preparazione campione Flashcards
potere di risoluzione definizione e da cosa dipende?
minimo grado di distanza possibile tra due punti distinguibili, dipende dalla lunghezza d’onda della luce e dall’indice di rifrazione del mezzo
contrasto da cosa dipende?
dalla differenza di assorbimento della luce delle varie strutture cellulari o tissutali
come si calcola il limite di risoluzione del microscopio?
Con la formula di ABBE R= lambda/ n sen alfa
n= indice di rifrazione del mezzo di solito aria
alfa= angolo max di raccolta della luce
potere risoluzione max del microscopio ottico?
0,25 micrometri
tecniche di microscopia ottica (6)
microscopio ottico:
- a contrasto di fase
- a interferenza
- in campo scuro
- a luce polarizzata
- a fluorescenza
- confocale
microscopio ottico a contrasto di fase
sfrutta le differenze negli indici di rifrazione e trasformandole in differenze di intensità (si ha aumento di contrasto non risoluzione)
m.o. a interferenza
sfrutta due differenti lunghezze d’onda che incontrandosi creano un’interferenza e restituisce immagini 3D (a rilievo)
m.o. in campo scuro
il condensatore che illumina il campione è posto obliquamente e restituisce immagini chiare in campo scuro
m.o. luce polarizzata
sfruttan luce polarizzata che una volta che ha attraversato le strutture evidenzia l’organizzazione delle proteine fibrose del preparato
m.o. a fluorescenza
sfrutta la luce ultravioletta per ottenere l’immagine, è usato per sostanze che emettono luce visibile
m.o. confocale
sfrutta la luce laser permette di fare scansioni del preparato che possono essere sovrapposte e dare un immagine 3D
potere di risoluzione max microscopio elettronico?
0,4 nanometri
tipi di m.e.?
- a trasmissione (TEM)
- a scansione (SEM)
come funzione il m.e.?
Fascio di elettroni emessi da un catodo e accellerati nel vuoto attraversa il preparato al posto delle lenti ci sono campi elettrostatici e magnetici
TEM
immagini a grande risoluzione, gli elettroni attraversano le strutture biologiche come nel m.o.
SEM
meno risoluzione, però permette di ottenere immagini 3D perchè scansiona il preparato senza trapassarlo
Fasi preparazione campione (4)
fissazione
inclusione
sezionamento
colorazione
Fissazione
- serve a conservare il campione
- si usa alcol etilico alcol metilico formaldeide e glutaraldeide
- oppure congelamento rapido (deve essere fatto in fretta se no si formano cristalli che danneggiano la struttura
Inclusione
-serve a dare uno spessore sufficiente al campione per essere sezionato
- si toglie l’acqua grazie ad alcol etilico e xilolo
- si include la paraffina (cera) dà spessore
- nel caso di congelamento questo si salta
Sezionamento
-si taglia il campione con:
- microtomo con tecnica standard
- criostato con congelamento rapido
-ultramicrotomo se il preparato è destinato al TEM
Colorazione
- si tratta il preparato con xilolo e alcol etilico per togliere lo strato di paraffina perchè idrofoba e lo si reidrata
- poi lo si colora con coloranti basici o acidi
Coloranti basici
EMATOSSILINA (blu)
-colora molecole acide come il DNA
Coloranti acidi
EOSINA (rosa-rosso)
- colora molecole basiche come le proteine
colori lipidi
coloranti liposolubili
BLU NILO, SUDAN III
colori carboidrati
-reazione acido periodico - Schiff (LEUCOFUCSINA che è fucsia)
- metodo al carminio di Best per il glicogeno
colori proteine
- reazione di Millon
colori enzimi
reazioni per i prodotti degli enzimi
colori acidi nucleici
-coloranti basici come il BLU DI METILENE
- miscela verde di METILE-PIRONINA
come colora la metile pironina il dna e l’rna?
DNA=VERDE
RNA= ROSSO
immunoistochimica
si usa per strutture proteiche simili tra loro
si usano anticorpi che si legano ad antigeni specifici e si visualizzano grazie a fluorocromi molecole che si legano agli anticorpi senza danneggiarli e visibili quando colpiti da luce dello spettro visibile
citometria a flusso
- si usa il citometro a flusso che usa un fascio laser che attraversa la cellula e definisce i parametri morfologici
- quelli più complessi possono fare anche il sorting
sorting
separazione fisica di cellule postive a un certo antigene da quelle negative
coltura in vitro
serve a mantener in vita cellule o frammenti di tessuti al di fuori dell’organismo di origine grazie a un incubazione in mezzi nutritizi adeguati e condizioni ottimali di ph e temperatura e schermati da possibili contaminazioni batteriche
FRET
determina se la distanza tra 2 molecole è inferiore alla soglia di possibilità di comunicazione tra 2 cellule cioè di 10 nm
CRIOFRATTURA
tecnica di studio che permette di suddividere il doppio strato lipidico della membrana: si procede con rapido congelamento e poi forte colpo grazie a lama di diamanti
