISOSOMI

Answer 21

Traffico nel lisosoma: i lisosomi sono in genere punti di incontro dove convergono flussi di traffico intracellulare. La maggior parte degli enzimi digestivi li raggiunge tramite una via che parte dal RE passa attraverso l’apparato del Golgi, mentre le sostanze da digerire arrivano da almeno quattro diverse fonti:
-fagocitosi, cellula del sistema immunitario trova un batterio, effettua la fagocitosi internalizzando un fagosoma che andrà a fondersi con il lisosoma, dove il batterio verrà scisso in tutte le sue componenti essenziali per poterle riutilizzare,
-autofagia, meccanismo con cui la cellula degrada le sue componenti ad esempio un organello non più funzionante che viene bloccato da una vescicola detta autofagosoma che si fonderà anche in questo caso con il lisosoma, dove idrolasi acide si occuperanno di degradare le sostanze per il riciclo,
-macropinocitosi, consiste nell’internalizzazione di liquidi presenti nell’ambiente extracellulare che contengono nutrienti che verranno prima indirizzati verso un endosoma tardivo e successivamente tramite questo raggiungerà dei lisosomi dove verranno degradati, -endocitosi mediata da recettori: la presenza di sostanze nell’ambiente extracellulare attiva la via endocitica mediata da recettori. Si forma un endosoma precoce in cui il pH consente la dissociazione delle molecole inglobate dal recettore. Questo endosoma successivamente matura formando un endosoma tardivo che si fonderà con il lisosoma.

Question 22

3. TRASPORTO VESCICOLARE- SMISTAMENTO DELLE PROTEINE DAL TRANS GOLGI- endocitosi

Answer 22

Endocitosi: processo opposto all’esocitosi, trasporto verso l’interno di sostanze, con o senza la mediazione di recettori. Si divide in:
* Fagocitosi: cellula che ingloba sostanze solide presenti nell’ambiente extracellulare punto svolto da cellule specializzate dette fagociti, un esempio ne sono le cellule del sistema immunitario come i neutrofili, che fagocitano batteri o i macrofagi che fagocitano globuli rossi alterati
* Pinocitosi: processo che consiste nell’intenalizzazione di sostanze liquide. processo costitutivo di cellule specializzate che riguarda l’assunzione di materiali necessari al sostentamento della cellula o all’accrescimento delle sue membrane si tratta di assunzione di liquidi.
* Endocitosi mediata dai recettori: si basa sulla formazione di vescicole di clatina che si fondono con gli endosomi. In questo caso intervengono recettori transmembrana che riconoscono in modo specifico alcune sostanze come il colesterolo, la vitamina B12 o il ferro. Le macromolecole si attaccano al recettore transmembrana complementari che si accumulano in fosse rivestite e quindi entrano nella cellula come complessi recettori macromolecola in vescicole rivestite da clatrina. Essa è una via sfruttata da alcuni patogeni per infettare la cellula, come l’Hiv. Un altro esempio è il meccanismo di internalizzazione del colesterolo: la maggior parte del colesterolo è trasportata nel sangue.