Procesamiento de Muestras Flashcards
Pasos de preparación de un tejido
- Fijación
- Deshidratación
- Inclusión
- Corte
- Tinción
Fijación
Para preservar las propiedades de la muestra, similares a su estado in vivo.
Hay fijadores fisicos y fijadores químicos.
Fijadores Fisicos
Desecación Calor seco Calor húmedo Frío Congelación y desecación
Desecación
Sirve para cultivos líquidos. Los extendemos sobre el porta para que se evapore el agua, esencial para la supervivencia de patógenos y enzimas de la autólisis.
Para acelerar el proceso se puede poner el porta sobre una llama, pero esto no sirve para tejidos humanos porque se pierden las membranas de la célula.
Calor seco
Poner la muestra en una estufa a 65ºC.
Solo sirve para bacterias porque el calor destruye las membranas celulares. En bacterias queda la pared celular, por lo que se pueden ver las estructuras.
Calor humedo
Meter la muestra en agua hirviendo.
Desnaturaliza las proteínas y destruye patógenos.
Es muy agresivo porque degrada mucho los tejidos.
Frío
Tecnica rapida, poco duradera.
Hay que hacerlo rapido para que no se formen cristales de hielo, y usar CRIOPROTECTORES.
Detienes act metabolica de patogenos y la autolisis.
Para muestras que no conservemos.
Endurece la muestra lo suficiente que se puede pasar directo al corte.
Congelación y desecación
Congelar + quitar agua mediante LIOFILIZACION.
Muestra a una elevada presion para que el agua se sublime.
Fijadores químicos
Sustancias que consiguen los mismos efectos que los fijadores físicos. Ej. alcohol y formol
Son simples o compuestos.
Fijadores químicos simples
Un solo tipo de sustancia se usa para fijar la muestra
Fijadores químicos compuestos
Varios tipos de compuestos fijadores se utilizan a la vez. Acumula las ventajas, pero también los inconvenientes.
Deshidratación
Se endurece la muestra mediante una serie gradual de soluciones acuosas con concentraciones cada vez mayores de agentes deshidratantes.
Ej. alcohol o acetona
La concentracion no debe de ser tan alta que altere la forma de la muestra.
Inclusión
Incluir la muestra en un material que le de la dureza necesaria para poder cortarlo. El material es gelatina o parafina.
Se sumerge en el medio en un microondas a temperaturas altas, para que el material esté liquido y se pueda infiltrar en el tejido.
Despues se deja a temperatura ambiente o 4ºC para que solidifique, de manera que este lista para cortar.
Antes de teñir la muestra hay que eliminar el medio de inclusión y rehidratar la muestra.
Corte
Producir cortes de hasta 5-10 micrometros de grosor. Con diferentes aparatos como microtomo, criostato y vibratomo.
Hematoxilina-Eosina
Hematoxilina es básico, y tiñe de azul-violeta las estructuras ácidas. Tiñe basófilos. Núcleos, cromatina y ribosomas.
Eosina es ácido, y tiñe de rosa las estructuras básicas. Eosinófilas.
Wright y Giemsa
Se usa para diferenciar células sanguíneas.
Se usa eosina y azul de metileno (en lugar de hematoxilina).
La eosina tiñe de rosa los eritrocitos y los gránulos eosinófilos.
El azul de metileno tiñe de azul-morado el citoplasma de los monocitos y linfocitos.
PAS (Ácido Peryódico de Schiff)
Ácido peryódico y reactivo de Schiff.
Tiñe polisacáridos y oligosacáridos de color magenta o púrpura.
El reactivo de Schiff es el tinte, pero sin añadir el ácido no se verá el color.
Tiñe glucógeno, moco, membrana basal y fibras reticulares, por ejemplo.
Tricrómico de Masson
Se usan 3 colorantes:
1. Uno tiñe los núcleos de azul oscuro-morado
2. Fucsina: Tiñe estructuras básicas de rosa-rojo.
3. Azul de anillina: Tiñe el colágeno de color azul claro
Se utiliza para hacer comparaciones de las cantidades de colágeno que hay entre diferentes células.
Tinción argéntica
Se forman sales de plata que dan lugar a unos precipitados de color negro o marrón oscuro.
Identifica fibras reticulares, dendritas, axones y prolongaciones gliales.
Tinciones de Lípidos
Hay que usar un colorante hidrófobo y un disolvente hidrófobo.
El colorante más usado es el Sudán que da un color rojo, negro etc.
También se usa azul de Luxo que sirve para distinguir las vainas de mielina.
Se le da un contraste de hematoxilina-eosina.
Histoquímica Enzimática
Se usa para detectar la presencia de una enzima.
Se añade un sustrato a la muestra enzimática, para que esta lo transforme en un producto detectable.
Es importante que precipite, para saber donde esta exactamente la enzima, sino se esparce.
Si no precipita o no se ve el color, hay que añadir un marcador que reaccione con el producto de la reaccion y que este enseñe donde esta.
No se pueden usar los tipos de fijacion normales, menos la congelacion, porque se degradarian las enzimas y no actuarian.
Inmunohistoquímica
Se utilizan reacciones entre anticuerpos diseñados para dar una tinción, que se unen a antígenos.
Los anticuerpos usados pueden dar fluorescencia o pueden ir unidas a una enzima detectable.
Puede ser directa o indirecta.
Inmunohistoquímica directa
Solamente se usa un anticuerpo (primario).
Es el que se une al antígeno y además el que lleva el marcaje.
Puede dar falsos positivos porque se una a moleculas parecidas al antígeno.
Inmunohistoquímica indirecta
Se utiliza un anticuerpo primario, que se une al antígeno, y un anticuerpo secundario, que está lleva el marcaje y se une al anticuerpo primario.
Al haber más sitios de unión, hay más posibilidad de dar falsos positivos.
Autorradiografía
Incorporación de isótopos radioactivos a macromoléculas. Un isotopo común es el itrio (H3).
Se usan gránulos de plata, al ser expuestos a la radiacion oscureceran en las zonas donde se encuentren los isotopos.
Hibridación in Situ
Sirve para detectar ARN o ADN mediante hibridación por complementariedad de bases.
Se puede detectar el ARNm de ciertos genes y determinar asi si estos se estan expresando.
Sonda
Detecta el ADN virico de un virus determinado, asi se puede detectar aquellas celulas infectadas.
Hibridacion in Situ
Artefactos
Alteraciones producidas a causa del procesamiento.
Se pueden deber a retraccion por fijacion, colorante viejo precipitado, pérdida de moléculas, pliegues y mellas que provoca la cuchilla.
