Projet 2 Flashcards
°C’est quoi la LDH
°Réaction
°3 sous-unités et localisation
°Composition LDH5 et localisation
°Enzyme de 4 sous-unités
°Pyruvate (NADH) —–> Lactate (NAD+) (réversible)
°ldha (muscles), ldhb (coeur) et ldhc (couilles)
°4 x ldha et muscles
Extraction de la LDH via extrait brut:
°Concept
°2 outils clés
°3 étapes
°Homogénéisation mécanique d’un tissu afin de détruire les cellules et de répandre son contenu dans un tampon
°PMSF (inhibiteur de protéase à sérine), polytron
°1) Coupe tissu en ptit morceaux 2) Polytron 3) Filtration
Colonne échangeuse d’anion:
°Son nom en lab
°La colonne est chargée..
°Si pH>pI prots est…
°Solution d’élution et pk
°4 étapes
°DEAE sephacel
°Positivement
°Négative (donc peut se lier à la colonne)
°NaCl (Cl- va se lier à la résine et tasser la protéine adsorbée via compétition)
°1) Charger la colonne avec pH voulu 2) Adsorption réversible de la protéine 3) Laver avec mini concentration de NaCl 4) Élution avec NaCl
Colonne d’affinité:
°Son nom
°Phase stationnaire
°Éluant
°3 étapes
°Blue de sepharose
°Bleu Cibacron (imitant structure NAD+)
°NADH
°1) Adsorption de la protéine 2) Lavage 3) Élution
Dosage enzymatique LDH:
°1 unités de LDH
°Absorbance du NADH
°Unités activité enzymatique
°Unités activité spécifique
°Quantité requise de LDH pour convertir 1µmol de NADH par minute à T pièce et pH de 7,4
°340nm
°Unité/ml d’enzyme
°Unité/mg d’enzyme
Formule activité enzymatique
(Volume cuvette ml) (∆A340/min) (Facteur de dilution)/
(Largeur cuvette) (∑NADHmM) (Volume enzyme ml)
Dosage LDH (suite):
°Témoin 1
°Témoin 2
°On mesure quoi exactement en calculant l’activité spécifique
°Tris + pyruvate (blanc)
°Tris + pyruvate + NADH (A340 de départ)
°V0 (linéaire)
Bilan de purification:
°Activité totale
°Rendement %
°Facteur de purification
°Facteur de purification total
°Activité enzymatique * volume d’enzyme récolté
°(Activité totale/activité total au début) * 100
°(Activité spécifique/activité spécifique de l’étape précédente)
°(Activité spécifique/activité spécifique de l’échantillon de départ)
Paramètres enzymatiques:
°V0
°Vmax
°Km (2)
°Vitesse initiale: Transformation du substrat linéaire en fonction du temps
°V0 lorsque le substrat est en excès
°Concentration de substrat lorsque Vmax/2 ou 50% des sites actifs sont occupés
1) Graphique M-M
2) Lineweaver-Burk:
°Ordonnée à l’origine
°Abscisse à l’origine
1) Activité spécifique (V0) en fonction de [S]
2) 1/V0 en fonction de 1/[S]:
°1/Vmax
°-1/Km
Types d’inhibition:
1) Compétitive
2) Non compétitive
3) Incompétitve
1) Lie E (Km augmente, Vmax change pas)
2) Lie E et ES (Km change pas, Vmax diminue)
3) Lie ES (deux paramètres diminuent)
°C’est quoi le paramètre a?
°a<1
°a=1
°a>1
°C’est pour la compétition non compétitive
°Se lie plus à ES
°Se lie aux deux égales
°Se lie plus à E
°C’est quoi IC50
°Graphique
°Concentration d’inhibiteur requise pour inhiber de 50% l’activité de l’enzyme
°%Activité en fonction du log[I]
Dosage protéique:
°Comment
°Que doit on faire avant
°Bleu de Coomassie se lie aux résidus aromatiques et basiques et absorbe la lumière à 595 nm
°Une courbe de calibration
Gel de SDS:
°Concept
°4 étapes
°Séparer des protéine pour estimer leur quantité et leur degré de pureté
°1) Dénaturer prots (SDS+chauffer 95°C)
2) B-mercaptoéthanol brise ponts disulfures
3) SDS confére charge négative prots (migration vers anode)
4) Révéler bleu de coomassie
