Sistemas de Vetores Virais Flashcards
Que tipo de vírus são usados em Terapia Génica?
Nota: não se refere às familias de vírus utilizadas.
- Vírus Recombinante, nun ca wild-type.
Ao utilizar vetores virais na Terapia, o que pretendemos manter e retirar?
- Tenta-se remover todos os elementos que causam patogenicidade ao ser humano;
- Temos de manter as características de infecciosidade, capacidade de infetar um grande número de células rapidamente
(características inatas de infeção); - Permitir que a expressão do nosso gene terapêutico seja direcionada.
Quais são as características ideais de um vetor viral?
- Perfil seguro
- Produção fácil
- Boa estabilidade nas células alvo
- Capacidade transgénica alta
Como é que se pode tornar os vetores virais mais seguros, sem comprometer a sua eficácia?
- Evitar a sua replicação
- Promover a sua inativação
- Atenuar a sua toxicidade natural
Que critérios são utilizados para classificar vírus?
i. Tipo de material genético (DNA/RNA)
ii. Simetria da cápsideo
iii. Presença de envelope
iv. O seu tamanho (capacidade de carga)
v. Sítio onde ocorre replicação (núcleo ou citoplasma).
Caracterize os lentivírus de acordo com os critérios de classificação de vírus que conhece.
➜ Material genético: RNA (retrovírus);
➜ Proteínas específicas (transcriptase reversa, integrase e protease);
➜ Ligando: glicoproteína gp120;
➜ Capsídeo Proteico;
➜ Replicação: capaz de se replicar em células não mitóticas ( ou indiferenciadas);
Quais as proteínas que fazem o capsídeo, o nucleosídeo e a matriz dos lentivírus ou do HIV-1?
➜ Capsídeo: p24;
➜ Nucleosídeo: p7;
➜ Matriz: p17.
Nos lentivírus, ou HIV-1, existem 2 moléculas de RNA. Porque é que têm 2 moléculas de RNA de cadeia simples iguais?
➜ Apenas 1 é utilizada!
➜ A ideia é que a outra é importante
em termos de estrutura funcionaL e de regulação para o processo de transcrição.
Qual a constituição/estrutura genómica de um lentivírus (HIV-1)?
➜ LTR (zonas reguladoras)de cada lado, que funcionam como promotores da transcrição e replicação;
➜ LTR apresentam 3 segmentos: : U3, R e U5;
➜ 3 sequências codificadoras principais:
✳ Gag (para estrutura);
✳ Pol (para replicação);
✳Env (glicoproteínas de reconhecimento para o envelope).
➜ Elementos reguladores essenciais:
✳ Regulatórios – tat e rev;
✳ Acessórios – nef, vif, vpr e vpu.
Os lentivírus são usados em TG por terem a capacidade de integrar o nosso transgene no genoma do hospedeiro. Porque é que os lentivírus são mais seguros para esse efeito do que os Retrovírus - Gama?
➜ Os lentivírus integram em regiões intrónicas ou intergénicas (próximos de intrões).
➜ Os retrovírus gamma integram sobretudo em regiões próximas do promotor ou zonas reguladoras.
➜ Em termos de integração, os lentivírus são mais seguros.
Descreva o ciclo replicativo do HIV-1 (um lentivírus).
- Liga-se à célula alvo através de recetores (CD4).
- O envelope funde-se com a membrana.
- Dentro do citoplasma liberta o que tem dentro (RT, IN e PR)– uncoating
a. Dá-se a transcrição reversa (RNA → DNA)
b. Forma um complexo, complexo pré-integração (PIC) - PIC é levado para o núcleo e entra através do poro nuclear
a. Ocorre a integração através da proteína integrase
b. Começa a transcrição em mRNA viral que vão para o citoplasma e dá-se a produção de proteínas virais. - A maturação final do vírus dá-se fora da célula através de modificações pós-transdução de algumas proteínas.
O que é que envolve a 3ª geração da produção de vetores lentivirais?
➜ Aumentou-se o grau de segurança:
o Percebeu-se que seria ideal retirar um dos elementos regulatórios para um 4º plasmídeo.
o Criação de vetores SIN
Em que consiste o pseudotyping ou pseudotipagem?
➜ Envolve alterar o targetting celular;
➜ Alterações das glicoproteínas do
envelope para determinar o seu tropismo.
Em que consiste o uso de Adaptadores na modificação dos vetores lentivirais?
➜ Envolve a combinação com polímeros/ lipossomas.
➜ O objetivo é prevenir interações e possível resposta do sistema imunitário.
Em que consistem as modificações dos sistemas genéticos dos vetores lentivirais?
➜ Envolve alterar o genoma lentiviral para que ele produza outra proteína.
Os Vetores SIN (ou Auto-inativação) foram uma das maneiras de reduzir o risco de recombinação e aumentar a segurança da terapia. Em que consiste?
➜ As zonas LTR3’ e LTR5’são zonas reguladoras importantes;
➜ É colocada uma mutação/ deleção na zona U3 (serve de molde) e não há replicação.
➜ Ao infetar uma célula com um número determinado de vírus, não há formação de mais e mantém-se a expressão do transgene.
Em que consistem os vetores não integrativos?
➜ O transgene não é integrado no genoma do hospedeiro;
➜ Devido a: Mutações pontuais em cada uma das zonas reguladoras e a Mutação na própria integrase.
Caracterize os Retrovírus Gama de acordo com os critérios usados na classificação de vírus.
➜ Infetam apenas células em divisão (mitóticas);
➜ Tendência em integrar zonas exónicas (exões) ou nos promotores, levando à mutagénese dessas células.
➜ Altamente infeciosos.
➜ Capacidade de carga: 8-9 kb.
Nota: Usados no ensaio ADA-SCID (meninos que desenvolveram leucemia).
Quais são algumas vantagens do uso de Retrovírus Gamma?
➜ Simplicidade genética;
➜ Tropismo vasto;
➜ Baixa imunogenicidade;
➜ Baixa imunidade;
➜ Produção Fácil;
➜ Expressão duradoura;
➜ Integração no genoma.
Quais são algumas desvantagens do uso de Retrovírus Gamma?
➜ Transdução de células mitóticas;
➜ Baixa especificidade celular;
➜ Alto risco de mutagénese;
➜ Baixa estabilidade.
Caracterize os Adenovírus de acordo com os critérios de classificação de vírus.
➜ Simetria icosaédrica (cápsideo
composto por 240 proteínas – hexons);
➜ Não têm envelope;
➜ Material genético: DNA de cadeia dupla
linear;
➜ Fibras e Domínios Knob: importantes em termos de adesão e entrada nas células.
➜ Base do pentão – proteína que está na base das fibras;
➜ Tamanho: 35 kb.
Qual a constituição/estrutura genómica de um Adenovírus?
➜ Flanqueado por 2 zonas ITRs (inverted terminal repeats) (zona reguladoras da transcrição e integração);
➜ 2 grandes unidades de transcrição:
❋Early transcription units (E1, E2, E3 e E4) - produção de proteínas reguladoras;
❋ Late transcription units (MLTU) – produção das proteínas estruturais.
Descreva o ciclo replicativo do Adenovírus.
- Adsorção - ligação do vírus à membrana celular da célula mediada pelas fibras e knobs.
- Entrada pela claterina (endocitose)
- Direcionada para o endossoma e há um desempacotamento parcial – vírus perde fibras e knobs.
- Cápsideo vai para o núcleo e liberta material genético.
- Dentro do núcleo, o DNA do vírus começa a ser expresso: o mRNA viral é transcrito e as proteínas virais começam a ser sintetizadas.
- Maturação dos vírus e a sua libertação – feita com a destruição da membrana celular (lise celular)
Em que consiste a 3ª geração da produção de vetores adenovirais?
➜ Retira-se tudo com a exceção das ITRs e o sinal de empacotamento
➜ Aumenta bastante o espaço para clonagem (35 kb) e a segurança.
Na produção de vetores adenovirais o plasmídeo não inclui nenhum promotor. Como se dá a produção do trasngene?
➜ A Transfeção tem que ter 2 plasmídeos (3ª geração + vetor helper). Ao introduzir vetor helper, a nossa produção vai ter 2 vírus – contaminação na produção viral.
➜ Sistema Cre-Lox: coloca-se tudo dentro da célula, mas antes de recolher o vírus colocase a enzima Cre-Lox, que ao cortar a zona especifica, vai impedir que haja o sinal de empacotamento e conseguimos ter uma produção de 95% de pureza.
Em que consistem as estratégias de melhoramento ou as modificações dos vetores adenovirais?
➜ Foram desenvolvidas com o objetivo de ultrapassar a inflamação causada pela
resposta à replicação viral e ultrapassar a resposta imune inata.
➜ Isso envolveu modificações genéticas e químicas.
No melhoramento de vetores adenovirais, em que consistem as modificações químicas?
➜ Modificação de superfície (fibras)
➜ Modificação do hexão
➜ Partículas quiméricas
➜ Promotores específicos
Nota. aqui o objetivo é usar diferentes materiais para prevenir a interação do capsídeo viral com os recetores imunológicos específicos.
Caracterize os Vírus Adeno - Associados de acordo com os critérios de classificação de vírus.
➜ Cadeia simples de DNA;
➜ Não têm envelope;
➜ São extremamente pequenos;
➜ Capsídeo com simetria icosaédrica (composta por 60 proteínas)
Qual a constituição/estrutura genómica de um Vírus Adeno - associado?
➜ 2 ORFs: rep e cap;
➜ Flanqueado por 1 ITRs;
➜ 3 promotores virais: p5, p19 e p40
❋ rep ORF - importante na replicação
❋ cap ORF- importante para as proteínas da capsídeo.
Os Adeno-associados apresentam diferentes serótipos com tecidos alvo diferentes ou diferentes tropismos. Hoje em dia, reconhecem-se 12 serótipos. Qual o serótipo capaz de atravessar a barreira hematoencefélica?
- AAV9!
Descreva o ciclo replicativo de um vírus Adeno - associado.
- Ligação aos recetores da célula (específica consoante o serótipo) e internalizaçã.
- Entrada por endocitose, e escapam ao endossoma através do aumento do pH (lise do endossoma)
- Entrada no núcleo e desempacotamento (uncoating).
- No nucleoplasma, dá-se a transcrição do mRNA viral e depois das proteínas.
O ciclo replicativo dos AVV é altamente dependente do estado fisiológico e maquinaria da célula. Em que situação é que ocorre uma infeção ativa?
➜ Para que haja replicação de adeno-associados as células que afetam tem de estar sujeitos a um estímulo, como uma infeção por adenovírus.
➜ Se a célula estiver “saudável”, o AAV entra num estado latente.
Quais são algumas estratégias de melhoramento da produção de vetores adeno-associados?
➜ Transcapsidação;
➜ Capsídeo mosaico;
➜ Capsídeo quimera.
Caracterize os Vírus Herpes Simplex de acordo com os critérios de classificação de vírus.
➜ Envelope – glicoproteínas importantes para a infeção das células;
➜ Capsídeo – simetria icosaédrica;
➜ Tegumento (entre envelope e a cápside), formado por proteínas – camada amorfa;
➜ Cadeia Dupla de DNA.
O que torna o vírus Herpes Simplex, um bom candidato a vetor em TG?
➜ São capazes de infetar células mitóticas e pós-mitóticas
➜ Tropismo amplo devido às glicoproteínas que possuem
➜ Altamente infeciosos (por isso têm elevada toxicidade e podem despertar uma forte resposta imunitária)
Caracteriza o vírus Vaccinia de acordo com os critérios para classificação de vírus.
➜ Vírus de dupla cadeia de DNA
➜ Têm envelope
➜ São um vírus citoplasmático (ciclo replicativo acontece no citoplasma)
➜ Possui 2 formas infeciosas:
❋ Uma forma imatura (intracelular)
❋ Uma forma madura (extracelular)
Caracteriza o vírus Baculovírus de acordo com os critérios para classificação de vírus.
➜ Nunca foram utilizados no ser humano;.
➜ Infetam insetos
➜ Não se replicam em mamíferos (vantagem)
➜ Têm uma dupla cadeia de DNA (180kb)
➜ Têm 2 formas - Uma das formas serve para a passagem entre hospedeiros e, a outra forma, serve para se replicar (dentro do hospedeiro) e aumentar o seu número de cópias.
➜ Ciclo de vida mais complexo
Qual é uma característica importante de um vetor viral ideal?
a) Baixa capacidade de carga
b) Alta eficiência transgênica
c) Facilidade de degradação
d) Replicação incontrolada
Alínea B!
Qual dos seguintes vetores virais é mais utilizado em terapia gênica derivado do HIV?
a) Adenovírus
b) Lentivírus
c) Retrovírus
d) Vaccinia
Alínea B!
Quais são as principais características removidas nos vetores virais para segurança?
a) Elementos infecciosos
b) Capacidade de replicação
c) Glicoproteínas estruturais
d) Genes supressores
Alínea A!
O que torna o lentivírus particularmente útil como vetor viral?
a) Infecção de células mitóticas
b) Capacidade de integração estável
c) Tropismo restrito
d) Replicação não limitada
Alínea C!
Qual o principal desafio dos vetores virais oncolíticos?
a) Alta imunogenicidade
b) Toxicidade baixa
c) Capacidade de infectar tecidos saudáveis
d) Incapacidade de se replicar
Alínea C!
Por que os baculovírus são considerados interessantes, mas não aplicados em humanos?
a) Alta toxicidade
b) Infetam apenas insetos
c) Não possuem envelope
d) Têm material genético instável
Alínea B!
Qual é uma vantagem dos vírus oncolíticos?
a) Alta seletividade para células tumorais
b) Replicação sistêmica
c) Reduzem inflamação local
d) São completamente não imunogênicos
Alínea A!
Que característica crítica os vetores adenovirais possuem?
a) Transdução de células pós-mitóticas
b) Baixa toxicidade
c) Replicação exclusiva em células tumorais
d) Alta expressão transgênica
Alínea D!
Qual estratégia é usada para atenuar a toxicidade natural de vetores virais?
a) Remoção de promotores virais
b) Uso de CRISPR
c) Replicação seletiva
d) Redução de tamanho
Alínea C!
Em que tipo de terapia os vírus vaccinia são mais aplicáveis?
a) Terapia gênica aditiva
b) Terapia suicida
c) Silenciamento genético
d) Tratamento de HIV
Alínea B!
Qual é a principal característica do genoma do lentivírus?
a) DNA de fita dupla circular
b) RNA de cadeia simples
c) DNA de cadeia dupla linear
d) RNA de cadeia dupla
Alínea B!
O genoma do adenovírus é composto por qual tipo de material genético?
a) DNA de cadeia dupla linear
b) RNA de cadeia simples
c) RNA de cadeia dupla
d) DNA de fita simples
Alínea A!
Qual é a função dos elementos LTR (Long Terminal Repeats) no genoma do lentivírus?
a) Promover a replicação do vírus
b) Codificar proteínas estruturais
c) Regular a transcrição e replicação do vírus
d) Facilitar a integração no genoma da célula hospedeira
Alínea C!
Quais são as sequências codificadoras principais no genoma do lentivírus?
a) Gag, Pol, Env
b) Gag, Nef, Tat
c) Pol, Tat, Rev
d) Env, Pol, Vif
Alínea A!
Qual das características do genoma do adenovírus é importante para a terapia gênica?
a) Não se integra no genoma da célula hospedeira
b) Capacidade de integração estável em células não mitóticas
c) Codifica para proteínas de envelope apenas
d) Grande capacidade de carga (aproximadamente 35 kb)
Alínea D!
