Replikacija DNA Flashcards
1
Q
kakšna je replikacija DNA?
A
semikonzervativna
2
Q
kako poteka sinteza nove DNA? energija?
A
z dodajanjem dNTP
energija za nastanek vezi pride iz razcepa fosfoanhidridne vezi med fosfati
3
Q
kakšna vez nastane pri replikaciji DNA?
A
fosfodiesterska med fosfatom enega in 3’ -OH skupino deoksiriboze drugega nukleotida
4
Q
v kateri smeri poteka replikacija DNA? posledica?
A
5’ –> 3’
ob verigi 3’ –> 5’ lahko poteka kontinuirano, ob verigi 5’ –> 3’ pa diskontinuirano (v Okazakijevih fragmentih)
5
Q
kaj je potrebno za replikacijo DNA?
A
matrična veriga, primer (začetni RNA oligonukleotidi), prekurzorji DNA - dNTPji, encimi (DNA polimeraza, helikaza, ligaza, primaza, topoizomeraza, nukleaza), drugi proteini (SSB, drseče objemalke, replikacijski faktorji)
6
Q
kako se začne replikacija DNA? kaj je potrebno?
A
- z vezavo iniciacijskih faktorjev je omogočena vezava helikaze:
- helikaza drsi po DNA in razprira dvojno vijačnico
- na ločeni verigi se vežejo SSB proteini
helikaza porablja energijo hidrolize ATP
7
Q
kako se vežejo SSB?
A
kooperativno - vezava SSB olajša vezavo naslednjih SSB
8
Q
kaj je funkcija topoizomeraz?
A
- pri razklepanju verig DNA, se zapleta v superzvitje –> velik navor in napetost, ki se mora sprostiti
- topoizomeraze katalizirajo transesterifikacije –> prekinitve DNA verige in ponovne povezave
9
Q
vrste topoizomeraz?
A
I (prokariontska) –> prekine se eno od verig
II (evkariontska) –> prekineta se obe verigi, ATP se porablja
10
Q
kaj je funkcija DNA primaze?
A
izdela “primer” - kratek oligonukleotid iz ribonukleotidov, ki omogoča vezavo DNA polimeraze
11
Q
kaj je funkcija DNA polimeraz?
A
katalizirajo transesterifikacije - nastanek fosfodiesterskih vezi preko fosfata med deoksiribozama sosednjih nukleotidoma
12
Q
reakcija, ki jo katalizira DNA polimeraza
A
(dNMP)n + dNTP –> (dNMP)n+1 + PPi
13
Q
kaj pomeni procesivnost DNA polimeraze? kaj omogoča to?
A
- encim se “drži” DNA verige dalj kot le za eno reakcijo - tako sinteza poteka hitreje, saj se ne rabi vsakič znova vezati
- drseče objemalke vežejo DNA polimerazo na verigo DNA
14
Q
kako so sestavljene drseče objemalke pri prokariontih in sesalcih?
A
P: beta podenota DNA polimeraze III
S: trimer iz PCNA podenot
15
Q
pri čem imajo DNA polimeraze še pomembno vlogo? kdaj?
A
pri natančnosti podvojevanja, saj:
- imajo “proofreading” sposobnost - 3’–>5’ eksonukleazno aktivnost (odstranjevanje napačnih nukleotiodov iz rastočega konca – MED replikacijo
- imajo mismatch repair posobnost (odstranjevanje napačnih nukleotnih parov PO replikaciji)
16
Q
kako se odstranijo RNA primerji pri prokariontih?
A
- RNaza H prepozna RNA duplekse in jih cepi (je endonukleaza)
- ker RNaza ne odstrani vseh ribonukleotidov, še ostanejo na 5’ –> 5’ eksonukleaza jih odstrani
- DNA polimeraza I zapolni vrzel
- ligaza poveže verige
17
Q
kaj je primosom?
A
primaza + helikaza
18
Q
kako deluje ligaza?
A
- ligaza se aktivira z adenilacijo tirozinskega ostanka s pomočjo AMP
- z AMP ligaza aktivira 5’ fosfat –> nastane fosfoanhidridna vez (med 2 fosfatoma)
- 3’ -OH skupina napade aktiviran 5’ fosfat –> nastane fosfodiesterska vez in AMP se odcepi
19
Q
kaj gradi prokariontski replisom?
A
helikaza, SSB, topoizomeraza, primaza, DNA polimeraza III, RNaza H, 5’ eksonukleaza, ligaza
20
Q
od kod pride AMP za aktivacijo ligaze?
A
pri prokariontih: 2ADP –> AMP + ATP
pri evkariontih: NAD+ –> AMP + NMN
21
Q
potek začetka replikacije DNA pri prokariontih? kje?
A
- na DNA se vežejo iniciacijski proteini - 30 DnaA in 1 DnaC
- veže se helikaza - DnaB (ločitev verig)
- vežejo se giraza, SSB, primaza - DnaG –> nastane primosom
- nastane primer, veže se DNA polimeraza III –> sinteza DNA
22
Q
vloge in aktivnosti različnih DNA polimeraz pri prokariontih
A
I: odstranitev primerja, zapolnitev vrzeli, popravljanje napak z izrezovanjem baze (5’–>3’ polimerazna, 5’–>3’ eksonukleazna, 3’–>5’ eksonukleazna)
II: popravljanje DNA (5’–>3’ polimerazna, 3’–>5’ eksonukleazna)
III: sinteza vodilne, sledilne verige (5’–>3’ polimerazna, 3’–>5’ eksonukleazna)
IV, V: TLR (trans-lesion repair) (5’–>3’ polimerazna)
23
Q
kaj je 3’–>5’ eksonukleazna aktivnost?
A
proofreading
24
Q
po čem se razlikujejo DNA polimeraze? posledica?
A
hitrost delovanja in procesivnost
ker je DNA polimeraza III najhitrejša in ima največjo procesivnost je glavna replikativna polimeraza
25
zgradba DNA polimeraze III
```
ima obliko asimetričnega dimera:
alfa: polimerazna aktivnost
beta 2: drseče objemalke
tau 2: povezava monomerov
epsilon: proofreading
gama, delta, delta 2, hi, psi: namestitev in odpiranje drseče objemalke
theta: nastanek fosfodiesterske vezi
```
26
kaj so glavne razlike med replikacijo DNA pri prokariontih in evkariontih?
E:
- počasnejše podvajanje
- več OriC mest (sočasno podvajanje)
- telomere imajo poseben način podvajanja
- polimeraze so kompleksnejše in bolj specializiranje
- krajši Okazakijevi fragmenti
27
kaj so posebnosti replikacije pri evkariontih?
- poteka v skladu s celičnim ciklom (samo med fazo S)
- nastane več replikacijskih mehurčkov --> ko se združijo, ko je konec replikacije
- replikacijski mehurček ima na obeh straneh replikacijske vilice
28
kako poteka začetek replikacije pri evkariontih?
- na OriC se veže ORC
- na ORC se veže MCM s šibko helikazno aktivnostjo --> nastane prereplikacijski kompleks
- ciklini in Cdk aktivirajo ORC --> nastane replisom
- DNA se razpre, vežejo se RPA
- DNA primaza naredi primer
- DNA polimeraze se aktivirajo
29
funkcija in aktivnost različnih DNA polimeraz pri evkariontih
alfa: sodeluje pri nastanku primerja, popravljanje DNA, replikacija
beta: popravljanje DNA
gama: replikacija mtDNA (3'-->5' eksonukleazna)
delta: sinteza zaostajajoče verige DNA (3'-->5' eksonukleazna)
epsilon: sinteza vodilne verige DNA (3'-->5' eksonukleazna)
kapa, eta, ksi, jota: popravljanje DNA
30
razlike med encimi replikacije prokariontov in evkariontov
- P: SSB, E: RPA
- P: DnaB, E: helikaza
- P: DNA polimeraza III, E: DNA polimeraza delta in epsilon
- P: DnaG, E: ligaza
- P: topoizomeraza II, E: topoizomeraza I
- P: DNA primaza, E: DNA primaza v kompleksu z DNA polimerazo alfa
- P: DNA polimeraza I, E: DNA polimeraza alfa
- P: podenota delta DNA polimeraze III, E: PCNA
- P: podenota gama in delta DNA polimeraze III, E: RFC
- P: eksonukleazna aktivnosti DNA polimeraze I, E: RNaza H, FEN1, Dna2
- P: ligaza uporablja NAD+, E: ligaza uporablja ATP
31
kaj sestavlja ekvariontski replisom?
DNA helikaza, RPA, topoizomeraza I, DNA primaza, DNA polimeraza alfa, DNA polimeraza delta in epsilon, PNCA - drseča objemalka, RFC, ligaza
32
kako poteka odstranjevanje primerjev pri evkariontih?
1. DNA poli delta izpodrine Okazakijeve fragmente med sintezo --> nastanejo "zavihki"
2. FEN1 in RNaza H odstranita zavihke
3. DNA poli delta zapolni vrzeli
4. ligaza poveže verige
*če so zavihki daljši --> Dna2 skrajša zavihke, FEN1 jih odstrani
33
zakaj so telomeraze potrebne?
DNA se na telomerah ZAOSTAJAJOČE verige ne more podvajati, ker se DNA polimeraza nima na kaj pripeti, ker primaza ne mora narediti primerja
34
ali je telomeraza povsod aktivna?
v večini celic ni, zato se telomere krajšajo
| izjeme so nesmrtne celice in zarodne celice
35
kako so sestavljene telomere?
iz kratkih tandemskih zaporedij TTAGGG
36
kako so sestavljene telomere?
- so nukleoprotenski kompleksi
| - v telomerazah so shelterini
37
kaj so sheltrini? zgradba?
proteini v telomerah, ki uravnavajo telomerazno aktivnost in ščitijo telomere
- gradijo jih podenote TRF1, TRF2, POT1
38
sestava in mehanizem delovanja telomeraz?
telomeraze so ribonukleoproteini: proteinske podenote, telomerazna RNA (komplementarna STR zaporedju = AAUCCC)
mehanizem:
1. telomerazna RNA se veže na telomero komplementarno
2. telomeraza uporabi 3' kot primer - podaljša ga tako, da na svoje RNA nukleotide veže DNA nukleotide (podobno reverzni transkriptazi)
3. ko je 3' rep dovolj podaljšan se gor veže primaza --> naredi primer
4. DNA polimeraza se veže gor in sintetizira zaostajočo verigo
39
kaj ostane po koncu delovanja telomeraz? kaj se zgodi s tem?
podaljšek na 3' koncu, ki s proteini ustvari strukture za zaščiti konce kromosomoov pred nukleazami in drugimi poškodbami
40
kako se regulira dolžina telomer?
s shelterini:
1) ko poteka replikacija se telomere skrajšajo --> TRF1 je manj
2) delujejo telomeraze in podaljšajo telomere --> več TRF1 --> aktivirajo se PINX1, ki inhibira delovanje telomeraz
41
kako je zgrajena mtDNA?
ima obliko krožnega kromosoma iz lahke in težke verige
- vsaka ima mesto Ori (OriH in OriL)
- NCR = nekodirajoče območje
- LSP (promotor lahke verige)
- HSP (promotor težke verige)
- TAS (s terminacijo povezano zaporedje)
42
kako je sestavljen replisom mtDNA?
- posebna helikaza TWINKLE
- posebni SSB
- posebno primazo POLRMT
- DNA polimeraza gama (podenota A in B)
43
kako poteka sinteza mtDNA?
začne se s sintezo vodilne verige (OriH), potem se sintetizira sledilna veriga (OriL)
44
kako se odstranijo primerji iz mtDNA?
3 mehanizmi:
1. RNaza H1 odstrani začetni del primerja, ostalo pa FEN1 ali MGME1
2. primer se oblikuje v zavihek (DNA polimeraza ga izpodrine)
- -> kratek zavihek odstrani FEN1
- -> dolg zavihek odstrani mtSSB, MGME1, FEN1 in Dna2
45
kaj je pogoj za popravilo napak z mismatch repair mehanizmom?
ločevanje novonastale verige in stare verige (da organizem določi katere nukleotide mora odstraniti) --> prepoznava po metilacijah (metilirana veriga je stara)
46
kako poteka mismatch repair pri prokariontih?
z MutS, MutL, MutH:
1. MutS prepozna nekomplementarno bazo in rekrutira MutL
2. MutL in MutS se povežeta v kompleks --> aktivira MutH
3. MutH (endonukleaza) cepi novo verigo in jo odstrani
47
kaj se zgodi z cepljeno verigo po mismatch repair pri prokariontih?
degradira se s pomočjo encimov, odvisno od smeri:
5'-->3' eksonukleaza VII ali RecJ
3'-->5' eksonukleaza I in X
48
kako ekvarionti prepoznajo katero verigo morajo odstraniti pri mismatch repair?
na enega izmed 3 načinov:
1. nemetiliran citozin v zaporedjih 5'-CG-3'
2. nepovezani Okazakijevi fragmenti
3. drseča objemalka
49
kako poteka mismatch repair pri evkariontih?
1) hMutS-alfa prepozna mesto mismatch napake ali majhne delecije in insercije
2) hMutS-beta prepozna daljše delecije in insercije
3) hMutL-alfa cepi okvarjeno verigo
4) eksonukleaza I s 3'-->5' nukleazno aktivnostjo razgradi verigo
5) DNA polimeraza delta in drseča objemalka zapolni vrzel
6) RPA stabilizirajo enojno verigo
7) DNA ligaza poveže verigi
50
kateri so načini inhibicije DNA replikacije?
1. inhibitorji encimov replikacije
2. molekule, ki se vežejo na DNA in ovirajo replikacijo
3. agensi povzročajo poškodbe DNA
4. inhibitorji, ki vplivajo na preskrbo z nukleotidi
51
uporaba in mehanizem delovanja ciprofloksacina?
inhibira girazo
| bakterijske infekcije
52
uporaba in mehanizem delovanja novobiocin?
inhibira girazo
| bakterijske infekcije
53
uporaba in mehanizem delovanja citozin arabinozid?
po fosforilaciji substrat polimeraze, ustavi replikacijo po vgraditvi
levkemija
54
uporaba in mehanizem delovanja aciklovir?
z virusno DNA se vgradi v DNA celic --> ustavi podaljševanje
| antivirusno (HSV I in II)
55
uporaba in mehanizem delovanja ganciklovir?
z virusno DNA se vgradi v DNA celic --> ustavi podaljševanje
| citomegalovirusne infekcije
56
uporaba in mehanizem delovanja ciklofosfamid?
aktivira se v jetrih --> alkilira gvanin --> povezava verig DNA
rak dojke, limfomi, levkemije
57
uporaba in mehanizem delovanja bleomicin?
tvorba ROS --> prelomi DNA
| rak testisov/jajčnikov
58
uporaba in mehanizem delovanja mitomicin?
reduciran alkilira gvanin --> povezave med DNA
| rak
59
uporaba in mehanizem delovanja cisplatin?
vezava na gvanin v DNA --> tvorba DNA adduktov
| rak testisov, jajčnikov, pljuč
60
uporaba in mehanizem delovanja karbiplatin?
vezava na gvanin v DNA --> tvorba DNA adduktov
| rak testisov, jajčnikov, pljuč
61
katere so vrste poškodb DNA?
ENDOGENE:
- spontane deaminacije baz
- spontane depurinacije zaradi cepitve glikozidnih vezi
- oksidacije z ROS
EKSOGENE:
- alkilacije
- tvorbe timinskih dimerov (UV)
- tvorbe adduktov s produkti peroksidacij lipidov, kancerogeni in kemoterapevtiki
- ionizirajoče sevanje
62
kaj so deaminacije? primeri?
z baze se odcepi amino skupina --> nastane druga baza (lahko nestandardna)
citozin --> uracil
adenin --> hipoksantin
63
kaj so depurinacije?
purinska baza se odstrani --> ostane samo ogrodje DNA brez baze
64
zakaj so deaminacije nevarne?
ker uvedejo novo bazo in tako se replicira napačna baza --> izgubi se informacija
65
zakaj so metilacije nevarne (na primeru)?
gvanin se metilira do O6-metilgvanina --> tvori namesto 3 vezi, 2 vezi --> ne more se več povezati z C ampak se s T --> dobimo napačno informacijo po replikaciji
66
kateri so mehanizmi popravljanja poškodb DNA?
1. direktno popravljanje (encimska demetilacija, fotoreaktivacija ciklobutanskih piramidinskih dimerov)
2. popravljanje z izrezovanjem (izrezovanje baz, nukleotidov ali mismatch repair)
3. popravljanje z rekombinacijo (homologna rekombinacija, nehomologno združevanje koncev)
4. sinteza preko mest poškodb (translezijska sinteza)
67
primeri direktnega popravljanja?
1) encimska demetilacija
- O6-metilgvanin se popravlja z O6-metilgvanin-DNA metiltransferazo --> prenese metilno skupino na lasten cisteinski ostanek
- 3-metilcitozin in 1-metiladenin se popravljata s pomočjo AlkB proteina in Fe2+ (metilna skupina se hidroksilira z alfa-ketoglutaratom --> nastane sukcinat --> odcepi se kot formaldehid) ***samo na enoverižni DNA
2) fotoreaktivacija ciklobutanskih dimerov
- timinski dimeri se popravljajo s pomočjo fotolaz --> uporabijo E svetlobe --> izničijo poškodbe UV svetlobe (koencimi = kromofori - FADH, folat)
68
kako poteka izrezovanje baz pri prokariontih? kdaj se uporablja?
uporablja se v primeru metiliranih, oksidiranih in deaminiranih baz
mehanizem:
1) DNA glikozilaza prepozna poškodovano bazo, jo odcepi --> nastane AP mesto
2) AP endonukleaza cepi verigo DNA na mestu poškodbe na 5' koncu --> nastane prost 3' OH radikal
3) DNA polimeraza I zapolni mesto poškodbe
4) DNA ligaza ligira verigi
69
kako poteka izrezovanje baz pri evkariontih?
mehanizem:
1) DNA glikozilaza prepozna poškodovano bazo, jo odcepi --> nastane AP mesto
2) AP endonukleaza cepi verigo DNA na mestu poškodbe na 5' koncu --> nastane prost 3' OH radikal
potem sta dve možnosti:
a) SHORT PATCH REPAIR: DNA polimeraza beta odcepi deoksiribofosfat in namesto njega veže nukleotid, DNA ligaza III ligira vrzel
b) LONG PATCH REPAIR: DNA polimeraza delta/epsilon in DNA polimeraza beta skupaj sintetizirata daljši odsek DNA --> nastane privs --> FEN1 ga odstrani --> DNA ligaza I ligira vrzel
70
kako poteka izrezovanej nukleotidov pri prokariontih?
1) UvrA prepozna poškodbo
2) UvrB se veže na poškodbo in pritegne UvrC
3) UvrB in UvrC cepita verigo DNA (ob poškodbi in 8 nukleotidov navzgor)
4) helikaza UvrD odstrani fragment
5) DNA polimeraza I in DNA ligaza zapolnita vrzel
71
kako poteka izrezovanje nukleotidov pri evkariontih?
1) XPC prepozna poškodbo
2) helikazi XPB in XPD odpreta verigo --> nastane mehurček
3) XPA se veže na mesto poškodbe in pritegne endonukleaze
4) endonukleazi XPF (5') in XPG (3') cepita verigo
5) DNA polimeraza delta/epsilon in DNA ligaza zapolnita vrzel
72
kako pride do popravljanja med transkripcijo?
proteina CSA in CSB prepoznata nepremikajočo se RNA polimerazo, jo odrineta in pritegneta popravljalne proteine
