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Unifying Concepts of Bimolecular Synthesis > Replication > Flashcards

Replication Flashcards

1
Q

Welchen Unterschied gibt es zwischen (1) DNA Polymerase und (2) RNA Polymerase in den Aspekten (A) Nucleic Acid synthesized (5’»3’) (B) Required Template © Required substrates (D) Required Primer (E) Proofreading activity (3’»5’ exonuclease)?

A

(1) (2)
(A) DNA RNA
(B) DNA DNA
© dATP,dGTP,.. ATP,GTP,…
(D) RNA o. DNA keiner
(E) Ja Nein

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2
Q

Welche 6 Komponenten und Regenten werden für einen klassischen PCR-Aufbau benötigt?

A

(1) ein DNA Template, welches die DNA-Target-Region hat zum amplifizieren
(2) eine DNA Polymerase
(3) 2 DNA Primer
(4) Deoxynucleosid Triphosphate dNTP
(5) Puffer-Lösung
(6) small reaction tubes, that fit into a thermal cycler

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3
Q

Welche DNA-Polymerase wird für die PCR genutzt?

A

Die hitzebeständige Taq-Polymerase wird häufig genutzt, weil es intact remaint während der sich wiederholenden high-temp DNA Denaturierung

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4
Q

Welche Info gibt es zu den DNA Primer bei der PCR?

A

zwei DNA-Primern, die komplementär zu den 3’-Enden (drei Primern) der Sinn- und Anti-Sinn-Stränge des DNA-Ziels sind. DNA-Polymerasen binden doppelsträngige (ds) DNA und polymerisieren einen neuen Strang immer in 5’→3’-Richtung, aber nur, wenn sie auf ein freies 3’-OH-Ende auf dem komplementären Strang des Vorlagenstrangs treffen, mit dem sie beginnen.

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5
Q

welche Infos gibt es zu der zu der Puffer-Lösung bei der klassischen PCR?

A

eine Pufferlösung, die ein geeignetes chemisches Umfeld für eine optimale Aktivität und Stabilität der DNA-Polymerase bietet, insbesondere zweiwertige Kationen, typischerweise Magnesium- (Mg) oder Mangan- (Mn) Ionen; am häufigsten wird Mg2+ verwendet, aber auch Mn2+ kann für die PCR-vermittelte DNA-Mutagenese eingesetzt werden.

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6
Q

Aus welchen 3 Phase besteht der PCR Cycle?

A

(1) dsDNA melting(90-95°C)
(2) Primer annealing (55-70°C) abhängig von melting temp. of the primers
(3) DNA Synthese. Taq Polymerase hat ein optimum von 75-80°C, mit einer Halbwertzeit von mehr als 2 Stunden bei 92.5°C, 40min bei 95°C und 9min 97.5°C und sie kann 1000 nt Strand der DNA in weniger als 10sek bei 72°C

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7
Q

Wie sehen die 3 Phase der PCR in vivo bei E. coli aus?

A

(1) melting = strand opening (“melting”) by initiator protein DnaA, RNA polymerases, strand-nicking by plasmid/phage initiator protein
continuous strand separation by helicase DnaB, phage helicases

(2) primer annealing = priming by primase DnaG (Hängt sich an Helikase an), RNA polymerase (ist DNA abhängig)

(3) DNA Synthese = DNA chain elongation by DNA Pol III holo-enzyme (kann es allein),
Pol I (PolA) (kann es nicht allein, Rest ist fehleranfällig), Pol II (PolB), Pol IV (DinB), Pol V (UmuDC), phage DNA polymerases

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8
Q

Wie viel Kopien habe ich im n-ten Zyklus bei der PCR?

A

2^n Kopien der DNA
Die DNAs mit den Sticky Ends wachsen Linear

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9
Q

Welche DNA Region wird erkannt und gebunden von der RNA Polymerase?

A

Die Promoter Region

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10
Q

Welche DNA Region wird erkannt und gebunden von der RNA Polymerase?

A

Eine A-T reiche Region am 3’ Ende

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11
Q

In welche Richtung synthetisiert die RNA Polymerase?

A

in 5’&raquo_space; 3’ Richtung

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12
Q

In welche Richtung synthetisier die DNA Polymerase?

A

in 5’&raquo_space; 3’ Richtung

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13
Q

Welcher Typ von Nukleotiden wird von der RNA Polymerase genutzt?

A

ATP, GTP, CTP, UTP

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14
Q

Welcher Typ von Nukleotiden wird von der DNA Polymerase genutzt?

A

deoxynucleoside triphosphates (dNTPs, z.B. dATP, dGTP,…)

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15
Q

Welche Art von Primer wird von der DNA Polymerase erfordert?

A

RNA (selten DNA)

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16
Q

Welche Art von Primer wird von der RNA Polymerase erfordert?

A

keiner

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17
Q

Hat die DNA Polymerase eine Proofreading Fähigkeit?

A

Ja

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18
Q

Hat die RNA Polymerase eine Proofreading Fähigkeit?

A

Nein

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19
Q

Was macht die dam Methyltransferase?

A

Modifiziert Adenin am N6 der Sequenz GATC (wichtig für Fehlerkorrektur&raquo_space; nicht methylierter Strand wird korrigiert)

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20
Q

In welchen Formen kann die DNA vorliegen?

A

A
B&raquo_space; “normale” kommt an häufigsten vor
Z

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21
Q

Wo ist DNA hydrophob und hydrophil?

A

Hydrophil: Außen durch Phosphate
Hydrophob: innen

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22
Q

Wo ist DNA kovalent und wo non-kovalent gebunden?

A

kovalent: Zwischen OH-3’-Zucker&raquo_space; Phosphor-di-ester&raquo_space; 5’ Phosphate
non-kovalent: zwischen Basenpaaren

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23
Q

Durch wie viele Koordinaten kann die ein Basenpaar bzw eine Base charakterisiert werden?

A

6&raquo_space; kein starrer Strang sondern drehbar&raquo_space; shift, slide, rise, tilt, roll and twist

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24
Q

Haben Einzel und Doppelstang stacking forces?

A

Ja

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25
Q

Wie nennt man die strand separation auch?

A

melting

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26
Q

Wovon ist die accessibility der B-DNA abhängig?

A

Sequenz und Temperatur

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27
Q

Um wie viel Grad kann sich die DNA im (Integration host factor) IHF-DNA-Komplex biegen?

A

180°

28
Q

Was ist die Holliday junction der (Double Strand) dsDNA?

A

Die Holliday-Struktur oder das Holliday-Kreuz ist eine spezielle DNA-Struktur, die während der genetischen Rekombination, insbesondere der homologen Rekombination, entsteht. Sie ist nach dem Wissenschaftler Robin Holliday benannt, der 1964 die Struktur vorgeschlagen hat.

Die Holliday-Struktur ist eine Kreuzung von zwei Doppelsträngen der DNA, bei der sich die beiden Stränge an bestimmten Punkten überkreuzen und austauschen. Sie entsteht, wenn zwei DNA-Doppelstränge miteinander rekombinieren, normalerweise an ähnlichen oder homologen DNA-Sequenzen. Die Holliday-Struktur ist eine wichtige Intermediärstruktur im Prozess der homologen Rekombination, die zur Reparatur von DNA-Schäden, zur genetischen Vielfalt und zur korrekten Trennung von homologen Chromosomen während der Meiose beiträgt.

Die Holliday-Struktur ist eine Kreuzung von vier DNA-Strängen (zwei Doppelstränge) und kann unterschiedliche Konformationen haben, abhängig von der Orientierung der DNA-Stränge. Sie kann sich in einer “crossed-strand” oder einer “open-strand” Konfiguration befinden. Die “crossed-strand” Konfiguration bedeutet, dass die Stränge an den Überkreuzungspunkten gekreuzt sind, was den Austausch von DNA-Strängen zwischen den Doppelsträngen ermöglicht. Die “open-strand” Konfiguration bedeutet, dass die Stränge an den Überkreuzungspunkten getrennt sind, was die Bildung neuer DNA-Doppelstränge mit unterschiedlichen Kombinationen von Strängen ermöglicht.

Die Holliday-Struktur wird durch Enzyme wie die DNA-Rekombinase und die DNA-Endonuklease während der homologen Rekombination verarbeitet. Diese Enzyme sorgen für den Schnitt und die Neuanordnung der DNA-Stränge an den Überkreuzungspunkten, was zur Bildung von rekombinierten DNA-Molekülen führt.

Die Bildung und Verarbeitung von Holliday-Strukturen sind entscheidend für die genetische Vielfalt, die Wiederherstellung von beschädigter DNA und die korrekte Verteilung der genetischen Informationen während der Zellteilung und der Meiose.

29
Q

Was sind sekundäre Strukturelemente der RNA?

A
  • Doppelstang RNA (dsRNA)
  • Bulge (Ausbeulung: Base steht nach Außen)
  • Hairpin (stem loop)
  • clover leaf sek.
30
Q

Was sind tertiäre Strukturelemente der RNA?

A
  • two-stem junction (Doppelstrang mit zwei Basen nebeneinander nach Außen)
  • Kissing Haipins
  • cloverleaf ter.
31
Q

Was sagt das end-replication problem der linearen dsDNA aus?

A

In the lagging strand, DNA synthesis is based on a series of Okazaki fragments, each requiring an RNA primer. Without DNA to serve as tem- plate for a new primer, the replication machinery is unable to synthesize the sequence comple- mentary to the final primer
» The result is the “end-replication problem” in which some sequence is (theoretically) lost at each round of DNA replication.

IN BAKTERIEN:
hairpin generation by protelomerase TelA

32
Q

Wie funktioniert die -RNAI bei der Replikation des Original von ColE1-based plasmids?

A

the nascent transcript from the RNA II promoter forms 2nd-ary structures at the 5’ end but stays bound to the template at its 3’-OH end, forming a displacement loop (R-loop). RNase H trims the 3’-OH end, which then acts as primer for elongation by DNA Pol I. unidirectional replication proceeds for ~200 nt before DNA Pol III takes over for bidirectional replication at PAS (primosome as- sembly site).

33
Q

Wie funktioniert die +RNAI bei der Replikation des Original von ColE1-based plasmids?

A

the nascent transcript from the RNA II promoter forms 2nd-ary structures at the 5’ end, which hybridizes with the (antisense) RNA I transcript to form a stable RNA duplex. Duplex formation is promoted by Rop protein, leads to a collapse of the R-Loop and removal of the transcript from the template. With no free 3’-OH end for priming, DNA Pol I cannot start DNA synthesis.

34
Q

Was ist ColE1?

A

ColE1 plasmids have no dedicated copy number control mechanism, and segregation to daugther cell occurs randomly.

  • ColE1 is a basis for many artificial vectors used in the cloning process.
  • ColE1 plasmids are resistant to a wide range of antibiotics which makes these plasmids a great tool in genetic engineering.
  • The colicin genes are replaced by antibiotic resistance genes for industrial purposes.
35
Q

Wie funktioniert die rolling-circle replication (RCR)

A

(1) the first “nick” is set by an a site-specific nuclease (initiator protein) in one strand of the replication origin

In most system, this nuclease remains bound to the 5’- end. A replisome of host replication factors (helicase, DNA polymerase) assembles at the free 3’-OH end and performs unidirectional replication (elongation).

(2) Initiation of DNA synthesis
(3) Elongation of DNA synthesis
(4) one Round of DNA synthesis
(5.1) SS DNA phages and plasmids
(5.2) Lambda phage

36
Q

Wie läuft die rolling circle replication of ssDNA ab (Phage fd)?

A

(1) assembly of host replisome at (+)-strand ssh; (-)strand synthesis by host replisome

(2) introduction of negative supercoils by host gyrase, gp II initiator binding

(3) unwinding of nick-site by duo-bound gp II initiator

(4) nicking by dso-bound gp II initiator

(5) linkage of 5’-P end to Y res of gp II exposure of free 3’OH

(6) recruitment of host Rep helicase and and strand displacement

(7) displacement synthesis by host replisome

(8) restoration of covalent linkage of (+)strand by gp II initiator

(9.a) binding of (+)strand DNA by gp V SSB and packaging

(9.b) gab sealing by host ligase

> > resumption od replication

37
Q

Wie läuft die rolling circle replication von dsDNa phage P2 ab?

A

(1) circularization of linear phage DNA via cos sites, gap sealing by host ligase

(2) introduction of negative supercoils by host gyrase, host factor binding?

(3) A initiator binding to single-stranded ori

(4) nicking by ori-bound A initiator

(5) linkage of 5’-P end to Y454 of A, exposure of free 3’OH end

(6) recruitment of host Rep helicase and strand displacement

(7) displacement synthesis by host replisome

(8) recruitment of host replisome by phage proteins, priming of lagging-strand synthesis

(9) transfer of the 5’-end from Y454 to Y450 of A, restoring of covalent linkage in the lagging-strand template

(10) lagging strand synthesis by host replisome?

(11) linearization of dsDNA by phage packaging apparatus

38
Q

Wie läuft die RCR (Rolling cycle replication) in E.coli während der F plasmid conjugation

A

The F plasmid backbone is composed of the tra regions encoding all genes in- volved in conjugational transfer (light blue); the origin of transfer oriT (red); the leading region (green), which is the first to be transferred into the recipient cell; and the maintenance region (dark blue) involved in plasmid replication and partition.

i) The initiation of conjugation requires the expression of the tra genes. Some of the produced Tra proteins form the T4SS and the conjugative pilus that will re- cruit the recipient cell and mediate mating pair stabilization.

ii) Other Tra proteins constitute the relaxosome (TraI, TraM, and TraY), which, in combination with IHF, bind to oriT and prepare the plasmid for transfer by in- ducing the nicking reaction by the TraI relaxase.

iii) Interaction between the relaxosome and the Type IV Coupling Protein (T4CP) initiates the transfer of the T-strand by the T4SS.

iv, v) Transfer of the TraI-bound T-strand in the recipient is concomitant with the conversion of the ssDNA into dsDNA by RCR in the donor.

a. Upon entry into the recipient, the ssDNA T-strand is coated by the host chro- mosomal SSB, and the single-stranded promotor Frpo
adopts a stem-loop structure recognized by the host RNA pol to initiate the synthesis of RNA primers.
b. TraI performs the circularization of the fully internalized T-strand.
c. The RNA–DNA duplex is recognized by the host DNA polymerase to initiate
the complementary strand synthesis reaction.
d. Once the conversion of the ssDNA plasmid into dsDNA is completed, plasmid gene expression results in the phenotypic conversion of the recipient cell into a transconjugant cell.

39
Q

Was sind single-strand promotors bei der RCR

A

the single-stranded promotor Frpo in the E. coli F plasmid (upper figure) and related plasmids (lo- wer figure) adopts a stem-loop structure recogni- zed by the host RNA pol to initiate the synthesis of RNA primers and mRNA transcripts.

40
Q

Welche Form hat das Chromosom von E.coli?

A

Zirkulär. Ein Größe von ca. 4.6 Mb

41
Q

Was ist die Theta-Replikation

A

Die Theta-Replikation ist eine Methode der DNA-Replikation, die bei vielen zirkulären bakteriellen Chromosomen, wie beispielsweise demjenigen von Escherichia coli (E. coli), beobachtet wird. Sie ist eine der Methoden, mit denen Bakterien ihre DNA duplizieren.

Der Ablauf der Theta-Replikation eines zirkulären bakteriellen Chromosoms kann in mehreren Schritten beschrieben werden:

  1. Initiation: Der Prozess beginnt an einem bestimmten Punkt auf dem zirkulären DNA-Molekül, dem sogenannten Replikationsursprung (oriC). Proteine, darunter das DnaA-Protein, binden an diese Region und verursachen die Entwindung und Öffnung der DNA-Doppelhelix.

Das DUE ist das DNA-unwinding Element, wo das Strang-Öffnen passiert

  1. Helicase- und Single-Strand-Bindungsproteine: Ein Enzym namens DNA-Helicase, oft als DnaB bezeichnet, wird durch DnaA aktiviert und trennt die DNA-Doppelhelix auf. Single-Strand-Bindungsproteine (SSBs) binden an die entstandenen Einzelstränge, um ihre Exposition gegenüber Nukleasen und ihre erneute Hybridisierung zu verhindern.
  2. Primase und RNA-Primer-Synthese: Ein Enzym namens Primase synthetisiert kurze RNA-Primer, die als Startpunkte für die DNA-Synthese dienen. Diese Primer ermöglichen es der DNA-Polymerase, an den Einzelsträngen zu binden und neue DNA-Stränge zu synthetisieren.
  3. DNA-Polymerase-Primase-Komplex: Die Haupt-DNA-Polymerase in E. coli, DNA-Polymerase III (Pol III), ist Teil eines größeren Komplexes, der die Synthese der neuen DNA-Stränge katalysiert. Die Primase im Komplex synthetisiert die RNA-Primer, die dann von der DNA-Polymerase genutzt werden.
  4. Leading- und Lagging-Strand-Synthese: Da die DNA-Polymerase nur in 5’-3’-Richtung synthetisieren kann, wird der kontinuierliche Strang (Leading-Strang) direkt in Richtung der Replikationsgabel synthetisiert. Der diskontinuierliche Strang (Lagging-Strang) wird in Form von Okazaki-Fragmenten synthetisiert.
  5. DNA-Ligase: Die Okazaki-Fragmente auf dem Lagging-Strang müssen miteinander verbunden werden. DNA-Ligase verbindet die Phosphodiester-Bindungen zwischen den Fragmenten, um den neuen Strang zu vervollständigen.
  6. Termination: Die Theta-Replikation endet, wenn die Replikationsgabel den gesamten DNA-Kreis durchlaufen hat und die neuen DNA-Stränge vollständig synthetisiert wurden.

Die Theta-Replikation erhält die Kontinuität des zirkulären bakteriellen Chromosoms aufrecht, indem sie die Bildung eines neuen Chromosoms neben dem vorhandenen ermöglicht. Dieser Mechanismus stellt sicher, dass jede Tochterzelle nach der Zellteilung eine vollständige Kopie des bakteriellen Genoms erhält.

42
Q

Notes zur Theta-Replikation

A
  • DnaA filaments on oriC DNA promote unwinding (and helicase loading)
  • replicative helicase DnaB loading to oriC
  • negative regulation of replication initiation in E. coli by SeqA
43
Q

Welche Mechanismen regulieren die DNA Replikation Initiation in E.coli und un B.subtilis?

A

key regulators in E. coli influence the nucleotide-bound state of DnaA, those in B. subtilis influence the binding of ATP·DnaA to oriC.

Regulator bei E.coli: IHF, Fis, SeqA
Regulator bei B.subtilis: Son, SirA

44
Q

(p)ppGpp-meditated inhibition of chromosome replication in E.coli

A

replication inhibition occurs at the initiation level during (p)ppGpp accumulation. (p)ppGpp binds the RNA Pol (RNAP), indirectly affecting the global gene expression profile through RNAP-driven transcriptional reprogramming. Downregulated gene transcripts include dnaA, gidA, mioC, gyrA, and parC, leading to lack of de novo DnaA synthesis and possibly lowered transcriptional activation of oriC, which all together contribute in arresting replication initiation during (p)ppGpp accumulation.
Also, (p)ppGpp binds DnaG primase in vitro, but replication elongation remains unaffected in vivo. As GTP levels are not significantly reduced in E. coli during (p)ppGpp accumulation, and since GTP also binds DnaG, we hypothesize that GTP might outcompete (p)ppGpp in binding DnaG in vivo (this hypothesis is marked as *).

45
Q

(p)ppGpp-meditated inhibition of chromosome replication in B.subtilis

A

replication inhibition occurs at the elongation level during (p)ppGpp accumulation. (p)ppGpp binds IMP dehydrogenase, lowering the pool of available GTP, as well as DnaG. The significantly reduced level of GTP leads to DnaG binding of (p)ppGpp.
Substantial replication occurs at the B. subtilis origin during (p)ppGpp accumulation, possibly because (p)ppGpp does not directly bind RNAP, excluding any RNAP-driven transcriptional reprogramming, or any replication initiation proteins.

46
Q

Wie schnell ist die DNA Polymerase III (Holoenzyme)?

A

Sehr schnell!
in vitro: 400nt/s
in vivo: 1000nt/s&raquo_space; E.coli mit 4.6MB braucht 40min

47
Q

Aus welchen Untereinheiten besteht die DNA Polymerase III Holoenzym (Pol III HE) in E.coli?

A

Pol III core
DnaX complex
beta-clamp
Pol III’, Pol III*
Pol III HE

48
Q

Was macht das Pol III core aus?

A

the α subunit is the DNA polymerase; the ε subunit the 3’→5’ exonuclease employed in proofreading; the θ subunit modulates the proof-reading capacity of the Pol III core.

49
Q

Was macht das DnaX complex aus?

A

pentameric structure γτ2δδ’; the δ subunit is essential for clamp opening before its loading to dsDNA; the τ subunits contact one Pol III core each via the α subunits.

50
Q

Was macht die beta-clamp aus?

A

2 β subunits form the clamp that tether the Pol III core via the α subuit to DNA.

51
Q

Was macht Pol III’ und Pol III* aus?

A

subassemblies that can be purified from cell lysates.

52
Q

Was macht Pol III HE aus?

A

Pol III assembly active in the replication fork.

53
Q

Was sind Unterschiede zwischen den Enzymen der Replikation bei E.coli und bei B.subtilis?

A

Pol III&raquo_space; PolC
DnaC&raquo_space; DnaG

54
Q

Wie funktioniert die Primase und welche Interaktionen nimmt sie auf?

A

the helicase (DnaB hexamer) unwinds the parental DNA, positioning a single strand ready for primer formation. The RNA polymerase domain of one primase molecule (DnaG) forms a complex with the N-terminal Zn binding domain of another primase molecule and single-stranded DNA (ssDNA) in order to synthesize the primer. The primase C-terminus is the helicase-binding domain.

55
Q

Was ist der clamp loader?

A

is a circular pentamer that binds 3 ATP to the γτ2 subunits (blue/green). ATP binding changes the conformation and enables it to bind the β clamp (yellow), opening it through interaction of the clamp with the δ “wrench” (purple subunit, the δ’ subunit is in orange). Primed DNA can enter into the central chamber of the clamp loader, and this positions DNA through the opened clamp. ATP hydrolysis ejects the clamp loader, allowing the clamp to close around DNA.

56
Q

Wie sieht die E.coli Replikationsgabel in action aus?

A

A) as the lagging strand Pol III synthesizes an Okazaki fragment, the clamp loader opens a new clamp and the helicase recruits primase to the replication fork to initiate the next fragment.

B) after synthesis of the RNA primer, the clamp loader displaces primase and loads the clamp onto the new primer-template junction.

C) completion of Okazaki fragment synthesis triggers recycling of the lagging strand Pol III to the newly loaded clamp, leaving the old clamp behind.

D) the lagging strand Pol III synthesizes the new Okazaki fragment, completing a full cycle. Fork unwinding and leading strand synthesis continue throughout the cycle.

57
Q

Was sind zwei Modelle für Chromosomenreplikation?

A

A) Factory model
B) Train-on-Track model

58
Q

Was sagt das factory model aus?

A

Replication occurs within a stationary complex (red circle). DNA is pulled into the complex and then extruded, as shown by arrows.

59
Q

Was sagt das Train-onTrack-model aus?

A

Independent sister replication forks move around the cell in a dynamic manner, with variable overlap.

60
Q

Was sind bacterial cell cycle phases/periods?

A

1) C-period
2) D-Period

61
Q

Was sagt die C-period aus?

A

Cell growth occurs simultaneously with chromosome replication

62
Q

Was sagt die D-period aus?

A

cell division occurs after completion of chromosome replication.

63
Q

Welcher Unterschied ist zwischen langsamen und schnellen Wachstumsraten bei E.coli in regard zu der Replikation?

A

at the slowest growth rates, the chromosome rests in B/G1 before the replication period C/S starts. This is as in eukaryotes.

at faster growth rates, replication is continuous, and the B/G1 period disappears. The growth condition in our study is such that a new round of replication is initiated just before the previous one is terminated.

64
Q

In welchem Organismus kann es zu Polyploidy kommen?

A

Polyploidy (mehrfaches Vorhandensein von Chromosomenensätzen) kann z.B. in Synechococcus elongatus PCC 7942 vorkommen

65
Q

Wie sieht der Replikationsterminus aus?

A
  • Terminus Region gegenüber vom OriC = Ter (spezielle Sequenz)
  • Protein Tus (Ter-utilization substance) erkennt Region
    » Tus beendet Aktivität der Replikationsgabel
  • Stränge bleiben ineinander hängen bis Topoisomerase IV kommt um das aufzulösen
    » bei Zellteilung ein Chromosom pro Zelle

Unifying Concepts of Bimolecular Synthesis (11 decks)

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