Proba 2 Flashcards
FACTORII DE CARE DEPINDE REZOLUŢIA MICROSCOPULUI OPTIC (FORMULA LUI ABBE) ŞI CUM POATE FI ACEASTA ÎMBUNĂTĂŢITĂ?
Rezoluţia poate fi îmbunătăţită cu scăderea distanţei separatorii minime. Factori şi măsuri de îmbunătăţire:
a.) lungimea de undă (landa) scăderea lungimii de undă (microscopia de fluorescenţă cu raze UV sau microscopia electronică cu electroni)
b.) indicele de refracţie (n) creşterea n (microscopia de imersie cu ulei de cedru sau cu apă)
c.) unghiul de deschidere al lentilei frontale format de razele divergente extreme (α)
PĂRŢILE COMPONENTE ALE MICROSCOPULUI OPTIC
Microscopul optic este construit din trei părţi: partea mecanică, partea electronica şi partea optică.
a.) PARTEA MECANICĂ: picior, coloană, măsuţa microscopului, tubul, şurubul macro- şi micrometric,
revolverul
b.)PARTEA ELECTRONICĂ (APARATUL DE TRANSMIS LUMINA): sursa de lumină, întrerupătorul,
condendorul cu o diafragmă
c.) PARTEA OPTICĂ: obiectivul şi ocularul
AVANTAJELE EXAMINĂRII ÎN IMERSIE
a.) n mai mare rezoluţie crescută
b.) puterea de mărire mai crescută
c.) sunt eliminate fenomenele de reflexie şi refracţie a luminii toate razele pătrund în microscop şi
obiectivele dau o imagine mult mai luminoasă
APLICAȚIILE MEDICALE ALE EXAMINĂRII ÎN IMERSIE
a.) se observă corpusculul Barr (cromatina sexuală), de exemplu în celule din mucoasa bucală colorate cu albastru de toluidină
b.) se pot observa celulele roşii anucleate şi diferitele tipuri de globule albe (forma nucleului, raportul nucleo-citoplasmic, granulaţiile din celule)
FORMAREA IMAGINII ÎN MICROSCOPUL PE FOND ÎNTUNECAT
a.) se bazează pe fenomenul Tyndall, deci pe dispersia luminii de către particule foarte mici aflate într- o suspensie (analog observării prafului în lumină puternică)
b.) proba nu este iluminat direct, ci cu raze oblice printr-un condensor special
c.) pătrund în obiectiv numai razele dispersate de particule aflate în probă
APLICAȚIILE MEDICALE ȘI ÎN BIOLOGIE ALE MICROSCOPIEI PE FOND ÎNTUNECAT
Se foloseşte pentru examenul celulelor vii, care se văd şi la microscopul optic obişnuit, dar unele particularităţi se pot observa mai bine pe fond întunecat. De exemplu studiul spirochetelor permite diagnosticul sifilisului.
APLICAȚIILE MEDICALE ȘI ÎN BIOLOGIE ALE MICROSCOPIEI ÎN CONTRAST DE FAZĂ
Fiindcă celulele vii nu pot fi colorate fără moartea lor, microscopia în contrast de fază, asemenea microscopiei în fond întunecat se foloseşte pentru studiul celulelor vii fiindcă nu necesită folosirea coloranţilor. Această tehnică permite observarea structurii nucleului, distribuţia unor organite în citoplasmă, mişcările celulare şi modificările datorită diferitelor faze de diviziune celulară.
CE ESTE FENOMENUL DE FLUORESCENȚĂ ȘI CE SUNT FLUOROCROMII?
Fenomenul de fluorescenţă constă în revenirea la starea fundamentală a moleculelor excitate însoţită de emisie de radiaţie luminoasă ce are o energie inferioară radiaţiei absorbite. Lumina emisă va avea o lungime de undă mai mare. Substanţele care prezintă fenomenul respectiv se numesc fluorocromi, cum este şi acridin oranjul.
FORMAREA IMAGINII ÎN MICROSCOPUL DE FLUORESCENȚĂ
Microscopul de fluorescenţă prezintă ca sursă de lumină o lampă cu vapori de mercur ce emite radiaţii UV. Lumina trece printre filtre de excitaţie care permit să treacă numai razele cu lungimea de undă care vor excita fluorocromul. Lumina trece prin probă, excită moleculele fluorocrome. După trecerea prin obiectiv, prezenţa filtrului de baraj permite numai trecerea luminii emise de acestea, care trec prin ocular şi aceste zone fluorescente apar luminate pe un fond întunecat.
APLICAȚIILE MEDICALE ȘI ÎN BIOLOGIE ALE MICROSCOPIEI DE FLUORESCENȚĂ
Microscopia de fluorescenţă un spectru vast de aplicaţii biologice şi medicale. În biologie poate fi folosită pentru dovedirea fluidităţii membranare, prin studiul mobilităţii proteinelor de membrană. Este folosită asemenea pentru observarea lizozomilor care acumulează fluorocromi, pentru preparate colorate vital, în studiul cromozomilor, în studii de imunologie, de histochimie şi citochimie sau chiar şi pentru observarea autofluorescenţei (de pildă Hydrilla species).
SCHEMA DE FRACȚIONARE A CELULEI PRIN CENTRIFUGARE DIFERENȚIALĂ – EXPLICAȚIE PE IMAGINEA FRACȚIUNILOR SUBCELULARE OBSERVATE LA MICROSCOPUL ELECTRONIC DE TRANSMISIE.
Prin centrifugare diferenţială pot fi izolate diferite componente celulare. Prezenţa unor organite sau alte componente într-o fracţiune poate fi dovedită prin microscopie electronică. Fracţiunile celulare pot fi separate prin centrifugarea omogenatului la turaţii din ce în ce mai mari. Prima fracţiune după o centrifugare de 10 min la 600 g va fi cea nucleară. Analizând această fracţiune observăm la microscopul electronic de transmisie ultrastructura nucleului. A doua fracţiune după centrifugarea primului supernatant încă 10 min la 10000 g, va fi constituită din mitocondrii, lisosomi, peroxisomi. În această fracţiune se poate observa şi aparatul Golgi integral sau parţial. Aceste componente iarăşi pot fi observate la microscopul electronic. Al doilea supernatant după o centrifugare de 60 de minute la 100000 g sau de 10 minute la 10000 după tratare cu CaCl2 va sedimenta microsomii, formaţi din resturi de reticul endoplasmic neted şi rugos. Microzomii vor avea o formă sferică cu sau fără granulaţii ale ribosomilor pe suprafaţa lor externă.
DEFINIȚIA CROMATOGRAFIEI ȘI CE ESTE FACTORUL RF
Cromatografia este metoda care permite separarea substanţelor dintr-un amestec pe baza capacităţii de distribuţie între o fază staţionară şi una mobilă, având ca urmare deplasarea cu viteză diferită a componentelor purtate de faza mobilă de-a lungul fazei staţionare. Există mai multe tipuri de cromatografie ca şi cromatografia pe hârtie, în strat subţire, în fază gazoasă, HPLC etc.
Factorul RF exprimă viteza de deplasare a unei substanţe în raport cu faza mobilă (solventul).
INTERPRETAREA CROMATOGRAMEI LIPIDELOR EXTRASE (ORDINEA FRACȚIUNILOR LIPIDICE DE LA LINIA DE START LA FRONTUL SOLVENTULUI, FĂRĂ PROCENTE)
a.) pe linia de start rămân fosfolipidele
(ca şi fosfatidilcolina, fostaditiletanilamina, fosfatidilserina, cardiolipina etc.)
b.) colesterol
c.) monogliceride
d.) digliceride
e.) acizi graşi liberi
f.) trigliceride
IZOLAREA ADN-ULUI: PRINCIPIU
Prin centrifugare diferenţială prima fracţiune sedimentată va fi cea nucleară. După izolarea acesteia se distruge membrana nucleară de către detergentul dodecilsulfat de sodiu (SDS). Totodată se denaturează proteinele prin adăugarea de clorură de sodiu. Proteinele denaturate după o nouă centrifugare vor sedimenta. ADN-ul va rămâne în supernatant care, după adăugarea etanolului, va precipita sub forma unui nor filamentos, care se poate culege cu ajutorul unei pipete.
DEFINIȚIA ELECTROFOREZEI
Electroforeza este o metodă de separare a particulelor încărcate electric sub acţiunea unui câmp electric uniform aplicat din exterior. Migrarea particulelor sau ansamblurilor de particule se face spre unul dintre electrozi (anod sau catod). Moleculele de proteine şi de acizi nucleici au încărcătură electrică şi de aceea vor migra în câmp electric. Forţa care se exercită asupra moleculelor este determinată de câmpul electric şi de sarcina netă a moleculei, dar este invers proporţională cu vâscozitatea mediului şi cu dimensiunea moleculei.
