Projet 3 Flashcards
Les étapes de clonage de la LDH (10)
1) PCR (insert et vecteur)
2) Analyse sur gel des fragments
3) Assemblage de Gibson
4) Transformation bactérienne
5) Préparation d’ADN plasmidique + quantification
6) Analyse avec enzyme de restriction
7) Séquençage
8) Induction de la LDH5-6xHis
9) Purification de la LDH5-6xHis
10) Dosage enzymatique
3 grandes étapes du PCR (1 cycle)
1) Dénaturation (30s à 94°C) séparer double brin
2) Renaturation (30s à 5°C sous Tm des amorces) liaison des amorces
3) Élongation (5 à 7 min à 72°C)
5 composantes du PCR
°ADN matrice
°Amorces
°dNTPs
°Tampon physiologique
°Polymérase thermophile
Gel d’agarose:
°Concept
°4 paramètres affectant la migration
°ADN chargé négativement migre vers anode
°1)Taille moléculaire ADN (ptit plus vite)
2) Concentration agarose (plus=moins vite)
3) Conformation ADN (circulaire, linéaire, superenroulée)
4) Courant appliquée
Gel d’agarose (suite):
°Comment analyser
°3 outils clés
°Position des bandes (tailles en pb) et intensité des bandes (quantité)
°1) Révélateur (Cybr safe) 2) Agarose 3) Tampon électrophorèse
°4 étapes assemblage de Gibson (thermosensible ou thermophile)
°1) Activité exo 5’ thermosensible
2) Hybridation régions homologues
3) ADN polymérase thermophile
4) ADN ligase thermophile
Transformation bactérienne:
°Concept
°Composantes du plasmide d’intérêt (3)
°Méthode (2 étapes)
°Introduire plasmide dans la bactérie les faire croître afin qu’il se réplique
°Origine de réplication, gène de sélection (ampr) et site de clonage multiple (MCS)
°CaCl2 rendant ADN moins polaire et incubation à 42°C (choc thermique) pour créer des pores dans la bactérie
Préparation d’ADN plasmidique:
°Concept
°Une bonne préparation d’ADN plasmidique contient:
°3 étapes
°Lyser bactérie et purifier plasmide d’intérêt
°ADN superenroulée
°1) Détergeant alcalin dénature prots, membrane et adn génomique
2) Plasmide dans le surnageant non dénaturé car superenroulé
3) Prots, membrane et adn génomique forment complexe avec dodécylsulfate
Quantification d’ADN plasmidique:
°Absorbance
°Calcul
°Pureté (3)
°260nm
°A260=1, on a 50µg/ml
°1) A260/280<1,8 contaminé par protéine ou phénol
2) A260/280= entre 1,8 et 2 pur
3) A260/280>2 contaminé par ARN
Analyse de l’assemblage par des enzymes de restriction:
°Concept
°C’est quoi une enzyme de restriction
°Digérer le produit d’assemblage par des enzymes de restriction in sillico et comparer su gel afin d’estimer la réussite du produit
°Une endonucléase qui hydrolyse l’ADN à des endroits précis correspondant à son palindrome
Expression de la LDHA-6xHis chez E.coli (2)
1) Ara C, dimère en amont bloquant la liaison de l’ARN polymérase au promoteur (pBAD)
2) Ajout d’arabinose libération du promoteur et induction de la transcription de la LDHA-6xHis
Purification de la LDHA-6xHis sur résine Ni-NTA:
°Concept
°4 étapes
°4 outils
°Les six résidus d’histidines se lient au ions Ni2+ et Cu2+ de la résine
°1) Adsorption LDH 2) Préparation colonne 3) Lavage colonne avec tampon de lyse 4) Élution
°1) Tampon de lyse 2) Résine NTA 3) Lysozyme 4) Imidazole (élution)
Analyse sur gel «Stain free»:
°Concept
Composé trihalo qui lorsque en présence de rayon UV fait des ponts avec le tryptophane et émet de la fluorescence
Détermination concentration protéique sans bleu de Coomassie:
°Concept
°Formule
°Tryptophane et tyrosine absorbe la lumière à 280nm
°Concentration= (1,55A280)-(0,76A260)
